JURNAL ILMU KESEHATAN KELAUTAN

METHYLPREDNISOLONE MENETRALKAN EFEK YANG

MENGUNTUNGKAN DARI ERYTHROPOIETIN PADA
EKSPERIMENTAL CEDERA MEDULLA SPINALIS

Pembimbing :
dr. Ni Komang sp. S, M.Kes

Penyusun :
Anggita Kusuma Maudi Siregar
20150420051

LEMBAGA KESEHATAN ANGKATAN LAUT

Drs. Med. R. Rijadi Sastropanoelar., Phys.
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS HANG TUAH
SURABAYA
2019
 LEMBAR PENGESAHAN
JURNAL
METHYLPREDNISOLONE MENETRALKAN EFEK YANG
MENGUNTUNGKAN DARI ERYTHROPOIETIN PADA
EKSPERIMENTAL CEDERA MEDULLA SPINALIS

Jurnal yang berjudul “Methylprednisolone menetralkan efek yeng

menguntungkan dari erythropoietin pada eksperimental cedera medulla
spinalis” telah diperiksa dan disetujui sebagai salah satu tugas dalam
menyelesaikan studi kepaniteraan klinik Dokter Muda di bagian ilmu
Kesehatan Kelautan

Surabaya, 16 Desember 2019

Pembimbing,

dr. Ni Komang sp. S , M.Kes

1
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa karena atas
berkah dan rahmatNya, kami bisa menyelesaikan jurnal dengan judul
“Methylprednisolone menetralkan efek yeng menguntungkan dari
erythropoietin pada eksperimental cedera medulla spinalis” dengan lancar.
Jurnal ini disusun sebagai salah satu tugas wajib untuk menyelesaikan
kepaniteraan klinik di bagian LAKESLA Drs Med R.Rijadi S., Phys.
Surabaya dengan harapan dapat dijadikan sebagai tambahan ilmu yang
bermanfaat bagi pengetahuan penulis maupun pembaca.
Dalam penulisan dan penyusunan referat ini tidak lepas dari
bantuan dan dukungan berbagai pihak, untuk itu kami mengucapkan
terima kasih kepada:
a. dr. Ni Komang sp. S, M.Kes
b. Para dokter di bagian LAKESLA Drs. Med. R. Rijadi
Sastropanoelar., Phys. Surabaya.
c. Para perawat dan pegawai di LAKESLA Drs. Med. R. Rijadi
Sastropanoelar., Phys.Surabaya.
Kami menyadari bahwa referat yang kami susun ini masih jauh dari
kesempurnaan, maka saran dan kritik yang membangun dari semua pihak
sangat diharapkan. Semoga referat ini dapat memberi manfaat.

Surabaya, 16 Desember 2019

Penyusun

2
 METHYLPREDNISOLONE MENETRALKAN EFEK YANG
MENGUNTUNGKAN DARI ERYTHROPOIETIN PADA
EKSPERIMENTAL CEDERA MEDULLA SPINALIS
Peradangan memainkan peran patologis utama dalam cedera
tulang belakang (SCI). Meskipun pengobatan antiinflamasi menggunakan
glucocorticoid methyprednisolone sodium succinate (MPSS)
meningkatkan hasil dalam beberapa uji klinis multicenter, pengalaman
klinis tambahan menunjukkan bahwa MPSS hanya bermanfaat secara
kecil pada SCI dan menimbulkan risiko komplikasi serius. Penelitian
terbaru menunjukkan bahwa erythropoietin (EPO) memoderasi cedera
jaringan SSP, dengan mengurangi peradangan, membatasi apoptosis
neuron, dan mengembalikan autoregulasi vaskular. Kami menentukan
apakah EPO dan MPSS bertindak sinergis dalam SCI. Menggunakan
model tikus dari SCI kontusif, kami membandingkan efek EPO [500-5.000
unit / kg berat badan (kg-bb)] dengan MPSS (30 mg / kg-bb) untuk
produksi sitokin proinflamasi, kerusakan histologis, dan fungsi motorik
pada 1 bulan setelah cedera terkompresi. Meskipun EPO dan MPSS dosis
tinggi menekan sitokin proinflamasi dalam sumsum tulang belakang yang
cedera, hanya EPO yang dikaitkan dengan infiltrasi mikroglial yang
berkurang, pembentukan bekas luka yang dilemahkan, dan peningkatan
neurologis yang berkelanjutan. Tanpa diduga, pemberian bersama MPSS
memusuhi efek perlindungan EPO, meskipun reseptor EPO diatur secara
normal setelah cedera. Data ini menggambarkan bahwa penekanan
sitokin proinflamasi saja tidak serta merta mencegah cedera sekunder dan
menyarankan bahwa glukokortikoid tidak boleh digunakan bersama dalam
uji klinis saat mengevaluasi penggunaan EPO untuk pengobatan SCI dan
perbaikan neurologis yang berkelanjutan

