Pengaruh Aktivitas Antioksidan Kasein Yogurt Susu Kambing terhadap

Kadar Super Oxide Dismutase (SOD), Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α),
Interleukin 1 Beta (IL1-β), dan Malondialdehyde (MDA) Pulmo pada Hewan
Model Terpapar 2,3,7,8-Tetrachlorinedibenzo-P-Dioksin (TCDD)
C. Mahdi1*, A.E.P. Haskito2, M.C. Padaga2, A. Roosdiana1
1
Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Science, Brawijaya University, Malang 65145, Indonesia
2
Veterinary Public helath Laboratory, Faculty of Veterinary Medicine, Brawijaya University, Malang 65145,
Indonesia
*Corresponding Author E-mail: chanifmahdi@gmail.com

ABSTRACT:
Kasein yogurt susu kambing mengandung peptida bioaktif yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Pada
penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh aktivitas antioksidan kasein yogurt susu kambing terhadap kadar
Super Oxide Dismutase (SOD), Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α), Interleukin 1 Beta (IL1-β), dan
Melondialdehyde (MDA) pulmo pada hewan model terpapar 2,3,7,8-Tetrachlorinedibenzo-P-Dioksin (TCDD).
Aktivitas antioksidan kasein yogurt susu kambing diuji dengan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil), dan
potensi antioksidan diuji coba secara in vivo menggunakan hewan coba (Rattus norvegicus) dibagi menjadi 6
kelompok, kontrol negatif, kontrol positif pemberian dioksin, kontrol placebo, dan 3 kelompok perlakuan dengan
pemberian kasein 300 mg/kg BB/hari, 600 mg/kg BB/hari dan 900 mg/kg BB/hari. Kadar SOD diukur dengan
menggunakan spektrofotometri, kadar TNF-α dan IL1-β diukur dengan imunohistokimia. Hasil penelitian
menunjukkan kasein yogurt susu kambing memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat dengan nilai hasil uji sebesar
4,52 µg/ml. Pemberian kasein dapat meningkatkan antioksidan tubuh yang ditandai dengan peningkatan kadar SOD
pulmo secara tidak signifikan dapat menurunkan faktor inflamasi sel seperti TNF-α dan IL1-β pulmo. Sedangkan,
terjadi peningkatan kadar MDA yang tidak signifikan hal ini disebabkan karena adanya aktivitas antioksidan yang
dimiliki oleh kasein susu kambing. Berdasarkan hasil tersebut disimpulkan bahwa senyawa bioaktif kasein yogurt
susu kambing memiliki antioksidan yang tinggi dan berpotensi menurunkan kerusakan sel pulmo.

KEYWORDS: Yogurt Susu Kambing, Aktivitas Antioksidan Kasein, SOD, TNF-α, IL1-β

INTRODUCTION:
Total produksi susu kambing di dunia mencapai 15.510.411 ton per tahun [1]. Konsumsi susu kambing lebih
dominan terutama di negara berkembang, sebesar 80% dari produksi susu kambing global, yang menjadi sumber
nutrisi penting dan sebagai makanan pokok. Susu kambing merupakan media cair yang mempunyai komposisi
sangat lengkap. Susu kambing telah dikenal mempunyai manfaat bagi kesehatan. Umumnya susu kambing
dihasilkan oleh ternak kambing peranakan Etawa. Dibandingkan dengan susu sapi, susu kambing mengandung lebih
tinggi total solid dan nutrient. Ukuran globular protein pada susu kambing lebih kecil dibandingkan susu sapi. Lactal
bumin dan kasein pada susu kambing tidak menyebabkan alergi pada bayi dan anak yang sensitif terhadap susu sapi.
Komponen protein utama dalam susu adalah kasein yang merupakan sumber peptida dan memiliki pengaruh
kesehatan sebagai antioksidan Kasein merupakan komponen utama dalam protein susu yang mencapai 80% dari
total fraksi protein susu. Komponen protein utama dalam susu adalah kasein yang merupakan sumber peptida dan
memiliki pengaruh kesehatan sebagai antioksidan.
Dioksin merupakan kelompok senyawa kimia yang memiliki toksisitas tinggi yang diproduksi dari proses alami
seperti aktivitas gunung berapi, kebakaran hutan serta proses buatan seperti pembakaran limbah, polusi asap
kendaraan, asap rokok, dan beberapa proses industrial. Dioksin termasuk dalam kelas dari hidrokarbon aromatik
polyhalogenasi yang secara struktural dan kimia mencakup polychlorinated dibenzo-p-dioxin (PCDD atau dioksin),
dibenzofuran (PCDFs atau furan) dan β dioksin seperti bifenil (PCB). Dioksin yang paling toksik adalah 2,3,7,8-
Tetrachlorinedibenzo-P-Dioksin (TCDD) [2].
Pada manusia dan vertebrata lainnya, toksisitas dioksin dapat mengakibatkan gangguan pada sistem saraf,
reproduksi, endokrin, sirkulasi, integumen dan penurunan sistem imunitas [3]. Dioksin dapat terakumulasi di dalam
tubuh dan banyak ditemukan di hepar dan adiposa, sehingga dapat menyebabkan peningkatan serum kolesterol dan
trigliserida serta kerusakan pada hepar [2, 3].

