ACTIVIDAD 2: Determinación del efecto de la temperatura en

la velocidad de Reacción.

PROCECIMIENTO:
1º. Rotulamos las cubetas en la parte superior (0ºC, 22 ºC y 37ºC)

2º. Pipeteamos 500µl de la solución de parada y lo llevamos a cada una de las

cubetas rotuladas.

3º. Etiquetamos 3 tubos de centrífuga con las temperaturas

correspondientes con una pipeta Pasteur limpia llevamos 250 µl de la enzima a
cada uno de los tubos.
4º. Etiquetamos 3 tubos de centrífuga y llevamos 500µl de sustrato 1,5mM a
cada uno de los tubos rotulados. Llevamos los tubos de 0º C de enzima y
sustrato a un baño de hielo, los tubos de 22º C de enzima y sustrato los
dejamos a temperatura ambiente en una gradilla y los tubos de 37º C de
enzima y sustrato los llevamos a un baño a 37ºC.
Dejamos que alcancen la temperatura especificada durante al menos 5
minutos.

5º. Usando una pipeta Pasteur limpia, pipeteamos 250µl del tubo de 0º C del
enzima y lo llevamos al tubo del sustrato; situamos el nuevo tubo en un
recipiente con hielo. Realizamos la misma operación para el tubo de 22º C y de
37º C. Posteriormente cronometramos que reaccionen durante dos minutos.

6º. Pasados dos minutos, usando una pipeta Pasteur limpia, para cada reacción
transferimos 500µl de la mezcla de S+E y lo llevamos al tubo que contiene la
solución de parada. Dejamos reaccionar durante 5 min.
7º. Procedemos al análisis de las muestras. Finalmente enjuagamos las
cubetas y las pipetas Pasteur con bastante agua y las guardamos para
posteriores actividades.

MATERIALES:
1,5mM sustrato
Enzima
Solución paro
4 pipetas Pasteur
Indicador colorimétrico
6 tubos de micro centrifugado
3 cubetas
Un recipiente con hielo
Un baño a 37º C
Un termómetro
Frasco lavador
Cronómetro
Espectrofotómetro

ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO A DIFERENTES TEMPERATURAS.

1º. Deberíamos tener 5 cubetas del estándar S1-S5 (patrones
colorimétricos realizados en la actividad 1).
Comparamos los ensayos anteriores con los patrones y relacionamos cuales
son semejantes.

2º. Hacemos una tabla con las temperaturas, el estándar que más se le
parece, y la concentración del patrón.
Temperatura Patrón similar Concentración del
patrón
0º C
22º C
37º C

ANÁLISIS CUALITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO A DIFERENTES TEMPERATURAS.

1º. Hacemos un blanco en el espectrofotómetro con el estándar S1 a 410nm
y medimos la absorbancia de las 3 muestras.

2º. Hacemos una tabla con los resultados.

Temperatura Absorbancia a 410 nm. Concentración del
patrón
0ºC
 22ºC
37º C

ANÁLISIS DEL RESULTADO.

1º. Calculamos la velocidad de reacción a cada una de las diferentes
temperaturas. Como sólo se puede medir una cantidad de patrón a los dos
minutos, asumimos que la cantidad de patrón es de 0 nM.

CÁLCULOS.
PRODUCCIÓN INICIAL A 0º C = nmol/min
PRODUCCIÓN INICIAL A 22º C = nmol/min
PRODUCCIÓN INICIAL A 37º C = nmol/min

Representamos gráficamente la velocidad de reacción enzimática.

CUESTIONES.
1. Cómo puedes determinar la velocidad de reacción inicial para cada
temperatura?
2. A que temperatura crees que la enzima trabaja mejor y cómo has
llegado a esta conclusión?
3. Porqué las reacciones ocurren más rápido a altas temperaturas?
4. Porqué las reacciones ocurren más despacio a temperaturas bajas?
5. Porqué la actividad enzimática se detiene a temperaturas
extremadamente altas?
6. Si tu fueras un científico que quiere usar esta enzima para producir
glucosa, a qué temperatura debería realizar la reacción?
7. En qué tipo de entorno puede vivir un organismo que produce esta
enzima. Explica tu respuesta.

CUESTIONES DE DESAFÍO:
1. Qué tipos de enlace de la estructura terciaria de la enzima se rompen
a altas temperaturas y cuáles no?
2. Enlaces covalentes entre los grupos –R ocurren entre qué aminoácidos?
3. Cuál sería una desventaja de usar la temperatura más alta que el
rendimiento más rápido que la tasa de deformación de producto?