Anda di halaman 1dari 15

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA
Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Lowry

Kelas : Kimia 4B
Kelompok :1
Anggota Kelompok : Riyan Ardhiansyah (11180960000042)
Usnia Maharani Fadhilah (11180960000038)
Adelya Aprilya (11180960000041)
Dosen Pengampu : Tarso Rudiana, M.Si
Nurul Amilia, M.Si

Laboratorium Kimia
Pusat Laboratorium Terpadu
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2020
BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Prinsip percobaan


Protein di alam terbagi dalam 3 bentuk yakni : protein bebas, protein tidak
terlarut dan protein terlarut. Pada percobaan ini dilakukan untuk menentukan kadar
protein dalam suatu sampel menggunakan metode lowry. Metode lowry yaitu
pengembangan dari metode biuret. Prinsipnya dimulai dengan metode biuret kompleks
CuII(protein) akan terbentuk dan tereduksi menjadi Cu₊ kemudian Cu₊ yang terbentuk
akan mereduksi komples phospomolibdat-phospotungstat menghasilkan hetero-
polymolybdenum dengan warna biru.

1.2 Tujuan Percobaan


1. Memahami prinsip penetapan kadar protein dengan metode lowry
2. Menentukan kadar protein terlarut dalam suatu sampel
BAB II
TINJAUAN PUSAKA

Protein adalah senyawa organic kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan
polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan
ikatan polipeptida. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam
amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut.
(Fesssenden,1986)
Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan
peptide pada setiap ujungnya. Dari struktur umunya,asam amino mempunyai dua gugus pada
tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur
ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjuka sifat-sifat
spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan
memberikan reaksi kimia yang mencirikan gugus gugusnya. (Hawwab,2004)
Pengertian protein berdasarkan sturkturnya menurut (Girindra,A 1986) adalah suatu
zat dalam susunan kimianya mengandung unsur-unsur oksigen,karbon,hydrogen,nitrogen dan
ada juga yang mengandung gugus unsur lain seperti sulfur dan fosfor.
Menurut Page D S(1997), Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan beberapa
metode yang biasa digunakan yaitu metode Biuret, Lowry, titrasi formol dan lain sebagainya.
Masing-masing metode mempunyai kekurangan dan kelebihan. Pemilihan metode yang
terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran bergantung pada beberapa faktor seperti misalnya,
banyaknya material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan
pengukuran, alat spektrofotometri yang tersedia (VIS atau UV).
Salah satu metode yang digunakan dalam penentuan kadar protein adalah metode
lowry yaitu metode yang mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-
Ciocalteuaphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein.
Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca antara 500-750nm,tergantung
sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil sekitar 500nm yang dapat digunakan
untuk menentukan protein dengan konsentrais tinggi dan sebuah puncak besar disekitar
750nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah.
Metode ini lebih sensitive untuk protein konsentrasi rendah disbanding metode biuret.
(Soeharsono,2006).
Alat yang digunakan dalam mengukur absorban dari larutan berwarna adalah
spektrofotometer. Teknik spektrofotometri telah lama digunakan sebagai suatu teknik yang
handal untuk deteksi,identifikasi, dan pengukuran kadar senyawa kimia dalam suatu larutan.
Spectrum cahaya yang dapat terlihat oleh mata terentang antara 400nm-800nm. (Soewanto,
dkk2001)
BAB III
METODE PERCOBAAN

3.1 Alat
- Tabung reaksi 20mL 10 Buah
- Rak tabung reaksi 1 Buah
- Mikro pipet 1000μL 1 Buah
- Spektrofotometer UV-Vis 1 Buah
- Vortex 1 Buah

3.2 Bahan
- Larutan A = larutan Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1N sebanyak 50mL
- Larutan B = larutan CuSO4 0,5% dalam Na-K-Tartrat 1% sebanyak 1mL
- Reagen Folin-Ciocalteu pekat
- Standar protein (BSA) 20-200 μg
- Larutan protein yang diselidiki

3.3 Cara Kerja

Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 Tabung 4 Tabung 5 Tabung 6


+1mL air +0,8mL +0,6mL +0,4mL +0,2mL
Air air air air
+0,2mL +0,4mL +0,6mL +0,8mL +1mL
BSA BSA BSA BSA BSA