1
TCDD menginduksi banyak kerusakan sel termasuk peroksidasi lipid, disrupsi membran sel, kerusakan DNA dan
protein dengan mempercepat terbentuknya ROS. Mekanisme molekuler dari TCDD yaitu dengan pembentukan
ikatan dan aktivasi intraselular ligand dependent transcription factor dengan aryl hydrocarbon receptor (AhR).
AhR adalah reseptor yang berfungsi sebagai signal tranduksi dan aktivasi transkripsi gen [4,5]. Sehingga toksikasi
TCDD berperan dalam pengaruh stres oksidatif di beberapa jaringan seperti jantung, hepar, dan otak [4,6].
Yoghurt merupakan produk yang dihasilkan dari susu yang difermentasikan dengan starter Bakteri Asam Laktat
(BAL) [6]. Komponen protein utama dalam susu adalah kasein yang merupakan sumber peptida dan memiliki
pengaruh kesehatan sebagai antioksidan. Susu fermentasi (yoghurt) terbukti memiliki aktivitas antioksidan yang
lebih tinggi dibandingkan susu murni [7]. Penggunaan kasein yoghurt susu kambing diharapkan mampu menjadi
alternatif untuk mencegah peningkatan maupun mengurangi jumlah radikal bebas akibat paparan dioksin.

MATERIAL AND METHODS:

Chemicals and reagents:
Pembuatan starter yogurt yang mengandung 3 strain bakteri asam laktat: L. bulgaricus, S. thermophilus, dan L.
acidophilus (Yogourmet®, Lyo-SAN INC: 500 Aeroparc, C.P. 589, and Lachute, QC. Canada, J8H, 464). Bahan
kimia yang digunakan adalah 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) dengan kemurnian lebih dari 99%
(Supelco Analytical Bellefonte, PA, Cat No:48599). Larutan stok 10 µg/mL diencerkan kedalam 100 ml minyak
jagung sebagai dosis larutan.

Preparasi yogurt susu kambing dan kasein:

Susu kambing segar dan belum diproses didapatkan dari peternakan rakyat (Malang, Indonesia). Yogurt susu
kambing dipersiapkan dengan menggunakan metode yang telah termodifikasi. Kasein disiapkan dengan sentrifugasi
yogurt susu kambing berkecepatan 12.000 rpm pada suhu 5 oC selama 10 menit. Padatan yaitu kasein dipisahkan dari
supernatan. Kasein yang dihasilkan dikeringbekukan dan disimpan pada suhu -20oC sampai siap digunakan.

Uji aktivitas antioksidan kasein:

Kasein dengan konsentrasi 50 µg/mL. 75 µg/mL, 100 µg/mL, 125 µg/mL dan 150 µg/mL ditambahkan kedalam 2
mL DPPH 0,1 mM. Campuran selanjutnya dikocok dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit ditempat
gelap. Larutan ini selanjutnya diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada λmaks 516 nm. Perlakuan
yang sama juga dilakukan untuk larutan blanko yang terdiri dari 2 mL DPPH 0,1 mM dan 1 mL metanol p.a.

