Dna rekombinan

1. 1. DNA Rekombinan BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Kemajuan dibidang teknologi

saat ini sudah berkembang sangat pesat, banyak penemuan baru tentang biologi molekular,
diantaranya yaitu adanya sistem kloning. Sistem kloning itu sendiri merupakan suatu proses
menghasilkan individu-individu dari jenis yang sama identik secara genetik. Pada hewan
atau tumbuhan tertentu pengkloningan terbentuk secara alami yaitu kebiasaan proses
hewan atau tumbuhan bereproduksi aseksual. Sedangkan dalam bioteknologi, kloning
merujuk pada berbagai usaha yang dilakukan manusia untuk menghasilkan salinan berkas
DNA atau gen, sel atau organisme. Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan tersebut,
muncullah ilmu yang mempelajari mengenai pembentukan kombinasi materi genetik yang
baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan dalam suatu sel
organisme lain yang berperan sebagai sel inang yang dikenal sebagai teknologi DNA
rekombinan atau biasa disebut rekayasa genetika. Teknologi ini memungkinkannya
diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih
besar daripada produksi secara konvensional serta memadukan sifat dari dua jenis
organisme yang berbeda (organisme transgenik) dan lain-lain. Untuk lebih jelas mengenai
DNA rekombinan, akan di bahas pada pembahasan makalah ini. B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut :
1. Apakah yang dimaksud DNA rekombinan ? 2. Bagaimanakah teknik/tahapan teknologi
DNA rekombinan ? 3. Apakah manfaat dari teknologi DNA rekombinan ? C. Tujuan Tujuan
dari penulisan makalah ini adalah sebagai berikut : 1. Untuk mengetahui pengertian dari
DNA rekombinan. 2. Untuk mengetahui teknik yang digunakan dalam teknologi DNA
rekombinan 3. Untuk mengetahui manfaat dari teknologi DNA rekombinan. D. Manfaat
Manfaat dari penulisan makalah ini adalah sebagai berikut : 1. Bagi mahasiswa dapat
melatih keterampilan dan kemampuan dalam membuat karya tulis ilmiah 2. Bagi pembaca
dapat menambah sumber informasi tentang teknologi DNA rekombinan
2. 2. BAB II PEMBAHASAN A. Definisi DNA Rekombinan Menurut Cohen dan Boyer (1980:
DNA rekombinan (rDNA) adalah bentuk DNA buatan yang dibuat dengan menggabungkan
dua atau lebih sekuens yang tidak akan biasanya terjadi bersama-sama. Dalam hal
modifikasi genetik, itu adalah diciptakan melalui pengenalan DNA yang relevan ke dalam
DNA organisme yang ada, seperti plasmid bakteri, untuk kode untuk atau mengubah sifat
berbeda untuk tujuan tertentu, seperti resistensi antibiotik (News Medical.Net) Robert (2009)
mengatakan bahwa DNA rekombinan adalah DNA yang mengalami perubahan karena
penyisipan suatu sekuens deuksinukleotida yang sebelumnya tidak terdapat dalam molekul
DNA yang sudah ada dengan cara enzimatik atau kimiawi. Rekayasa genetika adalah
serangkaian teknik untuk memodifikasi dan merekomendasi gen dari berbagai organisme
yang berbeda yang juga disebut teknologi DNA rekombinan. Teknologi yang dikenal sebagai
teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini
melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya
sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk
mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang
mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah
pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke
dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami
perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Rekayasa
genetika dapat memberikan hasil yang sangat menguntungkan. Sebagai contoh pasien yang
menderita diabetes tidak mampu membentuk hormon insulin untuk mengatur kadar gula
dalam darah. Oleh karena itu, pasien membutuhkan suntikan insulin sebagai tambahan.
Dengan teknik rekayasa genetika, para peneliti berhasil memaksa
3. 3. mikroorganisme (bakteri) untuk membentuk insulin yang mirip dengan insulin manusia
(suryo, 2001). B. Teknologi DNA Rekombinan Teknologi DNA rekombinan merupakan teknik
kejuruteraan genetik yang melibatkan penggunaan DNA rekombinan - yaitu DNA yang
menggabungkan maklumat genetik dua species organisme yang berlainan. Jika gen-gen ini
digabungkan dalam sel telur atau sel sperma supaya maklumat genetik ini boleh diturunkan
kepada progeni, maka hasil daripada gabungan ini dinamakan organisme transgenik.
