Anda di halaman 1dari 11

BAB III

METODE KERJA

III.I. Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

 Autoklaf
 Cawan petri
 Lampu spiritus
 Korek api
 Tabung reaksi
 Spot
 Rak tabung
 Ose bulat dan ose lurus

3.1.2 Bahan

 Medium NA
 Medium PDA
 Medium PW
 Bakteri

III.2. Cara Kerja

Metode gores (Streak Plate Method) pada media agar miring

a. Media agar miring yang telah disterilkan diletakkakn pada telapak tangan kiri
b. Dipanaskan jarum ose pada nyala api lampu spiritus hingga membara
c. Dibuka sumbat kapas pada biakan induk dengan jari manis dan kelingking
d. Disumbat kapas pada biakan induk tutup
e. Di sumbat kapas media agar-agar miring yang akan di inokulasi mikroorganisme
Dibuka dengan cara yang sama dengan langkah
f. Kemudian ujung jarum ose yang sudah mengandung mikroorganisme digeserkan
dengan hati-hati diatas permukaan agar,dimulai dari dasar tabung secara zig-zag
menuju bagian atas tabung
g. Disumbat kapas ditutup secepatnya pada media yang telah diinokulasi
h. Dipanaskan ujung jarum ose kembali membara untuk memusnahkan
mikroorganisme yang masih menempel
i. Diamati, digambar dan diberi keterangan pertumbuhan koloni bakteri
Metode gores (Streak Plate Method) Pada media agar datar

a. Media dalam tabung reaksi diletakkan pada telapak tangan kiri


b. Dipanaskan jarum ose pada nyala api lampu spiritus hingga membara
c. Dibuka sumbat kapas biakan induk dengan jari manis dan kelingking
d. Disumbat kapas pada biakan induk tutup
e. Dipanaskan pinggiran cawan petri untuk proses sterilisasi cawan petri
f. Dibuka sedikit tutup cawan petri dengan tetap melakukannya di dekat api
bunzen
g. Digeserkan ujung jarum ose yang sudah mengandung mikroorganisme dengan
hati-hati di atas permukaan agar,dimulai dari atas permukaan secara zig-zag
menuju ke bagian bawah
h. Ditutup secepatnya pada media cawan petri yang telah di inokulasi,dipanaskan
ujung jarum ose kembali sampai membara untuk memusnahkan mikroorganisme
yang masih menempel
i. Disimpan biakan baru diinokulasi dalam inkubator
j. Diamati,digambar dan diberi keterangan pertumbuhan koloni bakteri.

Metode taburan (Pour Plate Method)

a. Dicairkan medium bakteri diatas penangas air dan di dinginkan sampai suhu
50⁰C.Dituangkan ke dalam cawan petri secara aseptik dan dibiarkan sampai
padat.Diencerkan suspensi bahan yang mengandung mikroorganisme
seencer mungkin dan diteteskan secara aseptic.
b. Diratakan dengan digoyangkan seperti angka delapan
c. Ditutup cawan petri dan diberi label ,kemudian diinkubasikan dalam keadaan
terbalik dalam inkubator selama 24-48 jam.

Cara Pemindahan Suspensi :

a. Goyangkan tabung sehingga bakteri tercampur merata dalam suspensi


b. Pijarkan ose sampe merah
c. Buka tutup tabung dan panaskan mulut tabung di atas api
d. Setelah ose dingin kembali, ambil 1 mata ose suspensi bakteri,jangan menyentuh sisi
tabung
e. Panaskan mulut tabung sebelum menutup tabung
f. Tutup kembali tabungdan letakkan kembali pada tempatnya
g. Letakkan ose yang berisi suspensi biakan diatas kaca objek
h. Pijarkan ose setiap kali mengambil suspensi biakan dan sewaktu meletakkan
kembali.
IV.2 Pembahasan

Pemberian Media

Pada pembuatan kali ini digunakan 2 jenis media yaitu media padat (PDA,PCA,NA) dan cair
(PW). Media padat untuk pertumbuhan mikroba padapermukaan hingga membentuk koloni yang
dapat lekat dihitung dan diisolasi,sedangkan PW merupakan media cair yang digunakan untuk
pertumbuhan dan pembiakan mikroba serta fermentasi.Pertumbuhan mikroba ditandai dengan
perubahan larutan.

PW yang telah dilarutkan dengan air diberi metilen biru hingga warna biru muda.Setetlah
larut diambil 7 ml dengan menggunakan spoit dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah di
sterilkan terlebih dahulu.Setelah itu ditutup rapat tabung reaksi dengan kapas agar tidak masuk
mikroba dari udara.Disterilkan dalam autoklaf selama kurang lebih 15 menit.Kemudian keluarkan
dan diletakkan di rak tabung.