Hewan coba:
Hewan coba yag digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar, jantan, berumur 8-12 minggu degan
berat badan 150-250 gram sebanyak 24 ekor yang dibeli dari animal house D’wistar Bandung. Hewan coba
dipelihara di Institut Biosains Universitas Brawijaya. Kondisi laboratorium dijaga pada suhu dibawah normal yaitu
24 ± 2 oC dan diberikan pencahayaan 12 jam terang/gelap. Aklimatisasi berlangsung selama 14 hari sebelum
eksperimen dimulai, observasi kondisi kesehatan hewan secara umum dilakukan setiap hari. Pakan dan minum
diberikan secara ad libitum.

Desain eksperimen:
Studi penelitian ini telah mendapatkan sertifikat laik etik dari komisi laik etik penelitian. Hewan coba dibagi secara
acak menjadi 6 kelompok. Masing-masing kelompok tikus terdiri dari 4 ekor yang merupakan ulangan dari
perlakuan. Kelompok kontrol negatif diberikan pakan standar dan minum tanpa diberikan perlakuan. Kelompok
kontrol placebo diberikan kasein yogurt susu kambing yang dilarutkan dalam air dengan konsentrasi 600
mg/kgBB/hari. Kelompok kontrol positif diberikan TCDD secara per oral dengan dosis 100 ng/kgBB/hari yang
dilarutkan dalam minyak jagung. Kelompok perlakuan 1 (P1) diberikan kasein 300 mg/kgBB/hari dan TCDD 100
ng/kgBB/hari. Kelompok perlakuan 2 (P2) diberikan kasein 600 mg/kgBB/hari dan TCDD 100 ng/kgBB/hari.
Kelompok perlakuan 3 (P3) diberikan kasein 900 mg/kgBB/hari dan TCDD 100 ng/kgBB/hari. Volume larutan
kasein dan TCDD yang dimasukkan kedalam tubuh setiap tikus sebanyak 1 ml. Perlakuan berlangsung selama 21
hari dan berakhir dengan euthanasi tikus dengan metode dislokasio leher.

Analisa SOD Pulmo:

Tikus dibedah dan diambil organ pulmo, kemudian dicuci dengan NaCl fisologis 0,9%. Ditimbang sebanyak
masing-masing 0,5 gram, kemudian digerus dengan menggunakan mortar steril yang diletakkan diatas balok es.
Ditambahkan 0,5 ml NaCl fisiologis 0,9% dingin, dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1,5 ml dan disentrifugasi

2
pada kecepatan 8000 rpm selama 20 menit. diambil supernatan untuk dianalisa kadar SOD. Analisa SOD dilakukan
dengan cara sebanyak 100 µl supernatan pulmo direaksikan dengan campuran 100 µl xantin, 100 µl xantin oksidase,
100 µl NBT, dan 1,6 ml PBS. Larutan tersebut diinkubasi selama 30 menit pada suhu 30 oC. Absorbansi yang
dihasilkan kemudin diukur dengan spektrofotometer λ= 580 nm.

Analisa TNF-α dan IL1-β Pulmo:

Tikus dibedah dan diambil organ pulmo, kemudian dimasukkan ke dalam larutan formalin 10%. Dibuat preparat
imunohistokimia (IHK) dengan menggunakan antibodi TNF-α dan IL1-β, kemudian melakukan pembacaan dibawah
mikroskop cahaya perbesaran 40x. Ekspresi TNF-α dan IL1-β dihitung dengan bantuan software Immunoratio.

Analisa MDA Pulmo:

Pulmo dipotong menjadi 2 bagian. Satu bagian di bungkus dengan aluminium foil, dicelupkan kedalam nitrogen cair
selama 10 detik, kemudian disimpan dalam lemari es pada suhu 20C sebagai bahan untuk pemeriksaan MDA, dan
sbagian yang lain disimpan dalam formalin 10% sebagai bahan pembuatan preparat histologi. Analisis MDA
dilakukan mengacu pada metoda TBA (Aulanni’am dkk, 2012), terdiri dari tiga tahap yaitu penentuan panjang
gelombang maksimum, pembuatan kurva standar dan pengukuran kadar MDA sampel dengan spektofotometer pada
λ=532 nm.

Analisa data:
Data SOD, TNF-α, IL1-β, dan MDA yang diperoleh diolah dengan analisis statistika uji oneway ANOVA
dilanjutkan dengan uji Tukey dengan bantuan program SPSS for Windows.