Penghasilan DNA rekombinan melibatkan tiga proses: 1. Manipulasi DNA in vitro (luar sel
organisma) 2. Gabungan, atau rekombinasi DNA sesuatu organisma dengan DNA bakteria
dalam plasmid atau bakteriofak 3. Pengklonan, atau teknik untuk mereplikasi progeni yang
membawa DNA rekombinan. Proses-proses diatas pertama kali dilakukan oleh Paul Berg
dan A.D. Kaiser pada tahun 1972. Mereka berjaya memasukkan DNA prokariot kedalam
bakteria, kemudian oleh S.N. Cohen dan Herbert Boyer yang berjaya menggabungkan DNA
organisme eukariot bersama plasmid bakteria. Komponen yang digunakan dalam teknik
DNA rekombinan diantaranya enzim restriksi untuk memotong DNA, enzim ligase untuk
menyambung DNA dan vektor untuk menyambung dan mengklonkan gen di dalam sel
hidup, transposon sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan
penanda, pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan,
enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan RNA, pelacak DNA atau RNA
untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang
benar. Vektor yang sering digunakan diantarnya plasmid, kosmid dan bakteriofag. Enzim
restriksi, digunakan untuk memotong DNA. Enzim restriksi mengenal dan memotong DNA
pada sekuens spesifik yang panjangnya empat sampai enam pasang basa. Enzim tersebut
dikenal dengan nama enzim endonuklease restriksi. Ada dua bagian terpenting yang selalu
digunakan dalam rekayasa genetika yaitu sebagai berikut : 1. Enzim seluler/Cellular
Enzymes Enzim yang dipakai dalam memanipulasi DNA diantaranya adalah : a. enzim
Endonuklease, yaitu enzim yang mengenali batas-batas sekuen nukleotida spesifik dan
berfungsi dalam proses restriction atau pemotongan bahan-bahan genetik. Penggunaan
enzim
4. 4. ini yang paling umum antara lain pada sekuen palindromik. Enzim ini dibentuk dari bakteri
yang dibuat sedemikian rupa sehingga dapat menahan penyusupan DNA, seperti genom
bacteriophage. b. DNA polimerisasi, yaitu enzim yang biasa dipakai untuk meng-copy DNA.
Enzim ini mengsintesis DNA dari sel induknya dan membentuk DNA yang sama persis ke
sel induk barunya. Enzim ini juga bisa didapatkan dari berbagai jenis organisme, yang tidak
mengherankan, karena semua organisme pasti harus meng-copy DNA mereka. c. RNA
polimerisasi yaitu enzim yang berfungsi untuk ’membaca sekuen DNA dan mengsintesis
molekul RNA komplementer. Seperti halnya DNA polimerisasi, RNA polimerisasi juga
banyak ditemukan di banyak organisme karena semua organisme harus ’merekam’ gen
mereka. d. DNA ligase merupakan suatu enzim yang berfungsi untuk menyambungkan
suatu bahan genetik dengan bahan genetik yang lain. Contohnya saja, enzim DNA ligase ini
dapat bergabung dengan DNA atau RNA dan membentuk ikatan phosphodiester baru antara
DNA atau RNA yang satu dengan lainnya. e. Reverse transcriptases adalah enzim yang
berfungsi membentuk blue-print dari molekul RNA membentuk cDNA (DNA komplementer).
Enzim ini dibuat dari virus RNA yang mengubah genom RNA mereka menjadi DNA ketika
mereka menginfeksi inangnya. Enzim ini biasa dipakai ketika bertemu dengan gen eukariotik
yang biasanya terpisah-pisah menjadi potongan kecil dan dipisahkan oleh introns dalam
kromosom. 2. Vektor natural/ Natural Vectors Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi
DNA di luar sel, para ilmuwan dalam bioteknologi harus bisa membuat suatu tempat yang
keadaannya stabil dan cocok dengan tempat DNA yang dimanipulasi. Sekali lagi, alam telah
memberikan solusi dari masalah ini. Vektor disini bisa diartikan sebagai alat yang membawa
DNA ke dalam sel induk barunya. Agar suatu metode dalam rekayasa genetika dianggap
berhasil, di dalam vektor, DNA hasil rekombinan seharusnya benar-benar hanya dibawa
setelah sebelumnya DNA rekombinan digabungkan dengan DNA vektor melalui enzim
ligase. Namun di dalam vektor, DNA rekombinan tidak termutasi lagi membentuk DNA
 dengan sifat baru. Contoh dari vektor natural dari alam adalah plasmid dan virus atau
bacteriophage (Witarto, 2005). Adapun teknik pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai
berikut: 1. Teknik mengisolasi DNA 2. Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim
retriksi endonuklease 3. Teknik menggabung/ menyambung DNA dengan menggunakan
enzim ligase
5. 5. 4. Teknik memasukkan DNA kedalam sel hidup (vektor) 5. Vektor berkembang dengan
seleksi DNA yang direkayasa. Gambar 1: mekanisme DNA Rekombinan 1. Isolasi DNA yang
diawali dengan melakukan perusakan serta penghilangan dinding sel. Dalam proses ini
dapat dilakukan secara mekanis ataupun dengan cara enzimatis. Setelah perusakan sel
telah dilakukan, langkah selanjutnya adalah pelisisan sel hal ini dapat dilakukan dengan
menggunakan buffer nonosmotik, serta deterjen yang kuat seperti triton X- 100 atau dengan
sodium dodesil sulfat (SDS). Remukan sel yang diakibatkan oleh lisisnya sel dibuang
dengan melakukan sentrifugasi sehingga bias dibedakan antara bagian yang rusak serta
organel target yang pada akhirnya didapatlkan DNA yang nantinya dilakukan pemurnian
dengan penambahan amonium asetat dan alcohol. 2. Pemotongan molekul DNA, baik
genomik maupun plasmid dilakukan dengan enzim restriksi. Ada dua macam enzim restriksi
yaieu enzim restriksi tipe I dan enzim restriksi tipe II. Enzim restriksi tipe II mempunyai sifat-
sifat umum yang penting sebagai berikut: a. mengenali urutan tertentu sepanjang empat
hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA. b. memotong kedua untai molekul DNA di
tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya. c. menghasilkan fragmen-
fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa. Berdasarkan tempat hasil
pemotongan, fragmen-fragmen DNA memiliki dua macam ujung yaitu: Ujung lengket (sticky
end) atau ujung kohesif, terjadi jika tempat pemotongan pada kedua untai DNA terpisah
sejauh beberapa pasang basa, sehingga menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’
yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua
fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain. Ujung
tumpul (blunt end), terjadi jika tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua
fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-
masing untai tunggalnya sama panjangnya. Penyatuan dua fragmen DNA ujung tumpul sulit
dilakukan sehingga memerlukan perlakuan tambahan, misalnya pemberian molekul linker,
molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase. 3. Tahap
selanjutnya adalah penyambungan molekul DNA. Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk
meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA
ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah
diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Ketiga yaitu
pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal
homopolimerik 3’. Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi,
pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket
akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan
tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan
waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam). 4. Setelah tahap
penyambungan molekul DNA, dilakukan analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik
dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan
teknik elektroforesis. Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen- fragmen DNA
genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA
rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak
dengan cepat. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang dinamakan
transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah
dimasuki molekul DNA rekombinan.