Biaya emosional dan ekonomi dari cedera tulang belakang (SCI)

besar, terutama untuk perawatan jangka panjang yang diperlukan oleh
kecacatan yang mendalam. Meskipun ada beberapa pendekatan
terapeutik yang menargetkan aspek-aspek berbeda dari kaskade
patofisiologis yang berkontribusi terhadap SCI, belum ada kemajuan besar

3
dalam perawatan klinis yang secara andal mengurangi cedera atau
mengembalikan fungsi. Meskipun data klinis awal menunjukkan bahwa
pengobatan menggunakan MPSS dalam waktu 8 jam dari cedera
memberikan manfaat ( 1 ), konsensus saat ini adalah bahwa MPSS
menawarkan, paling baik, peningkatan terbatas dan sebenarnya dapat
menyebabkan kerusakan, misalnya miopati kortikosteroid akut ( 2 ) atau
infeksi ( 3 , 4), terutama pada pasien berisiko tinggi. Meskipun ada janji
besar untuk potensi penggunaan transplantasi sel induk, banyak
pekerjaan praklinis tambahan diperlukan sebelum pindah ke uji klinis
(ditinjau oleh Kulbatski et al. Dalam ref. 5 ). Jelas, alternatif terapi lain
pantas eksplorasi saat ini.

Dari perspektif patofisiologis, SCI secara historis telah dibagi

menjadi dua fase yang berbeda. Cedera primer (mekanis) secara
langsung mengganggu jaringan tetapi, pada fase akut, seringkali hanya
menyebabkan kematian sel yang terbatas di sekitar episenter lesi. Namun,
peradangan hebat yang dimulai sebagai respons terhadap cedera primer
kemudian menyebabkan demielinisasi yang luas, edema jaringan, dan
kehilangan sel yang ireversibel (ditinjau oleh Kwon dalam ref. 6). Sebagai
respons umum terhadap cedera serius, aksis hipotalamus-adrenal
diaktifkan, dan kortisol endogen dikeluarkan untuk berpotensi
mengendalikan peradangan yang merusak berlebihan. Sebagai pengganti
kortisol, methyprednisolone sodium succinate (MPSS) glukokortikoid
sintetik melemahkan kerusakan sumsum tulang belakang dalam model
praklinis dengan mengurangi peroksidasi lipid yang dihasilkan oleh radikal
bebas dan spesies oksigen reaktif yang dihasilkan oleh metabolisme
seluler, terutama dalam lingkungan iskemia yang diikuti oleh reperfusi ( 7).
). MPSS juga telah dilaporkan mengurangi produksi sitokin proinflamasi
dan edema jaringan ( 8 ), aktivitas nitrat oksida sintase yang dapat
diinduksi, apoptosis neuron ( 9)), pembentukan radikal bebas, dan
pelepasan asam amino rangsang dan molekul vasoaktif dan juga
memberikan modulasi menguntungkan kalsium dan fluks transelular
natrium.

4
 Namun, ada beberapa masalah yang belum terselesaikan dengan
pertimbangan MPSS untuk perawatan SCI. Misalnya, pada kucing,
respons dosis yang diamati adalah kurva berbentuk U terbalik, dengan
dosis yang lebih tinggi (misalnya, 60 mg / kg) menjadi tidak efektif (ditinjau
oleh Hall dan Springer dalam ref. 10 ). Spesies lain, misalnya, tikus,
kurang mendapat perhatian, tetapi hasilnya menunjukkan hasil yang
berbeda, dengan hanya sedikit peluang untuk mengurangi cedera jaringan
dan tanpa perbaikan dalam hasil motorik ( 11 ). Efek merugikan tambahan
dari glukokortikoid telah didokumentasikan dengan jelas, termasuk
potensiasi iskemik ( 12 ) dan inflamasi ( 13 ) cedera saraf dan penekanan
kuat faktor neurotropik, misalnya faktor neurotropik turunan glial ( 12 ).14).