HASIL:
Aktivitas antioksidan kasein yogurt susu kambing:
Hasil yang diperoleh menunjukkan aktivitas antioksidan kasein yogurt susu kambing adalah sebesar 4,52 µg/mL.
Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 < 50 µg/mL; kuat jika nilai IC50 50-100
µg/mL, sedang jika nilai IC50 250-500 µg/mL, dan lemah jika nilai IC50 > 500 µg/mL[Dewi, 2016]. Sehingga, hasil
aktivitas antioksidan 4,52 µg/mL dapat dikatakan kasein yogurt susu kambing memiliki aktivitas antioksidan sangat
kuat.

Kadar SOD Pulmo:

Induksi TCDD menurunkan enzim SOD yang berperan sebagai antioksidan endogen, dapat dilihat dari hasil kadar
SOD kelompok kontrol positif berbeda nyata terhadap kelompok kontrol negatif. Pemberian kasein pada kelompok
kontrol placebo atau hewan sehat tidak berpengaruh nyata terhadap kadar SOD. Kelompok hewan placebo tidak
berbeda nyata terhadap kelompok kontrol positif dan kontrol negatif. Pemberian kasein dapat memproteksi pulmo
dari radikal bebas yang disebabkan oleh dioksin. Pada kelompok perlakuan 1, 2, dan 3 pemberian kasein dengan
dosis 300 dan 600 mg/kgBB/hari berpengaruh nyata dalam meningkatkan kadar SOD, namun pemberian dosis
tersebut memiliki pengaruh yang tidak berbeda nyata. Hasil rerata kadar SOD pada setiap kelompok perlakuan dapat
dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Pengaruh Kasein Yogurt Susu Kambing terhadap Rerata Kadar Enzim SOD Pulmo
Kelompok Kadar SOD (U/mL)
K- 6,73 ± 0,72c
K+ 3,48 ± 1,43a
KP 4,34 ± 0,45ab
P1 5,62 ± 0,28bc
P2 5,80 ± 1,55bc
P3 6,22 ± 0,15bc
Keterangan: Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan penelitian (p<0,05)

Kadar TNF-α pulmo:

Pemberian TCDD dapat meningkatkan kadar TNF-α pulmo yang berperan sebagai mediator pro inflamasi, hal ini
dapat dilihat dari hasil kadar TNF-α kelompok kontrol positif berbeda nyata terhadap kelompok kontrol negatif.
Pemberian kasein pada kelompok kontrol placebo atau hewan sehat tidak berpengaruh signifikan dalam menurunkan
kadar TNF-α pulmo, hal tersebut dapat dilihat tidak berbeda nyata dengan kontrol negatif. Pada kelompok perlakuan
1 menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata dengan kontrol positif, hal tersebut memberikan informasi bahwa
dosis 300 mg/kg berat badan belum mampu memproteksi pulmo dari kerusakan dioksin. Pada perlakuan 2 dan 3,

3
pemberian kasein dapat menurunkan kadar TNF-α pulmo dan menunjukkan hasil berbeda nyata dengan kontrol
positif, namun pemberian dosis 600 dan 900 mg/kgBB/hari tidak memberikan pengaruh yang berbeda dalam
penurunan kadar TNF-α. Hasil rerata kadar TNF-α pada setiap kelompok perlakuan dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Pengaruh Kasein Yogurt Susu Kambing terhadap Rerata Kadar TNF-α Pulmo
Kelompok Kadar TNF-α (pg/mL)
K- 23,50 ± 0,00a
K+ 36,42 ± 0,00b
KP 34,8075 ± 4,64350a
P1 36,8150 ± 11,5631bc
P2 30,3600 ± 21,1308ab
P3 28,8725 ± 1,39469ab
Keterangan: Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan penelitian (p<0,05)

Kadar IL1-β pulmo:

Pemberian TCDD tidak dapat meningkatkan kadar IL1-β pulmo yang berperan sebagai mediator pro inflamasi, hal
ini dapat dilihat dari hasil kadar IL1-β kelompok kontrol positif tidak ada perbedaan terhadap kelompok kontrol
negatif.
Pemberian kasein pada kelompok kontrol placebo atau hewan sehat tidak berpengaruh signifikan dalam menurunkan
dan menaikkan kadar TNF-α pulmo. Pada keseluruhan kelompok perlakuan 1, 2, dan 3 pemberian kasein dengan
dosis 300, 600, maupun 900 mg/kgBB/hari belum mampu memproteksi pulmo dari kerusakan yang disebabkan oleh
dioksin. Hal ini juga dapat disebabkan faktor dalam prosedur pewarnaan IHK. Hasil rerata kadar IL1-β pada setiap
kelompok perlakuan dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Pengaruh Kasein Yogurt Susu Kambing terhadap Rerata Kadar IL1-β Pulmo
Kelompok Kadar IL1-β (pg/mL)
K- 35,4200 ± 7,0004a
K+ 47,3050 ± 5,688a
KP 35,700 ± 0,000a
P1 45,5000 ± 18,359a
P2 41,4450 ± 14,482a
P3 33,2200 ± 8,828a
Keterangan: Notasi yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang signifikan antar kelompok perlakuan penelitian (p<0,05)

Kadar MDA pulmo:

Pemberian TCDD dapat meningkatkan kadar MDA pulmo yang berperan untuk mengetahui bahwa dalam kondisi
normal atau sehat masih terdapat radikal bebas. Hal ini dapat dilihat dari hasil kadar MDA kelompok kontrol positif
tidak berbeda nyata terhadap kelompok kontrol negatif. Pemberian kasein pada kelompok kontrol placebo atau
hewan sehat berpengaruh nyata dalam menstabilkan radikal bebas yang reaktif. Pada kelompok perlakuan 1,
pemberian kasein dengan dosis 300 mg/kgBB/hari membuktikan bahwa antioksidan dalam kasein yoghurt susu
kambing berperan optimal dalam menstabilkan radikal bebas yang reaktif. Pada kelompok perlakuan 2 dan 3,
pemberian kasein dengan dosis 600 dan 900 mg/kgBB/hari membuktikan bahwa antioksidan dalam kasein yoghurt
susu kambing berperan optimal dalam menstabilkan radikal bebas yang reaktif, menunjukkan hasil tidak berbeda
nyata dengan kontrol negatif, pada pemberian dosis 600, maupun 900 mg/kgBB/hari pada setiap kelompok
perlakuan dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 4. Pengaruh Kasein Yogurt Susu Kambing terhadap Rerata Kadar MDA Pulmo
Kelompok Kadar MDA (pg/mL)
K- 318,38 ± 11,61ab Keterangan: Notasi yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan antar
kelompok perlakuan penelitian (p<0,05)
K+ 382,13 ± 55,92b
KP 329,00 ± 23,89ab
P1 384,00 ± 21,31b
P2 361,50 ± 36,63a
P3 247,75 ± 54,79a

PEMBAHASAN:

4
 Chart Title
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
K- K+ KP P1 P2 P3

SOD TNF-α IL1-β

Gambar 2. Pengaruh pemberian TCDD pada hewan model terhadap kadar SOD, TNF-α, dan IL1-β

ACKNOWLEDGEMENT:
The authors are grateful to the authorities of Biosains Institute of Brawijaya University for the facilities.

CONFLICT OF INTEREST:
The authors declare no conflict of interest.

REFERENCES:
1. FAO. 2011. Sheep and Goat Breed of India. Corporate Document Repository.
2. Ministry of Health. Dioxins: A Technical Guide. 9th edn. Wellington: Ministry of Health. 2016; pp.1.
3. Scheter A, Birnbaum L, Ryan JJ, and Constable JD. Dioxin: An Overview. Enviromental Research. 2006; 101: 419-428.
4. Hassoun EA, Vodhanel J, Holden B, Abushaban A. The Effects of Ellagic Acid and Vitamin E Succinate on Antioxidant Enzymes Activities
and Glutathione Levels in Different Brain Regions of Rats After Subchronic Exposure to TCDD. J Toxicol Env. 2006; 69(5): 381-393.
5. Ray S, Swanson HI. Activation of The Aryl Hydrocarbon Receptor by TCDD Inhibits Senescence: A Tumor Promoting Event. Biochem
Pharmacol. 2009; 77(4): 681-8.
6. Ciftci O, Vardi N, Ozdemir I. Effects of Quercetin and Chrysin on 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin Induced Hepatotoxicity in rats.
Environ Toxicol. 2013; 28(3): 146-54
7. Shah, N., Caballero, B., Trugo, L. C., and Finlas, P. M. 2003. Yoghurt: The Product and its Manufacture. In Encyclopedia of Food Sciences
and Nutrition Academic Press: New York, U.S.A. pp 6252-6259.