6. 6. 5. Tahap selanjutnya adalah seleksi transforman dan seleksi rekombinan. Oleh karena
DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus
melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan.
Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus
 dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen
sisipan atau gen yang diinginkan. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi
setelah transformasi dilakukan, yaitu: 1. Sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti
transformasi gagal. 2. Sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan 3. Sel
inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari
fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan
secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain
reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara
yang dinamakan hibridisasi koloni (Tjahjoleksono, 2009). Transfer DNA atau perpindahan
DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu: 1. Transformasi : transfer DNA yang
umumnya berasal dari satu sel bakteri ke dalam sel yang berbeda. Prosesnya adalah ketika
sebuah sel bakteri pecah atau lisis maka DNA sirkular akan terlepas ke lingkungan. Efisiensi
transformasi bergantung pada kompetensi sel. 2. Konjugasi : merupakan pemindahan materi
genetik berupa plasmid secara langsung melalui kontak sel dengan membentuk struktur
seperti jembatan diantara dua sel bakteri yang berdekatan. Umumnya terjadi pada bakteri
gram negatif. 3. Transduksi : transfer materi genetik dari satu bakteri ke bakteri lainnya
dengan menggunakan virus bakteri sebagai vektor. Transfer ini menggunakan prinsip dasar
dari galur donor yang menyediakan DNA bagi galur resipien. Perbedaan utamanya dengan
transfer DNA lainnya adalah DNA ditransfer melalui perantaraan bakteriofag. C. Manfaat
Teknologi DNA Rekombinan Berbagai penelitian tentang DNA rekombinan banyak gunakan
dan dimanfaatkan dalam berbagai bidang, diantaranya : 1. Bidang industri Penelitian
rekayasa genetika di bidang industry sedang meningkat dengan cepat. Berbagai usaha yang
telah giat dilakukan misalnya : 1. Menciptakan bakteri yang dapat melarutkan logam-logam
langsung dari dalam bumi 2. Menciptakan bakteri yang dapat menghasilkan bahan kimia
Mencipatkan bakteri yang dapat menghasilkan bahan mentah kimia seperti etilen yang
diperlukan untuk pembuatan plastic 2. Bidang Pertanian Beberapa manfaat rekayasa
genetika dalam bidang pertanian diantaranya adalah: 1. Mengganti pemakaian pupuk
nitrogen yang banyak dipergunakan tapi mahal harganya, oleh fiksasi nitrogen secara
alamiah. Bakteri tanah Rhizobium sp dapat mengadakan infeksi ke dalam akar dari tanaman
family Leguminosae. Infeksi ini menghasilkan bintil akar dan bakteri yang terdapat di
dalamnya dapat mengikat zat lemas bebas dari udara untuk di ubahnya menjadi nitrogen
yang dapat diambil dan digunakan oleh tanaman tersebut. 2. Teknik rekayasa genetika
mengusahakan tanaman-tanaman (terutama yang mempunyai arti ekonomi) yang tidak
begitu pekah terhadap penyakit yang disebabkan oleh bakteri, jamur dan cacing. 3.
Mengusahakan tanaman-tanaman yang mampu menghasilkan peptisida sendiri. 3. Bidang
Peternakan
7. 7. 1. Telah diperoleh vaksin-vaksin untuk melawan penyakit mencret ganas yang dapat
mematikan anak-anak babi 2. Sudah dipasarkan vaksin yang efektif terhadap penyakit kuku
dan mulut, yaitu penyakit ganas dan sangat menular pada sapi, domba, kambing, rusa dan
babi 4. Bidang Kedokteran Gen-gen bagi beberapa protein yang dibutuhkan dalam bidang
kedokteran yang dibutuhkan dalam bidang kedokteran yaitu pembuatan insulin manusia oleh
bakteri Eschrechia coli untuk pengobatan penyakit diabetes (Wikipedia.org). BAB III
PENUTUP A. Kesimpulan Berdasarkan pembahasan pada makalah ini maka dapat ditarik
beberapa kesimpulan sebagai berikut : 1. DNA rekombinan adalah DNA yang mengalami
perubahan karena penyisipan suatu sekuens deuksinukleotida yang sebelumnya tidak
terdapat dalam molekul DNA yang sudah ada dengan cara enzimatik atau kimiawi. 2.