Sitokin erythropoietin (EPO) (sebelumnya dikenal karena efek

hormonalnya pada sumsum tulang), yang mempertahankan massa sel
darah merah yang memadai, juga berfungsi sebagai molekul yang sangat
kuat, molekul yang diproduksi secara lokal memperbaiki stres metabolik di
banyak jaringan (ditinjau oleh Brines dan Cerami dalam ref. 15 ).
Penelitian telah menunjukkan perlindungan kuat yang dimediasi EPO dari
sumsum tulang belakang dari iskemia pada kelinci ( 16 ) atau trauma
mekanis pada kelinci, tikus, dan tikus ( 17 - 19 ). EPO memediasi
perlindungan jaringan melalui berbagai jalur yang berinteraksi (ditinjau
oleh Ghezzi dan Brines dalam ref. 20 ), termasuk pengurangan kematian
sel apoptosis dan peningkatan reaktif dalam sitokin proinflamasi ( 21).),
mobilisasi sel progenitor endotel, promosi angiogenesis ( 22 ) dan
penyembuhan ( 23 ), pemulihan autoregulasi vaskular ( 24 - 26 ), dan
pengurangan peroksidasi lipid ( 19 ).

Meskipun perlindungan yang nyata dari SCI oleh EPO telah

diamati, lebih banyak yang perlu dipelajari tentang jendela terapi, tempat
pemberian yang optimal, dan karakteristik mulai dosis. Untuk
mengantisipasi studi EPO dalam uji klinis manusia, kami menilai
parameter ini menggunakan model cedera mekanik yang jelas pada tikus.
Karena penggunaan klinis MPSS saat ini di SCI, kami juga mengevaluasi
efek dari senyawa ini dengan tidak adanya atau adanya EPO,

5
menentukan luasnya cedera anatomi, fungsi motor belakang belakang 1
bulan setelah cedera, dan konsentrasi sitokin proinflamasi kunci yang
mediator penting cedera sekunder dalam sumsum tulang belakang.

Berbagai terapi temporal dan dosis untuk EPO diamati, dan,

meskipun kedua agen mengurangi produksi sitokin proinflamasi setara,
MPSS benar-benar tidak efektif dalam mencegah cedera sekunder. Tanpa
diduga, pemberian bersama MPSS dengan EPO mengakibatkan
hilangnya perlindungan jaringan yang dimediasi EPO, meskipun tingkat
sitokin proinflamasi sepenuhnya ditekan.

Bahan dan metode

Binatang. Tikus Sprague-Dawley dewasa (Laboratorium Charles River)

dengan berat 240-260 g digunakan. Hewan dipelihara dalam kondisi
perumahan standar (22 ± 2 ° C, kelembaban 65%, dan lampu dari 6:00
pagi sampai 8:00 malam) dan diberi makan makanan kering standar; air
tersedia ad libitum. Semua protokol eksperimental telah disetujui oleh
Komite Peninjauan Hewan dari Universitas Milan dan Institut Kenneth S.
Warren dan memenuhi pedoman Italia untuk hewan laboratorium [yang
sesuai dengan Arahan Masyarakat Eropa November, 1986 (86/609 / EEC)
dan yang Panduan untuk Perawatan dan Penggunaan Laboratorium
Hewan , Dewan Riset Nasional].

Tingkat EPO serum. Untuk menentukan farmakokinetik, hewan diinjeksi

dengan rekombinan manusia (rh) EPO (Dragon Pharmaceuticals,
Vancouver, BC, Kanada) pada dosis dan rute yang ditunjukkan dalam
teks. Sampel serum ditarik secara seri melalui vena ekor dan konsentrasi
EPO manusia ditentukan dengan menggunakan ELISA yang tidak
bereaksi silang dengan tikus EPO (Quantiquine, R & D Systems).