Diaduk

+5mL larutan biuret


Diinkubasi selama 10menit

+0,5mL reagen Folin-Ciocalteu


Dikocok dengan vortex

Diinkubasi selama 30menit


Larutan standar discanning dengan spektrofotometri UV-VIS

Dibaca absorbansi yang didapatkan

Dibuat kurva standar larutan BSA dan ditentukan konsentrasi protein dar sampel
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Data Hasil Pengamatan


Tabel hasil Absorbansi larutan standar BSA dan sampel

Tabung Konsentrasi (ppm) Absorbansi


40 0.233
80 0.485
Standar 120 0.767
160 0.840
200 0.985
Sampel
41.6739 0.296
(Kacang Tanah)

4.2 Pembahasan
Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara kualitatif
dan kuantitatif. Pada praktikum yang dilakukan menggunakan metode secara
kuantitaif yaitu metode Lowry untuk mengetahui kadar protein totalnya yaitu metode
lowry. Bahan pangan yang digunakan pada percobaan ini adalah kacang tanah karena
diketahui bahwasannya kacang tanah itu memiliki kandungan protein yang tinggi.
Adapun tujuan dari parktikum yaitu untuk mengetahui kandungan atau kadar total
protein dalam suatu sampel.
Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin
– Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam
protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca diantara 500 – 700
nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil disekitar 500
nm yang dapat digunakan untuk menentukan. Protein dengan konsentrasi tinggi dan
sebuah puncak besar sekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar
protein dengan konsentrasi rendah. Metode ini lebih sensitif untuk protein konsentrasi
rendah dibandingkan Metode Biuret. (Soeharsono, 2006)
Protein dengan asam fosfotungsat – fosfomolibdad pada suasana alkalis akan
memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein yang
ditera. Untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan, terlebih dahulu dibuat
kurva standar yang melukiskan hubungan antara konsentrasi dan optical dencity
(OD). (Sudarmadji, 2010)
Tahap pertama yang dilakukan dalam pengujian kali ini yaitu disiapkan
larutan protein standar (BSA) dan protein sampel (kacang tanah) dalam tabung reaksi
dengan volume total protein dan air sebanyak 1 mL pada 6 tabung reaksi. Antara BSA
dengan air digunakan perbandingan yang bervariasi untuk mencapai jumlah total 1
mL. Sehingga konsentrasi BSA akan bervariasi. Adapun tujuan pembuatan larutan
standar dengan konsentrasi yang berbeda yaitu agar dapat menentukan kadar protein
dalam sampel dengan menggunakan persamaan regresi linier garis lurus yang akan
diperoleh. Dalam percobaan ini digunakan air yang berfungsi untuk melarutkan
sampel (kacang tanah) dan juga melarutkan larutan protein standar serta untuk
mengencerkan larutan sehingga konsentrasi yang dihasilkan menjadi beragam.
Kemudian dilakukan pengadukan untuk mempercepat kelarutan, dengan adanya
pengadukan menyebabkan antar partikel pelarut dan terlarut bertabrakan dengan
sering sehingga menyebabkan semakin cepatnya proses kelarutan.
Selanjutnya setelah keduanya bercampur, pada tiap tabungnya ditambahkan 5
mL larutan biuret yang terdiri dari 50 mL larutan A (Larutan Na2CO3 2% dalam
NaOH 0.1N), adapun fungsi Na2CO3 dalam NaOH yaitu untuk memberikan suasana
basa atau alkali pada reaksi . Lalu ditambahkan 1 ml larutan B (Larutan CuSO4 0.5%
dalam Na-K-Tartrat 1%), fungsi CuSO4 disini yaitu sebagai zat yang akan direduksi.
Kemudian campuran tersebut diinkubasi secara tepat 10 menit pada suhu kamar.
CuSO4 disini direduksi dalam keadaan basa dengan adanya Na2CO3 dalam NaOH
sehingga Cu²⁺ direduksi menjadi Cu⁺ yang membentuk kompleks dengan ikatan
peptida.

https://www.youtube.com/watch?v=xt9-YHzaS0o&feature=youtu.be
Setelah itu ditambahkan 0,5 mL reagen Folin-Ciocalteu kedalam masing masing
tabungnya. Lalu dikocok dengan vortex guna mempercepat proses reaksi. Diinkubasi kembali
campuran tersebut selama 30 menit.
Pada saat ditambahkannya reagen Folin – Ciocalteu (fosfomolibdat dan fosfotungstat)
akan terjadi reaksi reduksi oleh reagen tersebut. Ion Cu⁺ dan gugus radikal dari tirosin dan
triftofan bereaksi dengan folin untuk menghasilkan produk yang tidak satbil yang mereduksi
molibdenum atau tungsten blue. Protein akan bereaksi dengan reagen Folin- Ciocalteu
sehingga membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yaitu tungsten dan
molibdenum.
Step l Step 2