Komponen yang terlibat dalam Dna rekombinasi yaitu Enzim restriksi untuk memotong DNA,
DNA polymerase, enzim ligase, enzim DNA ligase, Vektor untuk menyambung dan
mengklonkan gen di dalam sel hidup, Transposon, Pustaka genom, Enzim transkripsi balik,
Pelacak DNA atau RNA 3. Tahapan-tahapan teknologi DNA rekombinan adalah isolasi DNA
kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan
berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk
 menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA
rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA
rekombinan. B. Saran Makalah ini masih jauh dari kesempurnaannya dan informasinya pun
terbatas. Oleh karena itu, penyusun menyarankan agar pembaca mencari literature lain
yang membahas mengenai judul dari makalah ini. DAFTAR PUSTAKA Anshori. DNA
Rekombinan. (online) Tersedia http://anshori.comuv.com/ DNA_Rekombinan.html. (Tanggal
16 November 2012). Ilham. 2009. DNA rekombinan. (online). Tersedia http://ilham-
gantz.blogspot.com/2009/03/dna- rekombinan.html. (Tanggal 16 November 2012.) News
Medical., 2012. DNA Rekombinan. Tersedia http://www.news-
medical.net/health/Recombinant- DNA-What-is-Recombinant-DNA-%28Indonesian
%29.aspx. (Tanggal 16 November 2012).
8. 8. Tjahjoleksono, Aris., 2009. DNA Rekombinan. (Online) Tersedia http://web.ipb.ac.id/-
tpb/files/materi/genetika/dna/rekombinan.htm Rifa’I, Muhaimin PhD.Med.Sc. 2010. Genetika
Rekombinasi dan Populasi. Galaxy Science. Malang. Satriani. 2011. DNA rekombinan.
(online) Tersedia http://satriani09ngeblog. blogspot.com/2011/12/dna-rekombinan.html
(Tanggal 16 November 2012). Wikipedia. 2011. Recombinant DNA. (Online) Tersedia
http://en.wikipedia.org/wiki/Recombinant_DNA (Tanggal 16 November 2012). Wikipedia.
2011. Teknologi DNA rekombinan. (Online) Tersedia
http://ms.wikipedia.org/wiki/Teknologi_DNA_rekombinan. (Tanggal 16 November 2012).
Witarto, A.B., 2005. Inspirator Kemajuan Iptek. Pusat Penelitian Bioteknologi – LIPI. (Online)
Tersedia http://www.beritaiptek.com/zberita-beritaiptek-2005 (Tanggal 16 November 2012)

1. Defenisi Kloning• Cloning pengertian secara sederhana nya adalah cangkok; yaitu
penggabungan unsur- unsur hayati dua atau lebih untuk memperoleh manfaat tertentu• Klon
berasal dari kata klόόn (yunani), yang artinya tunas.Kloning adalah tindakan menggandakan
atau mendapatkan keturunan jasad hidup tanpa fertilisasi, berasal dari induk yang sama,
mempunyai susunan (jumlah dan gen) yang sama dan kemungkinan besar mempunyai
fenotib yang sama.
2. 3. Tujuan§ Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut Menganalisis atau
mengidentifikasi urutan basa nukleotidapengendali gen tersebut Mempelajari fungsi RNA /
protein/enzim yang disandi gentersebut Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan
genyang mengakibatkan penyakit bawaan Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu,
misalnyamemproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.
3. 4. Bagian terpenting yang selalu digunakan dalam rekayasa genetika1. Enzym SellulerAda
beberapa enzim yang dipakai dalammemanipulasi DNA, diantaranya adalah :- RNA
polimerisasi yang berfungsi untuk ’membaca’ sekuen DNA dan mengsintesis molekul RNA
komplementer.
4. 5. - Enzim Endonuklease, yait u enzim yang mengenali batas- batas sekuen nukleotida
spesifik dan berfungsi dalam proses restriction.
5. 6. - DNA polimerisasi, y aitu enzim yang biasa dipakai untuk meng-copy DNA. Enzim ini
mengsintesis DNA dari sel induknya dan membentuk DNA yang sama persis ke sel induk
barunya.
6. 7. - Enzim DNA ligase merupakan suatu enzim yang berfungsi untuk menyambungkan suatu
bahan genetik dengan bahan genetik yang lain. Contohnya saja, enzim DNA ligase ini dapat
 bergabung dengan DNA (atau RNA) dan membentuk ikatan phosphodiester baru antara
DNA (atau RNA) yang satu dengan lainnya.
7. 8. - enzim reverse transcriptases yang berfungsi membentuk blue-print dari molekul RNA
membentuk cDNA (DNA komplementer). Enzim ini dibuat dari virus RNA yang mengubah
genom RNA menjadi DNA ketika menginfeksi inangnya
8. 9. 2. Natural Vector/ Vector Alami Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi DNA di luar
sel, para ilmuwan bioteknologi harus bisa membuat suatu tempat yang keadaannya stabil
dan cocok dengan tempat DNA yang dimanipulasi. Vektor disini bisa diartikan sebagai alat
yang membawa DNA ke dalam sel induk barunya serta dapat mengadakan replikasi untuk
menghasilkan kopi dalam jumlah besar. Dua jenis molekul DNA alamiah yang memenuhi
persyaratan tersebut adalah :
9. 10. a. Plasmid Plasmid, merupakanmolekul DNA sirkuler yangterdapat dalam bakteridan
berbagai organismelain.Plasmid dapat melakukanreplikasi dengan tidaktergantung pada
kromosomsel tuan rumah.
