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Actividad 3: DETERMINAR EL EFECTO DEL PH EN LA

VELOCIDAD DE REACCIÓN
Una de las maneras que las enzimas interactúan con sus sustratos es por grupos de
carga, una molécula atrae a los grupos con carga opuesta de la otra molécula. Sin
embargo, si el pH del sustrato y la enzima se ve es cambiado, es posible que los grupos
de carga positiva y negativa puedan cambiar o perder su carga. No sólo es posible para
el pH a afectar a la enzima, también puede afectar el sustrato. El resultado neto de esto
es que la enzima y el sustrato ya no interactúan de manera óptima. Las enzimas que
están presentes en el estómago, por ejemplo, están optimizados para trabajar con valores
de pH bajo en torno a pH 3 (condiciones de acidez), mientras que las enzimas
pancreáticas que se secretan en el intestino pequeño sólo funcionan en punto muerto a
las condiciones básicas (pH 7.2 a 9.0).

Material de trabajo Cantidad Afirmativo


3,0 mM de substrato 1
Enzima 1
Solución de parada 1
Colorimétro en cubetas de 1 de cada
la activ.1
Tubos de 1,5mL 1 de cada
(con la etiqueta "pH 5.0",
"pH 6.3", y "pH 8.6")

Micropipetas 4
Cubetas 3
Marcador 1
Vaso con agua destilada 1
Cronómetro 1
Espectrofotómetro 1

Nota: La concentración del sustrato utilizado en esta actividad es diferente de la


utilizada en las actividades anteriores. El sustrato debe utilizar 3.0 milímetros para dar
cuenta del paso de dilución que se produce cuando se agrega los topes de ajuste del pH.

Protocolo

1. Etiquetar las cubetas en la parte superior con "pH 5.0", "pH 6.3", y "pH 8.6".

Etiquetar
2. Con una µpipeta echar 500 µl de la solución en cada cubeta.

Solución parada pH 5.0 pH 6.3 pH 8.6

3. Con una µpipeta echar 250µl de sustrato 3 mM en cada una de los tubos con "pH
5.0", "pH 6.3", y "pH 8.6".

3.0 mM substrato pH 5.0 pH 6.3 pH 8.6

4. Con otra µpipeta añadir 250µl de enzima en cada uno de los tubos anteriores.
Comienza a cronometrar.

Encima pH 5.0 pH 6.3 pH 8.6


5. Después de 2 minutos, con una µpipeta limpia, echar 500µl del tubo de pH 5.0 a la
cubeta de pH 5.0 y así con todos.

pH 5.0 pH 5.0 pH 6.3 pH 6.3 pH 8.6 pH 8.6

6. Después de que todas las muestras han sido analizadas, enjuague la µpipeta y las
cubetas utilizadas en esta actividad con grandes cantidades de agua y guardarlas para
futuras actividades.

Nota: No deseche las soluciones madre no utilizadas o cubetas. Se utilizarán para la


próxima actividad.

El análisis cualitativo de la cantidad de producto formado en diferentes niveles de pH


1. Usted debe tener cinco cubetas de las normas de etiquetado S1-S5 en su mesa de
laboratorio.
Tome su pH 5.0, pH 6.3 y pH 8 y tome nota del número estándar de cada color. Anote
la concentración de dicha norma (de la Tabla 8) en la tabla 9 para cada una de sus
muestras de reacción del pH.

Tabla 8. p-nitrofenol normas.

Patrón Cantidad de p-nitrofenol (nmol *)


S1 0
S2 12.5
S3 25
S4 50
S5 100

*1 nmol = 1 nanomol = 1 x 10–9 mol = 0.000000001 mol


Tabla 9. Determinación de p-nitrofenol producido en tres diferentes valores de pH
basado en las normas p-nitrofenol.

Cantidad de p-nitrofenol
pH Patrón más parecida producidos (nmol)

pH 5.0
pH 6.3
pH 8.6

2. Si usted no tiene un espectrofotómetro, vaya directamente al análisis de los


resultados.

El análisis cuantitativo de la cantidad de producto formado en diferentes niveles de


pH
1. Hacer el blanco en el espectrofotómetro con la norma S1 a 410 nm, y luego medir los
valores de absorbancia de las tres cubetas. Registro de los valores de absorbancia en el
tabla 10.

2. Siguiendo el mismo protocolo utilizado en la Actividad 1, convertir la cantidad de


producto de unidades de absorbancia en el espectrofotómetro a las unidades de
concentración (nmol). Llene estos valores en la tercera columna de la tabla 10.

Tabla 10. Determinación de p-nitrofenol producido en tres diferentes valores de


pH sobre la base de una curva estándar (similar a la que se muestra en la Figura
8).

pH Absorbancia a 410nm Cantidad de p-nitrofenol producidos (nmol)

pH 5.0
pH 6.3
pH 8.6

Análisis de los Resultados

1. Calcular la velocidad inicial de reacción en cada uno de los tres niveles de pH


diferentes. Ya que sólo mide la cantidad de p-nitrofenol en un momento
determinado (2 minutos), se supone que la cantidad de p-nitrofenol en 0 minutos

Ejemplo: Después de 2 minutos, el pH 6.3 de la muestra dio una lectura de 0,14,


de absorbancia a 410nm, que parecía muy similar a S2 estándar.
Cualitativamente (utilizando las normas), esto significa que usted tiene ~ 12,5
nmol de p-nitrofenol. Cuantitativamente, se utiliza la curva estándar de la
Actividad 1 para determinar la cantidad de p-nitrofenol con una absorbancia de
0,14 corresponde a ~ 9 nmol.

La tasa inicial de los datos cualitativos = (12,5 nmol - 0 nmol) / (2 min - 0 min)
= ~ 6 nmol / min.

La tasa inicial de los datos cuantitativos = (9 nmol - 0 nmol) / (2 min - 0 min) =


4,5 nmol / min.

Realizar estos cálculos para los datos

Tasa inicial de formación de producto a pH 5,0 =________________________


nmol / min

Tasa inicial de formación de producto a un pH de 6,3


=________________________ nmol / min

Tasa inicial de formación de producto a pH 8,6 =________________________


nmol / min

2. Trazar el efecto del pH en la velocidad de la reacción enzimática.