Protein + Cu2+ Protein Cu1+ + Folin-Ciocalteu Blue


Peptidabonds Complex A=660nm

https://www.youtube.com/watch?v=eVmFrf4T93A

Selain warna biru diakibatkan reaksi reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat,


warna biru juga dikareakan ikatan peptida dalam protein yang bereaksi dengan Cu²⁺.
Kepekatan warna biru tersebut tergantung pada banyaknya kandungan tirosin dan juga
triptofan.

Triptofan
Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat setara dengan ion fenolat yang
terbentuk, Artinya semakin besar konsentrasi larutan fenolik maka smakin banyak ion
fenolat yang akan mereduksi asam heteropoli sehingga warna yang dihasilkan akan
semakin pekat. Selanjutnya, terlebih dahulu larutan standar di scanning dalam
spektrofotometer UV-Vis untuk diketahui panjang gelombang maksimumnya.
Dimana prinsip dari spektrofotometer UV-Vis ini yaitu apabila cahaya atau sinar
dari sumber radiasi elektromagnetik yang terdapat dalam suatu analit ataupun senyawa
akan diserap pada daerah sinar tampak dan sinar ultraviolet.
Dimana sinar tersebut akan diteruskan menuju monokromator (alat untuk
mengurai cahaya polikromatis menjadi sinar monokromatik). Cahaya dari monokromator
tersebut akan diarahkan terpisah dengan sampel oleh cermin berotasi, kemudian detektor
pada alat akan menerima cahaya dari sampel secara berulang dan dengan bergantian,
sinyal listrik dari detektor tersebut lantas diproses deangan digital sehingga didapatkan
hasilnya. Nilai cahaya yang diteruskan tersebut dinyatakan oleh nilai adsorbansi karena
absorbansi tersebut memiliki hubungan dengan nilai konsenterasi. (Eka, 2007)
Konsentrasi (ppm) Absorbansi
40 0,233
80 0,485
120 0,767
160 0,840
200 0,985
Tabel 1 Nilai Serapan Spektrofotometri UV-Vis Konsentrasi larutan BSA
Dari ke-6 tabung yang mengandung BSA ini, satu tabungnya dijasikan sebagai
blanko, dan diperoleh angka- angka adsorbsi pada sumbu y dan variasi konsentrasi pada
sumbu x. Berikut kurvanya :

Kurva Standar Larutan BSA


1.5
Absorbansi

1 y = 0.0046x + 0.1043
R² = 0.9536
0.5
Linear (Series1)

0
0 100 200 300
Konsentrasi (ppm)

Berdasarkan kurva diatas, slop positif dengan gradien garis mendekati angka 1 karena
bernialai 0,9536. Dan didapatkan nilai y = 0,0046x + 0,1043. Dengan persamaan inilah
kemudian dapat ditentukan konsentrasi sampel kacang tanah yaitu sebesar 41.6739 ppm dan
didapatkan kadar protein dari sampel (kacang tanah) hasil perhitungan yaitu sebesar
20.83695%.
BAB V

KESIMPULAN

Dari percobaan diatas dapat ditarik kesimpulan bahwa adapun prinsip


penetapan kadar protein dengan metode Lowry yaitu Metode lowry mengkombinasikan
pereaksi biuret dengan pereaksi Folin-Ciocalteauphenol yang bereaksi dengan residu
tirosin dan tryptophan dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa
dibaca pada daerah panjang gelombang sinar tampak 500-750 nm. Dalam metode ini
terlibat 2 reaksi. Awalnya kompleks Cu(II)-Protein sebagai mana metode biuret, yang
dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). ion Cu+ kemudian akan
mereduksi reagen Folin-Ciacalteu, kompleks fosfotungstat dan fosfomolibdat menjadi
tungsten dan molibden yang berwarna biru. Serta dari data diatas diperoleh hasil pengujian
pada uji penetapan kadar protein konsentrasi sampel kacang tanah diperoleh sebesar
41.6739 ppm serta didapatkan kadar protein dari sampel (kacang tanah) hasil perhitungan
yaitu sebesar 20.83695%.
DAFTAR PUSTAKA

Eka. 2007. Metode Analisa Kimia-Spektrofotometri. Gramedia: Jakarta.

