BAB IV

BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN

A. BAHAN
Kurkumin, Baku Pembanding Kurkumin (Merck), Etinil Estradiol, Metanol
pro KCKT (Merck), Asam asetat glasial 2%, Plasma Manusia (PMI), Aqua
destilata (Ikapharmindo Putramas Pharmaceutical Laboratories).

B. ALAT
Kromatograf Cair Kinerja Tinggi LC 20 AD (Shimadzu, Kyoto, Jepang)
dengan Detektor Visibel, Vortex Mixer (Bionex, Daejeon-Si, Korea),
Timbangan Digital (Denver, New York, Amerika), Sentrifus (Gemmy
Industrial, Taipei, Taiwan), Lemari Pendingin -40ºC (Meiling, Hefei City),
Sonikator LC30H (Elma, Daimler, Jerman), Mikropipet (Trefflab,
Degersheim, Jerman), Erlenmeyer, Beaker Glass, Pipet Volume (Iwaki,
Shizouka, Jepang), Magnetic Stirrer (Thermolyne, Vantaa, Finlandia),
Millipore 0,2 µm, Tabung Effendrof, pH meter (Hanna Instrument).

C. METODE PENELITIAN
1. Penyiapan matriks plasma dan penyimpanan
Plasma darah yang di dapat dari PMI, dalam penyimpanan di letakkan
freezer bersuhu -20ºC. Sebelum digunakan di letakkan dalam lemari
pendingin dan pada suhu kamar. Kemudian darah dimasukkan ke
dalam tabung effendorf, yang telah berisi 10µL EDTA cair dan
disentrifugasi kecepatan 3500 rpm selama 20 menit. Plasma diambil
dan dimasukkan ke dalam tabung effendorf dan disimpan di lemari
pendingin bersuhu -20ºC.

42
 43

2. Pembuatan larutan
a. Pembuatan pelarut metanol pro analisis pH 4
Pelarut yang digunakan berupa metanol pro analisis yang
diatur pada pH 4. Pengaturan pH dilakukan dengan
menambahkan asam asetat glasial 2% sebanyak 1 bagian ke
dalam 9 bagian metanol.
b. Pembuatan Larutan Baku Kurkumin
Sebanyak 10 mg kurkumin dimasukkan ke dalam labu ukur
10,0 mL, larutkan dengan metanol. Kemudian ditambahkan
metanol sampai batas labu ukur lalu larutan dikocok hingga
homogen, didapat konsentrasi 1000 µg/mL. Sejumlah 1,0 ml
larutan tersebut ke dalam labu tentukur 10,0 ml dan diencerkan
dengan metanol pro analisis pH 4 sampai tanda sehingga
diperoleh konsentrasi 100 µg/mL.
c. Pembuatan Larutan Etinil Estradiol
Sebanyak 10 mg etinil estradiol dimasukkan ke dalam labu
ukur 10,0 mL, larutkan dengan metanol. Kemudian
ditambahkan metanol sampai batas labu ukur dan didapat
konsentrasi 1000 µg/mL. Sejumlah 1,0 ml larutan tersebut ke
dalam labu tentukur 10,0 ml dan diencerkan dengan metanol
pro analisis pH 4 sampai tanda sehingga diperoleh konsentrasi
100 µg/mL.
d. Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan terdiri dari asam asetat glasial p.a
2% dan metanol pro KCKT. Masing-masing komponen fase
gerak disaring melalui organic solvent membrane filter
(Whatman) berukuran pori 0,45 μm; diameter 47 mm dengan
bantuan pompa vakum, selanjutnya di udarakan dengan
 44

ultrasonikator selama 15 menit. Pencampuran kedua komponen

fase gerak di lakukan dengan teknik elusi isokratik antara asam
asetat glasial p.a 2% dan metanol pro KCKT.

3. Penyiapan sampel
Sebanyak 0,5 mL plasma yang mengandung kurkumin dengan
konsentrasi tertentu dimasukkan ke dalam tabung sentrifus.
Selanjutnya, ditambahkan 40 µL baku dalam Etinil Estradiol (100
µg/mL) dan dikocok menggunakan vortex selama 30 detik. Lalu
dilakukan penambahan larutan pengekstrak sebanyak 2,0 mL dan
dikocok dengan vortex kembali selama 3 menit dilanjutkan dengan
sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Setelah itu,
sebanyak 1,0 mL lapisan organik diambil dan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi. Sebanyak 20 µL aliquot disuntikkan ke dalam KCKT
dengan kondisi analisis.