SCI dengan UTS-Impactor dan Perawatan Obat. SCI traumatis

dilakukan dengan menggunakan UTS-impactor, yang sepenuhnya
dijelaskan dalam informasi pendukung untuk ref. 17. Inti tubrukan UTS
adalah batang baja stainless berdiameter akhir 2,3 mm yang digerakkan

6
dengan tepat ke sumsum tulang belakang dengan gaya dan perpindahan
tertentu. Gerakan dan tumbukan dipantau dengan menggunakan
dinamometer piezoelektrik miniatur yang ada di dalam bagian batang dan
dihubungkan ke komputer yang lalu menggerakkan perangkat dan
merekam serta mengelola data. Piston yang menyita ditempatkan 1 mm di
atas kabel yang terbuka di T9 dan ditetapkan untuk perjalanan 3 mm.
Gaya 1 Newton selama 1 detik diterapkan, diikuti oleh kembalinya
otomatis batang impaksi. Hewan dipelihara dengan anestesi halotan dan
diposisikan di atas tikar yang disimpan pada suhu 38 ° C dan, sebelum
bangun, dirawat dengan buprenorfin [0,03 mg / kg berat badan (kg-bb)]
untuk rasa sakit dan penisilin G (10.000 unit / kg-bb) sebagai agen
antimikroba. Setiap kelompok eksperimen berisi setidaknya 18 hewan.
Setelah SCI, tikus ditempatkan dua per kandang dan menjalani evakuasi
kandung kemih manual tiga kali sehari. rhEPO (Epoietin Alpha, Ortho
Biotech, Milan) diberikan sebagai pengobatan tunggal dalam waktu 30
menit setelah cedera. Methylprednisolone sodium succinate (Sigma)
diberikan dengan dosis 30 mg / kg-bb dengan injeksi ip. Khususnya, dosis
60 mg / kg terbukti mematikan, membunuh semua hewan yang dirawat (n
= 8) dalam minggu pertama setelah induksi SCI.

Penilaian Fungsional. Semua ukuran hasil diperoleh secara buta oleh

empat penyelidik dan dirata-rata. Fungsi neurologis dievaluasi pada 24
jam setelah cedera dan kemudian dua kali seminggu setelahnya, dengan
pengujian lapangan terbuka menggunakan metodologi Basso, Beattie,
dan Bresnahan ( 27 ).

Histologi dan Imunositokimia. Pada akhir periode percobaan, hewan

dibius dengan inhalasi halotan dan perfusi dengan paraformaldehyde 4%
dalam PBS isotonik pada pH 7,4 dengan perfusi transkartial. Sumsum
tulang belakang yang mencakup situs cedera penuh adalah postfixed (24
jam) dengan larutan yang mengandung paraformaldehyde yang sama,
dan segmen sumsum tulang belakang tertanam dalam parafin dan bagian
8-m dipotong secara transversal. Setiap bagian ke-20 diwarnai dengan
hematoxylin dan eosin. Satu potongan melintang yang mengandung

7
episenter lesi dan total kavitasi segmen T9 dianalisis dengan
menggunakan analisis gambar bantuan komputer ( NIH IMAGE, National
Institutes of Health, Bethesda) melalui kamera Leica DG 100 yang
dipasang pada mikroskop Leica). Luasnya kavitasi dihitung sebagai luas
jaringan yang terbelah dibagi dengan luas penampang total pada tingkat
cedera (lima per kelompok eksperimen). Bagian Vibratome (40 m) juga
dikumpulkan ke slide kaca dan diproses untuk imunositokimia. Antibodi
primer untuk protein asam glial fibrillary acid (GFAP) dan ED-1 (1: 500;
Chemicon) diaplikasikan semalam pada suhu 4 ° C dan diinkubasi selama
3 jam pada suhu kamar dengan antibodi anti-mouse kelinci terkonjugasi
FITC (Chemicon). Bagian Vibratome diinkubasi dengan antibodi poliklonal
menjadi EPO (H-162; 1: 300; Santa Cruz Biotechnology) dan diproses
sesuai dengan metode peroxidase-antiperoxidase.