PDA dan PCA yang telah larut dengan air suling akan berwarna kuning.Kemudian dipanaskan
di atas water bath,setelah larut diambil sebanyak 7 ml untuk media miring dan 5 ml untuk media
tegak menggunakan spoit dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah di sterilkan kecuali
untuk PCA cukup dituangkan ke dalam cawan.Tutup sisa PDA,PCA atau NA setelah steril dikeluarkan
taruh 1 rak tabung dan 1 lagi dibuat agak miring,dari sisa PDA atau NA dituangkan di cawan petri.
Tetapi terlebih dahulu mulut erlemeyer dipanaskan spiritus,begitu pula cawan petrinya. Panaskan
kembali mulut erlemeyer dengan spiritus inokulasi bakteri.

Dalam menginokulasi bakteri harus berhati-hati, hal ini dimaksudkan untuk mencega
terjadinya kontaminasi oleh mikroba lain yang tidak dikehendaki. Oleh karena itu sebaiknya bekerja
secara aseptis.
BAB V

PENUTUP

V.1. Kesimpulan

Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat makanan yang dipakai untuk
menumbuhkan mikroba media padat digunakan pula untuk isolasi penguraian fisiologi dan
perhitungan jumlah mikroba.

V.2. Saran

Dalam pembuatan mediayang diperlukan adalah kesterilan alat-alat yang akan digunakan.
Dan agar praktikan bekerja secara aseptis.

Dalam melakukan praktikum, praktikan menggunakan alat bantu handscoun dan masker.Hal
ini ditujukan untuk mecegah kontaminasi dengan media jamur maupun bakteri.
DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro,D. 2005.Dasar-Dasar Mikroobiologi.Jakarta ;Djambatan.

Pelcrar.M.I.2007.Dasar-Dasar mikrobiologi.Jakarta : UI Preso.

Soedjo,M.1991.Mikrobilogi Tanah.Jakarta : RhinekaCipta.


Teknik Isolasi Dan Pemurnian

Teknik isolasi mikroba untuk memisahkan dan mengidentifikasi, jenis mikroba dari
biakan dapat di klarifikasikan berdasarkan sifat pertumbuhan yng nampak pada media.

Metode Penanaman Pada Agar

Pada metode penanaman pada agar,jika sedikit saja sel yang diletakkan dalam
medium agare,maka tiap sel akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah.Jika suspensi sel cukup
diencerkan, koloni akan terpisah dengan baik,sehingga masing-masing memiliki kemungkinan
tinggi untuk diturunkan menjadi sel tunggal. Namun untuk membuat yang demikian, penting
untuk mengambil satu tipe koloni yang diinginkan, memasukkan ke dalam air dan menanamnya
kembali ke agar.Dengan mengulangi prosedur ini beberapa kali menjamin untuk memperoleh
biakan murni.

Metode Pengenceran

Metode yang sedikit dapat dipercaya adalah pengenceran. Suspensi diencerkan seri
dan contoh masing-masing pengenceran ditanam pada agar.Jika hanya sedikit dari pengenceran
terntentu menunjukkan pertumbuhan, diperkirakan bahwa beberapa dari biakan tadi dimulai
dari sel tunggal. ,Metode ini tidak digunakan kecuali jika penanaman pada agar tidak dimungkin
kan karena beberapa alasan. Gambaran yang tidak diinginkan dari metode ini adalah bahwa
metode ini hanya dapat di gunakan untuk isolasi tipe organisme yang dominan dalam populasi
campuran.
Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu:

1. Isolasi Pada Agar Cawan

Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga
diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah
yang tampak pada cawan tersebut setelah diinkubasi berasl dari satu sel tunggal.Terdapat beberapa
cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu : metode goreskuadran dan metode agar cawan
tuang.Bila metode gores kuadran dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya
mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel.

2. Isolasi Pada Medium Cair

Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar
cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair.Metode ini juga perlu
dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran
peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.

3. Isolasi Sel Tunggal

Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar
yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan
menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan
menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara
aseptis.
Macam-macam Media

Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :

1. Mixed culture : berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme


2. Plate Culture : Media padat dalam petridish
3. Slant culture : media padat dalam tabung reaksi
4. Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya cara penusukan.
5. Liquid Culture : Media cair dalam tabung reaksi
6. Shake Culture : Media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya di kocok.

Cara Menyelidiki Piaraan Murni

Dalam keadaan sebenarnya (di alam bebas) boleh dikatakan tidak ada bakteri yang
hidup sendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen kedapata bersama-
sama bakteri saproba. Untuk menyendiri suatu spesies ada dikenal beberapa cara,yaitu:

1. Dengan Pengenceran

Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies
diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil sampel 1 ml
untuk diencerkan lebih lanjut.Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk
disebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita
hanya memperoleh satu koloni saja.Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu
koloni murni. Kalau kita belum yakin ,bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni,kita
dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel (Waluyo,
2005)
2. Dengan Penuangan

Robert Koch (1943-905) mempunyai metode Yang lain,yaitu dengan mengambil sedikit
sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarluaskan di
dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian diperoleh hanyalah suatu
piaraan adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampak
lah koloni-koloni yang masing-masing dapat dianggap murni .Dengan mengulang pekerjaan
seperti di atas,maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin (Waluyo,
2005).