4. Optimasi metode kromatografi cair kinerja tinggi

a. Penentuan panjang gelombang untuk deteksi
Sebanyak 40; 100 dan 160 µl larutan baku kurkumin 100
µg/mL diencerkan dengan metanol pH 4 dalam labu takar 10,0
ml sampai tanda sehingga diperoleh konsentrasi 0,4; 1,0 dan
1,6 µg/mL. Dari kadar baku kurkumin tersebut dilakukan
pengukuran absorbansi pada rentang panjang gelombang 300-
500 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Kemudian
dari spektrum yang dihasilkan tersebut ditentukan panjang
gelombang maksimumnya. Nilai panjang gelombang
maksimum yang diperoleh selanjutnya digunakan sebagai
panjang gelombang deteksi pada sistem KCKT.
b. Pemilihan komposisi fase gerak
 45

Pemilihan komposisi fase gerak dimulai dari komposisi fase

gerak optimum yang telah digunakan pada penelitian validasi
metode penetapan kadar kurkumin dalam sediaan cair OHT
(10), dimulai dengan campuran fase gerak metanol pro KCKT
dan asetat glasial p.a 2% (90:10) sebagai kondisi awal.
Selanjutnya dilakukan variasi komposisi fase gerak sebagai
berikut:
1) Metanol pro KCKT dan asetat glasial p.a 2% (85:15)
2) Metanol pro KCKT dan asetat glasial p.a 2% (95:5)
Kemudian dicatat waktu retensi (tR), dihitung faktor ikutan (Tf),
jumlah lempeng teoritis (N), dan HETP.
c. Pemilihan laju alir
Larutan yang mengandung kurkumin dengan konsentrasi 100
µg/mL dan baku dalam dengan konsentrasi 10 µg/mL
disiapkan. Selanjutnya disuntikkan ke dalam alat KCKT
sebanyak 20 µL aliquot menggunakan fase gerak terpilih. Laju
alir yang digunakan adalah 0,8 mL/menit kemudian
divariasikan menjadi 1,0 mL/menit dan 1,2 mL/menit.
Kemudian dicatat waktu retensi (tR), dihitung faktor ikutan
(Tf), jumlah lempeng teoritis (N), dan HETP.

5. Uji kesesuaian sistem

Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk mengetahui apakah alat,
metode, dan kondisi optimum yang telah ditetapkan dapat membentuk
satu sistem analisis tunggal.
Sejumlah 20 µL larutan baku kurkumin dan baku dalam diinjeksikan
sebanyak lima kali ke dalam kromatograf, Kemudian dicatat waktu
 46

retensi (tR), dihitung faktor ikutan (Tf), jumlah lempeng teoritis (N),
HETP, dan presisi pada lima kali penyuntikan.

6. Validasi metode bioanalisis kurkumin dalam plasma secara in vitro

a. Linearitas
1) Pembuatan larutan plasma blangko
Sebanyak 200µL plasma dimasukkan ke dalam tabung
eppendrof, ditambahkan 600 µL metanol ke dalam tabung
kemudian divortex selama 1 menit dan disentrifugasi
dengan kecepatan 3500rpm selama 20 menit.
2) Pembuatan larutan plasma zero
Sebanyak 10µL baku dalam dimasukkan ke dalam tabung
eppendrof, ditambah 190µL plasma dan ditambahkan 600
µL metanol ke dalam tabung kemudian divortex selama 1
menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 3500rpm selama
20 menit.
3) Pembuatan larutan seri kurkumin dalam plasma
Dimasukkan ke masing-masing tabung eppendrof larutan
seri kurkumin 0,1; 0,3; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 µL, kemudian
ditambahkan 10µL etinil estradiol 100µg/ml, ditambahkan
plasma sampai 200µL dan ditambahkan 600 µL metanol ke
dalam tabung kemudian divortex selama 1 menit dan
disentrifugasi dengan kecepatan 3500rpm selama 20 menit.
4) Penetapan linearitas
Sebanyak 20,0 µL aliquot masing-masing larutan tersebut
disuntikkan ke alat KCKT dengan kondisi analisis terpilih
Setelah itu regresi perbandingan luas puncak (y) terhadap
konsentrasi analit dalam plasma (x) dengan persamaan (y
 47

= a + bx) dari masing-masing konsentrasi dianalisis dan

disiapkan kurva kalibrasinya.

b. Batas kuantitasi terendah / Lower Limit Of Quantification LLOQ

Larutan kurkumin dalam plasma dibuat dengan konsentrasi
bertingkat dengan penambahan baku dalam (100 µg/ml), kemudian
masing- masing larutan diekstraksi sesuai dengan cara penyiapan
sampel. Sebanyak 20,0 µL aliquot disuntikkan ke alat KCKT
dengan kondisi analisis terpilih.
Di dapatkan Cmax dari kurkumin dengan dosis 10gram dan 12
gram sebesar (mean±standar error) 2,30±0,26 µg/mL.dan
1,73±0,19 µg/mL (33). Selanjutnya, larutan kurkumin dalam
plasma dibuat dengan konsentrasi seperdua puluh dari nilai Cmax
literatur tersebut. Sebanyak 20,0 µL aliquot hasil ekstraksi
disuntikkan ke alat KCKT. Dari data pengukuran kemudian
dihitung nilai % diff dan koefisien variasinya (KV). LLOQ adalah
kondisi terendah yang menunjukkan akurasi (nilai % diff) tidak
lebih dari 20%, serta presisi (koefisien variasi) tidak lebih dari
20%.