ELISA sitokin. Pada waktu yang ditunjukkan, jaringan sumsum tulang

belakang dihomogenisasi dan disonikasi (Branson Sonifier 250) dalam
larutan buffer pH 7,4 yang mengandung 10 mM Tris, 0,032 mM sukrosa,
0,5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 mG / ml leupeptin, dan 10
μg / ml aprotinin. Pemrosesan dilakukan pada suhu 4 ° C. Protein
ditentukan oleh teknik Lowry-Ciocalteau ( 28 ). Konsentrasi jaringan
sitokin inflamasi [protein inflamasi makrofag (MIP) -2 (homolog manusia
IL-8), TNF-α, IL-6, dan IL-1β] diuji di lokasi cedera dengan menggunakan
kit ELISA tertentu (BioSource Eropa, Nivelles, Belgia) mengikuti instruksi
pabrik. Setidaknya enam hewan per kelompok dimasukkan untuk analisis.

Western Blotting. Protein dibuat dari jaringan sumsum tulang belakang

yang diperoleh dari rostral, lesi episentrum, dan daerah kaudal, dan
penentuan konsentrasi protein dilakukan sesuai dengan teknik Lowry-
Ciocalteau ( 28 ). Protein (75 μg) dipisahkan pada gel poliakrilamida 10%
dan dipindahkan ke membran nitroselulosa. Membran kemudian
diinkubasi dengan antibodi poliklonal yang diarahkan melawan reseptor
EPO (EPOR) (H-194; 1: 200, Santa Cruz Biotechnology) dan pita
divisualisasikan dengan menggunakan Kodak Image Station 440.

8
Analisis statistik. Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SD. Beberapa
kelompok perbandingan perbedaan dalam pengukuran kuantitatif dibuat
oleh ANOVA, diikuti oleh uji tDunnett (dua sisi). Signifikansi statistik
diterima untuk tingkat P <0,05.

Hasil

Tingkat EPO serum. Dosis 1.000 unit / kgbb rhEPO, diberikan melalui
vena ekor sebagai injeksi bolus, mencapai tingkat puncak ,02.070 ng / ml
pada titik sampel pertama (15 menit) dan meluruh perlahan setelahnya
( Gbr. 1 ). Sebaliknya, dosis ip 1.000 unit / kg-bb mencapai puncak ≈80 ng
/ ml sekitar 2 jam dan kemudian perlahan-lahan menurun. Dosis 500 unit /
kgbb iv memuncak pada ≈100 ng / ml, dan dosis 5.000 unit / kg-bw
melalui rute mana pun mencapai kadar serum yang sama hanya setelah
≈15 jam (data tidak ditunjukkan).

Fig. 1.Farmakokinetik rhEPO (5.000 unit / kg-bb) diberikan melalui rute iv

atau ip (rata-rata tiga hewan per kelompok).
Respon Peradangan di Epicenter Lesi. Pada awal, white matter
cells yang tersebar dan motoneuron piramidal besar diekspresikan EPO
( Gbr. 2 A ). Empat minggu setelah SCI, imunoreaktivitas EPO sangat
meningkat pada astrosit white matter, sedangkan neuron yang bertahan
tampak tidak berubah ( Gbr. 2 B ). Intensitas pewarnaan neuron dan
astrosit tampaknya tidak berubah setelah dosis ip 5.000 unit / kg-bw EPO

9
( Gbr. 2 B ). Pada Gambar. 2 C , bagian khas dari rongga posttraumatic
juga terlihat, dan ukurannya sangat berkurang oleh pengobatan EPO
( Gambar. 2 B ). Empat minggu setelah SCI, evaluasi kuantitatif
persentase jaringan yang dihindarkan di lesi episentrum menunjukkan
pengurangan yang signifikan dengan pengobatan EPO tetapi tidak jika
MPSS diterapkan sendiri atau sebagai tambahan EPO ( Tabel 1 ). Gliosis
dan pembentukan parut pasca trauma (data tidak ditampilkan) juga
dikurangi dengan pengobatan EPO. Pada medula spinalis normal, sel-sel
GFAP-positif sebagian besar terletak di sekitar kanal sentral dan hanya
sedikit terdistribusi dalam white matter ( Gbr. 3 AC ). Namun, setelah
cedera, banyak sel GFAP-positif hadir di seluruh white matter dan abu-
abu dan di sekitar kavitasi ( Gbr. 3 DF ). Pengobatan dengan rhEPO
(5.000 unit / kg bb per) gliosis sangat berkurang ( Gbr. 3 GI ) dan
perekrutan sel inflamasi ke dalam lokasi cedera: Jumlah sel yang
mengekspresikan ED-1 (yaitu, mikroglia) dalam episenter lesi setelah 7
hari secara nyata dikurangi dengan pengobatan EPO ( Gbr. 4 ).