3. Dengan Penggesekan

Metode ini sekarang banyak digunakan ,karena tidak begitu memakan waktu,hanya sayang
dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat tumbuh .Jika ujung kawat inokulasi
dibengkokkan ,kemudian ujung kawat diinokulasi itu setelah disentuhkan suatu koloni lalu di
gesekkan pada permukaan medium padat,maka beberapa waktu kemudian (kurang lebih 12
jam) akan nampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebar di permukaan medium.Jika diakan
pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil,maka akan diperoleh suatu
piaraan murni (Waluyo,2005).

4. Dengan Mengucilkan Satu Sel (Single Cell Isolation Mikropipet)

Mikropipet adalah alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak,dengan tiada
ikut serta bakteri lainnya. Mikropipet ditempatkan pada tangan-tangan suatu mikro-
manipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca
penutup. Pekerjaan ini dilakukan di bawah obyektif mikroskop.Jika tampak suatu tetesan hanya
mengandung satu bakteri, maka dengan lain mikropipet, tetesan tersebut dipindahkan ke
medium encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berkembang biak dulu. Kemudian dari
sini dapat diperoleh piaraan murni.Metode ini sangat memerlukan kesabaran, lagipula
mikroomanipulator sangat mahal (Waluyo, 2005).
5. Dengan Inokulasi Hewan

Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh di
dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak dari seseorang yang disangka menderita tbc.
Jika dahak ini disuntikkan ke dalam tubuh tikus putih,maka bakteri-bakteri approbe yang ikut
serta itu tidak akan bertahan,sehingga kemudian kita peroleh semata-mata hasil tbc saja.
Piaraan pneumococcus murni dapat diperoleh dengan jalan demikian juga.Bakteri yang
ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati akhirnya dapat dipindahkan ke dalam
medium yang sesuai. Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit (intracutaneous ), dapat di dalam
otot (intramuscular), dapat di rongga tubuh atau lain-lain tempat lagi (Waluyo,2005).

Teknik Aseptik

Se belum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme,pertama kali kita harus


mepertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi.Mikroorganisme ada dimana-mana .
Karena ukurannya yang sangat kecil ,mereka mudah lepas dalam udara dan permukaan .Maka
dari itu , kita harus mensterilsasikan medium kultur secepatnya setelah preparasi untuk
pemindahan mikroorganisme siap dikontaminasikan, ini biasanya terbunuh. Bagaimanapun, itu
sama pentingnya untuk tindakan percegahan sampai penanganan berikutnya medium kultur
harus tetap steril. Demikian materi yang lain yang akan kontak juga harus tetap terjaga
kesterilannya (Cappucino,1983).

Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga kultur manipulasi dan media
kultur steril disebut teknik aseptik.Keunggulan itu dibutuhkan keberhasilan dalam laboratorium
mikrobilogi, dan salah satu cara belajar dengan pendamping mikrobiologi .Kontaminasi udara
paling sering menjadi masalah karena udara selalu kontak dengan partikel debu dan umumnya
banyak komunitas mikroorganisme di dalamnya. Ketika wadah dibuka maka segera ditangani agar
tidak terkontaminasi dengan udara sekitar. Transfer aseptik pada kultur dari salah satu medium
ke medium yang lain harus lihat dengan loop diinokulasi atau jarum harus disterilkan oleh
pembakaran pada nyala api. Permukaan agar datar,dimana pertumbuhan suatu koloni berasal
dari pertumbuhan suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan pembelahan sel tunggal
(Cappucino,1983).

Teknik Pembiakan

Pembiakan adalah proses perbanyakan organisme melalui penyediaan kondisi lingkungan


yng sesuai. Mikroorganisme yang sedang tumbuh membuat replica dirinya, membutuhkan
adanya elemen-elemen dalam komposisi kimia mereka. Nutrisi harus menyediakan elemen ini
dalam bentuk yang mudah dimetabolisme.Faktor-faktor yang harus di kontrol selama
pertumbuhan meliputi nutrisi,pH,temperatur, aerasi,konsetrasi garam dan kekuatan ionic
medium.

Teknik pembiakan dilakukan berdasarkan tujuan melakukan pembiakan mikroorganisme.


Umumnya tiga situasi dapat ditemukan,yaitu :

1. Memperbanyak atau menumbuhkan spesies tertentu


2. Menentukan jumlah dan tipe organism yang ada pada sample
3. Mengisolasi organisme tertentu dari sumber alami.

Untuk memperbanyak spesies tertentu harus disiapkan media yang mengandung bahan dan
kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan spesies tersebut.Untuk hal ini cukup dibutuhkan satu
jenis media tetapi bersifat selektif dan kaya nutrient sehingga pertumbuhan akan berjalan baik.