c. Uji akurasi, presisi dan perolehan kembali

1) Pembuatan larutan seri kurkumin dalam plasma
Larutan kurkumin dalam plasma konsentrasi QCL (
Quality Control of Low Concentration), QCM ( Quality
Control of Medium Concentration), dan QCH ( Quality
Control of Hogh Concentration), dimasukkan ke dalam
masinng – masing tabung, disiapkan dengan penambahan
baku dalam 100 µg/ml dan plasma sampai 200µL.
Ekstraksi dilakukan seperti pada cara penyiapan sampel.
 48

2) Penetapan presisi, akurasi dan perolehan kembali

Sebanyak 20,0 µL aliquot disuntikkan ke alat KCKT
dengan kondisi analisis terpilih. Prosedur tersebut diulang
sebanyak lima kali untuk masing-masing konsentrasi.
Presisi dihitung sebagai nilai SBR dari masing-masing
konsentrasi. Akurasi dihitung sebagai nilai % kesalahan
dan dihitung nilai perolehan kembali.

d. Uji selektivitas
Plasma yang mengandung kurkumin pada konsentrasi LLOQ
disiapkan menggunakan enam plasma dari sumber yang berbeda.
Selanjutnya dilakukan ekstraksi seperti pada cara penyiapan
sampel. Sebanyak 20,0 µL disuntikkan ke alat KCKT dengan
kondisi analisis terpilih Ada atau tidaknya gangguan (interferensi)
ekstrak plasma di sekitar waktu retensi kurkumin dan baku dalam
diamati, kemudian dihitung nilai presisi (koefisien variasi) dan
akurasinya (%diff).

e. Uji stabilitas
1) Stabilitas larutan stok
Larutan stok kurkumin dengan konsentrasi 5 µg/mL dan
larutan baku dalam dengan konsentrasi 5 µg/mL.
Kemudian larutan disimpan pada suhu kamar dengan rentang
waktu 0, 6, dan 24 jam. Sebagian larutan disimpan pada
lemari pendingin (suhu 4°C) dengan rentang waktu selama
14 hari. Gejala ketidakstabilan zat dapat diamati dengan
menghitung % diff dan mengamati luas puncak
kromatogram. % diff dihitung dengan cara membandingkan
respon instrumen dari larutan stok yang telah disimpan
 49

terhadap larutan stok yang disiapkan sesaat sebelum

disuntikkan.
2) Stabilitas beku dan cair (freeze and thaw stability)
Larutan kurkumin dalam plasma disiapkan dengan
konsentrasi rendah dan tinggi, kemudian dilakukan tiga
siklus beku pada suhu -20°C dan cair pada suhu kamar (25-
30°C), kemudian ditambahkan baku dalam dan lakukan
ekstraksi seperti pada penyiapan sampel disuntikkan tiga
aliquot sebanyak 20,0 µL untuk masing-masing konsentrasi
ke alat KCKT dengan kondisi analisis terpilih. Gejala
ketidakstabilan zat dapat diamati dengan menghitung %
diff dan mengamati luas puncak kromatogram.
3) Stabilitas jangka pendek
Larutan kurkumin dalam plasma disiapkan dengan
konsentrasi rendah dan tinggi. Kemudian larutan disimpan
pada suhu kamar dengan rentang waktu 0, 6, dan 24 jam dan
lakukan ekstraksi seperti pada penyiapan sampel
disuntikkan tiga aliquot sebanyak 20,0 µL untuk masing-
masing konsentrasi ke alat KCKT dengan kondisi analisis
terpilih. Gejala ketidakstabilan zat dapat diamati dengan
menghitung % diff dan mengamati luas puncak
kromatogram.
4) Stabilitas jangka panjang
Larutan kurkumin dalam plasma disiapkan dengan
konsentrasi rendah dan tinggi. Selanjutnya larutan tersebut
disimpan pada lemari pendingin (-20 oC) selama penelitian
berlangsung. Pada hari ke 0, 7, dan 14, larutan dianalisis
dengan melakukan ekstraksi seperti pada cara penyiapan
sampel. Disuntikkan tiga aliquot sebanyak 20,0 µL untuk
 50

masing-masing konsentrasi ke alat KCKT dengan kondisi

analisis terpilih. Gejala ketidakstabilan zat dapat diamati
dengan menghitung % diff dan mengamati luas puncak
kromatogram.

7. Penetapan kadar kurkumin

Kadar sampel dihitung dengan rumus :
Au x Cbp
Cu =
Abp
Dimana,
CU = Konsentrasi larutan uji
CBP = Konsentrasi larutan baku pembanding
AU = Luas puncak larutan uji
ABP = Luas puncak larutan baku pembanding