Fig. 2.
Lokalisasi neuron dan astrosit pengekspresi EPO pada 4 minggu setelah
SCI pada bagian vibratome dari medulla spinalis pada rostral 3 mm dari
pusat situs lesi dengan teknik imunoperoksidase dari kontrol ( A ) dan
tikus yang dilesi dengan ( B ) atau tanpa ( C ) pengobatan rhEPO (5.000
unit / kg-bb). Pada tikus yang tidak berkeliaran hanya dikenakan
laminektomi, pelabelan positif diamati pada neuron di seluruh materi abu-

10
abu dan astrosit pada materi putih ( A ). Rongga posttraumatic (*) hadir
pada lesi di tikus yang diobati dengan saline. ( C ) Astrosit lebih ternoda
secara intensif, terutama pada kolom dorsal, sedangkan neuron tidak. ( B)
Pada tikus yang diobati dengan rhEPO, rongga berkurang nyata, dan
astrosit hyperexpress EPO.
Konsentrasi Sitokin Jaringan. Konsentrasi sitokin inflamasi sumsum
tulang belakang yang ditentukan oleh ELISA dalam episentrum lesi pada
1, 2, atau 7 hari setelah SCI ( Gambar 5 ) menunjukkan peningkatan
tergantung waktu setelah cedera, dengan MIP-2 (IL-8) meningkat secara
nyata pada yang pertama hari dan dipertahankan hingga 7 hari.
Pengobatan dengan MPSS atau EPO dikaitkan dengan penurunan
bertahap kadar MIP-2 yang dimulai 2 hari setelah SCI. MIP-2 adalah
sinyal rekrutmen untuk leukosit, dan evaluasi histologis pada hari ke 7 luar
biasa untuk hampir tidak adanya sel-sel inflamasi ini ( Gambar 4 ),
menunjukkan bahwa cedera sekunder juga akan berkurang.
TNF-α memuncak 2 hari dan kemudian sedikit menurun tetapi tetap
meningkat pada level yang jauh lebih tinggi, dibandingkan dengan kontrol,
setidaknya 7 hari setelah cedera. Baik administrasi EPO dan MPSS
mencegah peningkatan ini ( Gbr. 5 ). IL-6 juga memuncak dalam 2 hari
tetapi kemudian menurun dengan cepat. Baik EPO dan MPPS

11
Tabel 1.Persentase jaringan yang dihemat pada 4 minggu setelah SCI
mengurangi level IL-6 maksimum ke level kontrol. Peningkatan IL-
1β pascatrauma terjadi pada hari pertama dan diimbangi oleh kedua agen.
Pemulihan Fungsi Hindlimb. Pengujian locomotor lapangan terbuka
mengkonfirmasi studi sebelumnya yang menunjukkan bahwa dosis
tunggal EPO meningkatkan pemulihan fungsi belakang untuk setidaknya 4
minggu pasca cedera. Efek menguntungkan dari EPO (5.000 unit / kg-bw
ip), diberikan dalam 30 menit lesi, jelas antara 4 dan 8 hari setelah SCI
dan mencapai dataran tinggi antara 12 dan 16 hari ( Gbr. 6 Kiri ). Ketika
pengobatan ditunda 24 atau 48 jam, hanya perbaikan sementara yang
diamati selama tahap awal pasca trauma pemulihan, dan, dalam kedua
kasus, fungsi motorik tidak berbeda secara signifikan

Fig. 3.