10. 11. “KROMOMOSOM”
11. 12. b. Kromosom VirusKromosom virus, terutamabakteriofage, yaitu virusyang harus
menginfeksibakteri pada waktu infeksimolekul DNA bakteriofagediinfeksikan ke dalam
seltuan rumah, dankemudianDNA ini mengalamireplikasi.
12. 13. The Process Of Cloning
13. 14. 1.Isolasi DNA• Isolasi DNA diawali dengan mempersiapkan dua jenis DNA yaitu plasmid
bakteri yang akan digunakan sebagai vektor dan DNA yang mengandung gen yang
diinginkan.• Kemudian dilakukan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, langkah
selanjutnya adalah lisis sel Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus
dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi.
14. 15. 2. Pemotongan Molekul DNA • Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan
molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA
berawal dari saat ditemukannya enzim restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli,
yang berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag (faga temperat) yang akan
menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai
tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing
akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut
sebagai ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif.
15. 16. 3.Ligasi molekul–molekul DNA• Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor
menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel.
Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi)
dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.
16. 17. 4.Transformasi Sel Inang Tahap berikutnya menggunakan teknik elektroforesis untuk
menganalisis hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor. Jika hasil elektroforesis
menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA
vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, selain terdapat molekul DNA
rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi
satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini
dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat
tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
17. 18. 5.Pengklonaan sel dan gen asing• Bakteri hasil transformasi ditempatkan pada medium
nutrient padat yang mengandung amphisilin dan gula yang disebut X-gal. Amphisilin dalam
medium yang akan memastikan bahwa hanya bakteri yang mengandung plasmid yang
dapat tumbuh. Sedangkan X-gal akan memudahkan identifikasi koloni bakteri yang
mengandung gen asing yang disisipkan
18. 19. 6. Identifikasi klon sel yang membawagen yang diinginkan• Setelah tumbuh membentuk
koloni, bakteri yang mengandung DNA rekombinan diidentifikasi menggunakan metode
hibridisasi asam nukleat. Untuk mengkarakterisasi atau mengidentifikasi DNA target, maka
 pada membran ditambahkan molekul DNA dan RNA untai tunggal yang disebut probe dan
didalam larutan buffer. Setelah mengidentifikasi klon sel yang diinginkan, kemudian
ditumbuhkan dalam kultur cair dalam tangki besar dan selanjutnya dengan mudah
mengisolasi gen tersebut dalam jumlah besar.
19. 20. Terdapat beberapa metode yang dapat digunakan dalam pengklonaan sel,
diantaranya:1. PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR adalah suatu metode untuk
mengamplifikasi/disalin beberapa kali sekuens gen (urutan DNA) target secara eksponensial
in vitro. “ Prinsip dasar dari teknik PCR tersebut merupakan adanya enzim DNA polimerase
yang digunakan untuk membuat cetakan dari segmen DNA yang diinginkan “
20. 21. Proses PCR terdiri dari 3 tahapan, yaitu:1. Denaturasi adalah proses penguraian materi
genetik (DNA/RNA) dari bentuk heliksnya yang dipisahkan dengan suhu 90-96oC.
21. 22. 2. Annealing (pelekatan) atau hibridisasi adalah suatu proses penempelan primer ke
DNA template yang sekarang hanya dalam satu untai.3. Polimerisasi (sintesis) adalah suatu
proses pemanjangan rantai DNA baru yang dimulai dari primer
22. 23. 2. Elekroforesis Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau
pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Elektroforesis adalah
suatu teknik yang menggunakan medan listrik untuk memisahkan molekul berdasarkan
ukuran. Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA
23. 24. 3. Sekuens DNAPenentuan urutan (sekuensing) basa DNApada prinsipnya melibatkan
produksiseperangkat molekul/fragmen DNA yangberbeda-beda ukurannya tetapi salah
satuujungnya selalu sama. Selanjutnya, fragmen-fragmen ini
dimigrasikan/dipisahkanmenggunakan elektroforesis gel poliakrilamidatau polyacrylamide
gel electrophoresis(PAGE) agar pembacaan sekuens dapatdilakukan.
24. 25. Isolation and cloning of IGF-1R gene in bovine
25. 26. AbstractWe isolated and cloned the IGF-1 R gene from DNA bysubjecting DNA with one
pair of restriction enzyme (EcoRI +HindIII) and followed by ligation and transformation with
thesuitable vector. The pair of restriction enzymes (EcoRI + HindIII)which subjected to DNA
template before the ligation processwas the only pair which had success to liberate IGF-
1Rfragment from the transformed vector rather than other two pairsof restriction enzymes
(EcoRI + XhoI) or (HindIII + XhoI)although this two pair of restriction enzymes have
recognitionsites in the vector. Moreover we have studied the effect of DNAtemplate size on
the action of the restriction enzymes. Whereless DNA size, more efficient of the restriction
enzyme action.This study is rapid and useful new technology forisolation, cloning and
sequencing the gene of interest to beready for further investigations as gene transfection
and/ ortransfer.
