BAB III

METODEOLOGI PERCOBAAN

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat

Adapun alat yang digunakan pada percobaan ini adalah

alat-alat untuk pembuatan serbuk instan yaitu pisau, blender,

pisau, saringan, baskom, pengaduk, wajan, kompor, ayakan,

plastik, sendok dan timbangan. Sedangkan alat-alat untuk

keperluan analisis yaitu cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer,

inkubator, timbangan ohaus, mikropipet 1 ml, autoklaf,

waterbathmagnetic stirre.

III.1.2 Bahan

Adapun bahan yang digunakan pada percobaan ini

adalah temu mangga (Curcuma mangga Val.), daun anting-

anting (Acalypha indica L.) dalam keadaan segar, gula pasir

dan air akuades. Penyiapan bahan meliputi, pengumpulan

bahan, pembersihan dan penggerusan dengan menggunakan

blender, penyaringan, pemanasan dengan penambahan gula

pasir sehingga menjadi serbuk instan. Bahan-bahan kimia yang

digunakan dalan penelitian ini adalah akuades, kertas saring

Whatman no. 42, asam tanat, asam galat, pereaksi Folin

Ciocalteu, etanol 96%, etanol absolute,

 Na2CO3 7.5%, Na2CO3 jenuh dan larutan DPPH 0.2 Mm

dalam etanol 96%, Escherichia coli (Laboratorium Mikrobiologi,

Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Udayana), natrium

sulfat anhidrat, aseton, Brain Heart Infusion (BHI) dan Mueller

Hinton (MH).

III.2 Prosedur Kerja

A. Penyiapan Sampel

1. Dikumpulkan Sebanyak 1 kg temu mangga (Curcuma mangga

Val.) dan 1 kg daun anting-anting (Acalypha indica L.)

2. Dibersihkan dari kotoran yang menempel, dicuci dengan air

mengalir

B. Pembuatan Serbuk Instan melalui Proses Kristalisasi

1. Penghalusan

a) Disiapkan alat dan bahan

b) Dicuci besih Temu mangga (Curcuma mangga Val.) dan

daun anting-anting (Acalypha indica L.)

c) Dihaluskan dengan menggunakan blender hingga menjadi

bubur dengan ditambahkan air selanjutnya disaring dengan

menggunakan kain kasa steril.

2. Pemasakan/kristalisasi

a) Disiapkan Alat dan bahan

 b) Dikristallisasi atau dipanaskan daun temu mangga (Curcuma

mangga Val.) dan daun anting-anting (Acalypha indica L.)

dengan api kecil atau dengan suhu dibawah 100 Derajat

Cellcius

c) Ditambahkan gula pasir sebanyak 1 kg dan diaduk terus

menerus sampai terbentuk kristal

d) Dihancurkan kristal yang telah di dapat kemudian disaring

untuk mendapatkan serbuk instan kombinasi temu mangga

(Curcuma mangga Val.) dan daun anting-anting (Acalypha

indica L.) yang halus dan seragam.

3. Pengeringan dan Pengayaan

a) Dikeringkan serbuk yang telah dihancurkan dan diayak

hingga diperoleh serbuk instan yang benar-benar lembut.

b) Dikemas dalam kantong plastik atau toples.

4. Tahap Formulasi Serbuk Instan Kombinasi Temu Mangga

(Curcuma mangga Val.)

dan Daun Anting-anting (Acalypha indicaL.)

a) Disiapkan alat dan bahan

b) Difomulasi serbuk instan

c) dilakukan analisis uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri

Escherichia coli.
C. Uji Aktivitas antibakteri

a) Pembuatan Nutrient Agar (NA)

1) Disiapkan alat dan bahan

2) Ditimbang Nutrien agar sebanyak 5,75 gram

3) ditambahkan 250 mL akuades.

4) Dipanaskan suspensi sampai agar-agar menjadi matang.

5) Dimasukkan nutrient agar ke dalam tabung reaksi ± 10 mL.

6) Disterilkan dengan autoclave pada temperatur 121oC selama

15 menit.

b) Pembuatan Nutrient Broth (NB)

1) Ditimbang Nutrien broth sebanyak 2,6 gram.

2) Ditambhkan sebanyak 200 mL akuades

3) Dipanaskan suspensi ini sampai nutrient broth menjadi

matang.

4) Dimasukkan natrium broth ke dalam tabung reaksi ± 3-5 mL

5) Disterilkan dengan autoclave pada temperatur 121oC selama

15 menit.

c) Isolasi Mikroba

1) Disiapkan alat dan bahan

2) Diambil biakan bakteri dariisolat (stok kultur bakteri) yang

tersedia di Laboratorium Mikrobiologi dengan menggunakan

alat ose
 3) diinkubasi pada inkubator pada suhu 37 oC selama 24 jam.

d) Pembuatan Suspensi Bakteri

1) Diinkubasi Sebanyak satu ose bikan murni bakteri uji dalam

mdia nutrient broth (NB) sebanyk 50 mL

2) dimasukkan ke dalm erlenmeyer. Biakan ini kemudian

diinkubasi pada temperatur 37 oC selama 24 jam

3) biakan dapat digunakan dalam uji antibakteri.

e) Uji Aktivitas Antibakteri

1) Disiapkan alat dan bahan

2) Ditambahkan dengan 1 mL suspensi bakteri pada cawan petri

3) masukkan nutrien agar (NA) sebanyak 15 mL yang

sudah dicairkan pada temperatur 40-44oC

4) Digoyangkan Cawan petri secara simultan untuk memperoleh

suspensi bakteri yang homogen pada permukaan media

nutrien agar.

5) Dilubangi media agar yang telah disemaikan dengan bakteri

penguji.

Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi

sumur (modifikasi Kirby Bauer). Masing-masing sampel.

6) Dibuat dengan konsentrasi 20%, 40%, 60%, 80%, dan 100%

dimasukkan

kedalam masing-masing lubang sebanyak 20 L

7) Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC dan sebagai

kontrol digunakan pelarutnya.