Fessenden . 1986. Kimia Organik Jilid II. Jakarta : Erlangga.

Girindira, A . 1986. Biokimia I. Gramedia. Jakarta.

Hawwab, HM. 2004. Pengantar Biokimia. Jakarta: Bayu Media Publishing.

Hermanto, Sandra, dkk. 2017. Pedoman Praktikum Biokimia. Jakarta: UIN Jakarta.

Page D S. 1997. Prinsip-prinsip Biokimia. Jakarta: Erlangga.

Soeharsono, 2006. Biokimia I.Yogyakarta : UGM Press.

Soewanto, H., M dkk. 2001. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Jakarta : Widya Medika.

Sudarmadji, Slamet, H. Bambang, dan Suhardi. 2010. Analisis Bahan Makanan, Edisi Kedua.
Yogyakarta : Liberty.

https://www.youtube.com/watch?v=eVmFrf4T93A.
Diakses pada 6 Juni 2020, pukul 14.35 WIB.

https://www.youtube.com/watch?v=xt9-YHzaS0o&feature=youtu.be.

Diakses pada 6 Juni 2020, pukul 16.05 WIB.


LAMPIRAN

A. Perhitungan
• Penentuan konsentrasi larutan standar BSA yg digunakan (µg/mL = ppm)
➢ Tabung 2
VI x K1 = V2 x K2
0,2 x 200 = 1 x K2
K2 = 40 ppm
➢ Tabung 3
VI x K1 = V2 x K2
0,4 x 200 = 1 x K2
K2 = 80 ppm
➢ Tabung 4
VI x K1 = V2 x K2
0,6 x 200 = 1 x K2
K2 = 120 ppm
➢ Tabung 5
VI x K1 = V2 x K2
0,8 x 200 = 1 x K2
K2 = 160 ppm
➢ Tabung 6
VI x K1 = V2 x K2
1 x 200 = 1 x K2
K2 = 200 ppm
• Penentuan konsentrasi protein dari sample
y = ax + b

y = 0.0046x + 0.1043

0.296 = 0.0046x + 0.1043

0.1917 = 0.0046x

x = 41.6739 ppm
• Penentuan kadar protein kacang tanah
Konsentrasi protein sampel (ppm) / konsentrasi sampel (ppm) x 100% =
41.6739 ppm
𝑥 100% = 20.83695 %
200 𝑝𝑝𝑚

B. Pertanyaan Pra Praktikum


1. Bagaimana prinsip dasar pengukuran kadar protein secara Lowry?
Prinsipnya dimulai dengan metode biuret kompleks CuII(protein) akan
terbentuk dan tereduksi menjadi Cu₊ kemudian Cu₊ yang terbentuk akan mereduksi
komples phospomolibdat-phospotungstat dalam reagen Folin-Ciocalteu
menghasilkan hetero-polymolybdenum dengan warna biru.

2. Bagaimana sifat dari reagen Folin-Ciocalteu?


Reagen Folin-Ciocalteu sangat cepat terurai dalam larutan alkali sehingga
perlu menggunakan reagen secara berlebih agar mendapatkan reaksi yang
lengkap. Namun, penggunaan reagen secara berlebih dapat menimbulkan endapan
dan kekeruhan yang tinggi sehingga tidak bisa dianalisis dengan spektrofotometer
UV-Vis.

C. Pertanyaan Tambahan
1. Tuliskan reaksi pembentukan kompleks Cu-Protein!

2. Apakah kelebihan dan kelemahan metode Lowry dibandingkan dengan metode


lainnya (missal metode Biuret)?
Kelebihan:
- Sangat sensitive sehingga membutuhkan sampel yang lebih sedikit
- Kurang dipengaruhi oleh turbiditas sampel
- Lebih spesifik
- Sederhana, dapat dilakukan 1-1,5 jam
Kekurangan:
- Warna yang dihasilkan tiap protein berbeda
- Warna tidak terbatas pada konsentrasi protein dan dengan senyawa fenol dapat
membentuk warna biru sehingga bisa mengganggu hasil penetapan
- Reaksi dapat dipengaruhi oleh sukrosa, lipid, buffer fosfat, monosakarida dan
heksoamin.

3. Tuliskan struktur dari asam amino tirosin dan triptofan serta tunjukkan gugus
mana yang dapat mereduksi fosfomolibdat!

Triptofan
Gugus fenolik yang akan mereduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat.

Anda mungkin juga menyukai