26. 27. Primer dari gen IGF-1R : Primer sequence (5 to 3) (Left:
CCTGCGCAATGGAATAAAGTand Right: ATTGGGTTGGAAGACTGCTG(SEQUENCE
SIZE: 556 bp DNA linear and accession number U33122).Reagen :Enzim yang digunakan
:Bakteri yang digunakan :Plasmid : PMD18TBuffer yang digunakan :
27. 28. 1. Rapid Isolation mammalian DNA (20-50 kb) Bovine Blood Ekstraksi DNA 300 µL
aliquots of bovine blood + 900 µL of 20 mM tris HCl, mix. -Incubated at 250C for 10 min -
Centrifuge 20 s Supernatant + 3 µL protinase K + 3 µL of 4 mg/ml Dnase-free Rnase -
Incubate for 1 hours at 370C + 200 µL CH3COOK solution mix for 20 s - Centrifuge for 3 min
at 40C -Transfer to fresh tube + 600 µL of 70% ethanol - Mix well DNA precipitate -
Centrifuge at 100 rpm for 1 min at 250C Pellet of DNA in 100µL of TE (pH 7.6) - Stored at
200C - Anallyzed
28. 29. 2. Salting Out Method (≥100 kb DNA) DNA + 10 mL pellet dissolved in EDTA + cell lysis
buffer TE centrifugation at 10000 rpm for 15 min at 40C + NaCl solution - Incubating -
Centrifuge Supernatant - Dissolved in ice cold absolute ethanol - Centrifuge DNA in 200 µL
TE - Stored at 200C - Anallyzed
29. 30. 3. DNA digestion and PCR program 10 µL DNA -Incubated with 0.75 µL EcoR -
Incubated 0.75 µL Hindlll, 2 µL , 2 µL buffers of 2 enzyms - 1.5 µL dd water at 320C for 3 h -
 Anallyzed with PCR program DNA sequencing - Take 25 µL PCR product in an eppendorf
tube + 25 ng of genomic DNA - Denaturation with Parkin Elmer 9700 cetus thermal, carried
out. - cooled the sample 40C Amplified DNA fragments - Separated DNA +2% agarose gel +
ethidium bromida as stained DNA patern - Visualized on a UV transiluminator
30. 31. 4. Cloning of IGF-1R PCR product - 25 µL PCR product in mixture (+ use ice box, 1 µL
PMD18-T vector, + 1.5 µL DNA fragments, + 3.5 µL dd water + 5 µL solution (ligation
mixture) - Incubated at 160C least 1 h - Transformation for the ligated gene occurred by
using LB medium for overnight followed by plasmid extraction Transformation ligated gene -
Define the main pair of restriction enzymes which can liberate our gene of interest - Divided
the extract plasmid into three groups according type of restriction enzymes EcoRI + Hindlll
EcoRI + XhoI Hindlll + XhoI - Carried out all tubes
31. 32. 5. Sequencing of both IGF-1R fragment and sequence analysis Isolate our gene of
interest from the plasmid - Choose the plasmid which have IGF-1R gene - Sent the
sequencer - Compare with the gene bank
32. 33. RESULTShowing the DNA after randomdigestion with the restrictionenzymes (EcoRI and
Hindlll) lanes 1and 2 are small DNA (20-20 kb) andlane 3 is large DNA (≥100kb) and M
is5000 bp marker
33. 34. PembahasanSistem Insulin-like growth factor (IGF), terdiri dari :1. dua faktor
pertumbuhan yaitu - IGF-I - IGF-II2. dua IGF penerima IGF-1R dan manose IGF-2R/cation-
independent 6-fosfat reseptor, M6P-R dan enam IGF mengikat protein (IGFBP1-6), telah
ditandai sebagai sistem regulator penting untuk mengendalikan pertumbuhan jaringan dan
pembangunan spesies vertebrata untuk merangsang produksi embrio IFN-invitro dan
kemungkinan bahwa IGF-I dan II-memainkan peran penting dalam pengembangan embrio
dan rahim selama awal kehamilan.
34. 35. • Pengaruh ukuran DNA dan tindakan pada proses kloning. Ditemukan bahwa ukuran
kecil DNA (20 - 50 kb) mudah dicerna, terisolasi dan kloning untuk member kita fragmen
IGF-1 R murni dari ukuran besar ( ≥100 kb DNA) (Gambar 1, 2 dan 3). Selain itu, kami
mempelajari efek dari pembatasan jenis enzim dan perannya dalam kloning. Pasangan dari
pembatasan enzim (EcoRI dan HindIII) yang digunakan untuk menggali-estion acak
template DNA sebelum proses ligasi dan trans-formasi adalah sepasang satunya
pembatasan enzim yang membebaskan fragmen IGF-1R setelah ligasi dan transformasi
dengan vektor yang sesuai
35. 36. • Identifikasi dilakukan dengan teknik kloning molekuler dan sequencing, sebagian dari
gen IGF-I sapi Kon-ponding ke daerah pengkode dan seluruh sequencing. Hasilnya
menunjukkan homologi yang tinggi (> 95%) dengan yang di bank gen (556 bp DNA linier dan
nomor aksesi U33122).
36. 37. Dampak Positif dan Negatif KloningDampak Positif  Dampak Negatif  • Jika tanaman
induk • Kloning pada tanaman akan mempunyai sifat-sifat menghasilkan keturunan yang
unggul, maka dapat dipastikan keturunannya akan sama dengan mempunyai sifat unggul
dari induknya, akibatnya akan induknya. menurunkan keanekaragaman • Konservasi
tumbuhan langka tanaman. • Meningkatkan agrobisnis • Kloning pada hewan dan • Terapi
kloning manusia masih banyak ex : untuk penderita gagal dipertentangkan. ginjal ex : resiko
kesehatan pada • Mempermudah penyediaan hasil clone organ tubuh untuk di •
Bertentangan dengan nilai cangkokan. kemanusiaan.
37. 38. What is the application of Genetic Engineering??• Bidang Pertanian dan Peternakan •
Bidang Farmasi dan dimanfaatkan terutama Industri untuk memberikan terbukti mampu
karakter atau sifat baru menghasilkan berbagai pada berbagai jenis jenis obat dengan
kualitas tanaman. yang lebih baik• Bidang • Lingkungan Perkebunan, Kehutanan, • Bidang
Hukum dan dan Florikultur Forensik merupakan ilmu yang mempelajari bagaimana cara
budidaya bunga
2. Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu: 1.
Transformasi : transfer DNA yang umumnya berasal dari satu sel bakteri ke dalam sel yang
berbeda. Prosesnya adalah ketika sebuah sel bakteri pecah atau lisis maka DNA sirkular akan
terlepas ke lingkungan. Efisiensi transformasi bergantung pada kompetensi sel. 2. Konjugasi :
merupakan pemindahan materi genetik berupa plasmid secara langsung melalui kontak sel dengan
membentuk struktur seperti jembatan diantara dua sel bakteri yang berdekatan. Umumnya terjadi
pada bakteri gram negatif. 3. Transduksi : transfer materi genetik dari satu bakteri ke bakteri lainnya
dengan menggunakan virus bakteri sebagai vektor. Transfer ini menggunakan prinsip dasar dari
galur donor yang menyediakan DNA bagi galur resipien. Perbedaan utamanya dengan transfer DNA
lainnya adalah DNA ditransfer melalui perantaraan bakteriofag

3.

1. 1. BIOTEKNOLOGI MOLEKULER “KLONING GEN” JURUSAN KIMIA FAKULTAS

MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HALU OLEO KENDARI
2016 JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALU OLEO KENDARI 2016 OLEH : ANNITHA BARKAH F1C1 13 010
JESSI F1C1 13 052 SARJUNA F1C1 13 050 WA ODE IRMA KEMALASARI F1C1 13 078
OLEH : ANNITHA BARKAH F1C1 13 010 JESSI F1C1 13 052 SARJUNA F1C1 13 050 WA
ODE IRMA KEMALASARI F1C1 13 078
2. 2. Pokok Bahasan Pengertian Kloning Gen Sejarah Kloning Gen Jenis- jenis Kloning Gen
Alat-alat yang Digunakan 11 22 33 44 Komponen Kloning Gen55 Tahap-tahap Kloning
Gen66 Aplikasi Kloning Gen77 Tinjauan Bioetika Kloning88 Kelebihan dan Kekurangan
Kloning Gen 99
3. 3. Kloning Gen Kloning merupakan proses perbanyakan fragmen gen target dengan
mengintroduksi DNA rekombinan ke dalam suatu sel inang (Broker, 2005). Teknologi kloning
adalah suatu cara reproduksi yang menggunakan teknik tingkat tinggi di bidang rekayasa
genetika untuk menciptakan makhluk hidup tanpa melalui perkawinan. Teknik reproduksi ini
menjadi terkenal sejak penemuan domba Dolly.
4. 4. Sejarah Kloning Gen 1997 1952 1903 Muncul suatu istilah untuk sekelompok makhluk
hidup yang dilahirkan tanpa proses seksual dari satu induk (Herbert Webber) Willmut dan
Champbell, telah sukses melakukan kloning seekor domba dewasa yang menghasilkan
seekor anak domba diberi nama Dolly. Bricks dan Young melakukan penyelidikan tentang
kloning terhadap katak dengan cara memasukkan nukleus yang sedang mengalami proses
perpisahan ke dalam sel normal.
5. 5. 1 Kloning Embrional 2 Kloning DNA Dewasa 3 Kloning Terapeutik Jenis-Jenis Kloning
Teknik yang dilakukan untuk memperoleh kembar identik, meniru apa yang terjadi secara
alamiah Rekayasa genetis untuk memperoleh duplikat dari seorang individu yang sudah
 dewasa. Rekayasa genetis untuk memperoleh sel, jaringan atau organ dari satu individu
tertentu untuk tujuan pengobatan atau perbaikan kesehatan
6. 6. Alat-alat yang Digunakan Sentrifuge Mortar dan Pastle Elektroforesis
7. 7. Komponen Kloning Gen DNA Sisipan DNA Vektor Enzim Restriksi Enzim Ligase Sel
Inang Berfungsi untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang sudah di klon Digunakan
untuk menyambung DNA Digunakan sebagai gen yang akan diperbanyak Berfungsi sebagai
wadah DNA sisipan Digunakan untuk memotong DNA
8. 8. DNA Sisipan DNA vektor Merupakan fragmen DNA (gen) yang akan di kloning DNA
sisipan bisa diperoleh dengan dua cara, yaitu : 1. Produk PCR. 2. Fragmen DNA hasil
pemotongan dengan enzim restriksi Vektor merupakan suatu mulekul DNA sirkular yang
bertindak sebagai wadah untuk membawa DNA sisipan masuk ke dalam sel inang dan
bertanggung jawab atas replikasinya. Syarat suatu vektor adalah : (1)Dapat dipotong
dengan enzim restriksi (2)Mampu memasuki sel inang, (3)Bereplikasi sendiri (memiliki ori),
(4)Menghasilkan jumlah copy yang banyak dan (5)Mempunyai ukuran yang relatif kecil (< 10
kb) Komponen Kloning Gen
9. 9. Plasmid Merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkular dan terdapat bebas di
dalam sel. Plasmid dapat bereplikasi sendiri di dalam sel inang karena mempunyai suatu
urutan DNA spesifik yang disebut ori (origin of replication/ titik awal replikasi). Komponen
Kloning Gen Plasmid memilki ciri-ciri antara lain : a. Berbentuk lingkaran tertutup dan
untaiannya ganda (double stranded) b. Dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom
inti c. Terdapat di luar kromosom d. Secara genetik dapat ditransfer secara stabil
10. 10. Enzim Restriksi Enzim restriksi merupakan suatu endonuklease yang mengenal urutan
spesifik pada molekul DNA dan memotong pada urutan yang spesifik tersebut. Enzyme
Source Recognition Sequence Cut EcoRI Escherichia coli 5’GAATTC 3’CTTAAG 5’--G
AATTC--3’ 3’--CTTAA G--5’ EcoRII Escherichia coli 5’CCWGG 3’GGWCC 5’-- CCWGG--3’
3’--GGWCC --5’ BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5’GGATCC 3’CCTAGG 5’--G GATCC--3’
3’--CCTAG G--5’ HindIII Haemophilus influenzae 5’AAGCTT 3’TTCGAA 5’--A AGCTT--3’ 3’--
TTCGA A--5’ TaqI Thermus aquaticus 5’TCGA 3’AGCT 5’--T CGA--3’ 3’--AGC T--5’ Enzim
Restriksi yang sering digunakan pada proses rekombinan DNA Komponen Kloning Gen
11. 11. Enzim Ligase Sel Inang Enzim yang mengkatalisis reaksi pembentukan kembali ikatan
fospodiester antara potongan fragmen DNA atau RNA berujung kohesif yang saling
berkomplemen hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Enzim ligase yang sering
digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli, DNA ligase dari Fage T4, ligase bakteri termofilik
dan termostable DNA ligase. Organisme yang menampung virus, dll umumnya dengan
menyediakan makanan dan tempat berlindung. Komponen Kloning Gen
12. 12. Tahap-tahap Kloning Gen Isolasi DNA Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi DNA
Penyambungan dengan Enzim Ligase Transformasi Sel Seleksi Klon Rekombinan
13. 13. Isolasi DNA yang diawali dengan melakukan perusakan serta penghilangan dinding sel,
yang dilanjutkan dengan pelisisan. Dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi
endonuklease. Pemutusan ini dilakukan di dalam strain tertentu yang bertujuan untuk
mencegah agar tidak merusak DNA. Isolasi DNA Pemotongan DNA
14. 14. Terdapat beberapa cara, yaitu penyambungan dengan menggunakan enzim DNA ligase
dari bakteri, serta dengan pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk mensintesis
untai tunggal homopolimerik 3’. Penyambungan DNA
15. 15. Transformasi Sel Seleksi Klon Rekombinan Transformasi dapat dilakukan dengan cara :
1. Heat Shock (Kejutan Panas), dimana campuran sel dan DNA plasmid rekombinan
didinginkan dalam waktu yang lama, kemudian di panaskan dengan segera pada suhu 42°C.
2.Elektroporasi (kejutan listrik) menggunakan suatu alat yang dialiri arus listrik Seleksi klon
rekombinan ini bertujuan untuk menentukan koloni mana yang membawa plasmid
rekombinan. Terdapat beberapa cara seleksi klon tekombinan, diantaranya : 1.Seleksi
berdasarkan sifat resistan terhadap antibiotik. 2.Seleksi dengan melibatkan gen LacZ.
Transformasi sel merupakan proses untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang.
16. 16. Pada Tumbuhan Pada Hewan Pada Manusia Aplikasi Kloning Gen
17. 17. Tinjauan Bioetika Kloning Sel atau jaringan dalam upaya meningkatkan derajat
kesehatan melalui antara lain: pembuatan zat anti atau antigen monoclonal yang banyak
digunakan dalam bidang kedokteran baik aspek diagnostic maupun dalam pengobatan.
Yang sangat utama untuk diperhatikan adalah seharusnya kloning hanya dilakukan untuk
kepentingan kesejahteraan kehidupan serta tidak menyalahi etika dan moral. Etika tentang
klonasi/ kloning dalam adeddum Buku Kedokteran Indonesia disebutkan bahwa menolak
dilakukan kloning terhadap manusia karena upaya itu mencerminkan penurunan derajat
serta martabat manusia.
18. 18. Kelebihan dan Kekurangan Kelebihan Kekurangan 1. Untuk upaya konservasi hewan
atau tumbuhan yang langka 2. Studi model perjalanan suatu penyakit 3. Diperoleh tanaman
baru dalam jumlah besar dalam waktu yang singkat dan dengan sifat yang identik atau sama
dengan induknya. 1. Menurunkan keanekaragaman tanaman baru yang dihasilkan, demikian
juga pada hewan. 3. Tingkat kegagalan sangat tinggi, dimana kemungkinan berhasil hanya
sekitar 0.1 – 3 % 2. Diferensiasi telomerik