12
Immunolocalization sel GFAP-positif pada rostral 3 mm dari pusat situs
lesi SCI oleh immunofluorescence di bagian vibratome dari tali tulang
belakang yang diperoleh 4 minggu setelah SCI dari kontrol ( AC ) dan
tikus lesi dengan ( GI ) atau tanpa ( DF ) pengobatan rhEPO . ( AC ) Pada
sumsum tulang belakang kontrol, beberapa sel positif hadir dekat dengan
meninge dari tanduk dorsal (dh) ( A ), di sekitar kanal pusat (cc) ( B ), dan
dalam materi putih ventral (vh) dan meninges ( C ). ( DF ) Pada tikus yang
diobati dengan saline, sel-sel GFAP-positif hadir di seluruh tali pusat dan
di sekitar rongga posttraumatic ( D danE ) (*) dan pada materi putih perut (
F ). ( GI ) Pengobatan dengan rhEPO sangat melemahkan ekspresi GFAP
di cord injury.

Fig. 4.
Immunolocalization sel ED-1-positif pada rostral 2 mm dari pusat situs lesi
SCI oleh immunofluorescence di bagian cryostat dari tali tulang belakang
dari tikus lesi 7 hari setelah SCI dengan (EPO) atau tanpa (SALINE)
pengobatan rhEPO. Jumlah sel ED-1-positif sangat berkurang di seluruh
lokasi lesi pada tikus yang diobati dengan rhEPO.
dari kontrol yang diberi saline setelah 16 hari ( Gbr. 6 Center). Dosis EPO
yang lebih rendah, diberikan melalui injeksi ip dalam waktu 30 menit SCI,
kurang efektif. Dosis 500 unit / kg-bb menghasilkan peningkatan yang
lebih kecil tetapi signifikan ( Gbr. 6 Kanan). Ketika EPO diberikan melalui

13
rute iv, dosis efektif minimum menurun menjadi 500 unit / kg-bw, dengan
dosis yang lebih rendah tidak efektif ( Gbr. 6 Kanan ). Administrasi MPSS
dalam kombinasi dengan EPO, bagaimanapun, sangat mempengaruhi
kemanjuran EPO, karena gagal untuk meningkatkan tingkat pemulihan
hindlimb ( Gbr. 7 A ), hanya menunjukkan perbaikan sementara (mirip
dengan pengobatan yang tertunda). MPPS sendiri juga tidak
mempengaruhi laju pemulihan fungsi dan identik dengan saline. Western
blotting dilakukan untuk EPOR menggunakan protein yang diperoleh
berdekatan dengan pusat lesi menunjukkan peningkatan yang nyata pada
semua tingkat diperiksa 1 hari setelah cedera, dipertahankan untuk
setidaknya 24 jam tambahan ( Gbr. 7 B ). Pengobatan dengan MPSS
tidak mempengaruhi kelimpahan protein EPOR.

Diskusi

EPO dan turunan nonerythropoietic telah terbukti sangat efektif

dalam mengatasi cedera pada beragam jaringan dan organ (ditinjau oleh
Brines dan Cerami dalam ref. 15 ). Untuk EPO pada stroke eksperimental,
kehadiran sawar darah-otak telah membutuhkan dosis tinggi, dalam
kisaran ≈500-5.000 unit / kg-bb yang diberikan iv atau ip untuk memicu
proteksi neuroprotektif yang efektif. Demikian pula, data diperoleh di sini
dan pengamatan kami sebelumnya ( 17) menunjukkan bahwa rhEPO,
yang diberikan ip, efektif dalam SCI pada dosis efektif minimum ≈500 unit /
kg-bw. Fakta bahwa dosis tinggi EPO iv atau ip adalah terapi ketika
diberikan dalam waktu 30 menit, meskipun kenaikan tingkat serum yang
jauh lebih lambat setelah injeksi ip, konsisten dengan jendela temporal
terapi yang luas di mana dosis yang tertunda masih efektif di SCI. Dosis
500 unit / kg-bw EPO, diberikan iv, yang memuncak pada ≈100 ng / ml
sama manjurnya dengan dosis 5.000 unit / kg-bw ip yang menghasilkan
konsentrasi serum ≈50-80 ng / ml. Sebaliknya, dosis yang lebih rendah
dari EPO yang diberikan iv atau ip tidak efektif, menunjukkan bahwa
konsentrasi serum puncak /50 ng / ml diperlukan untuk perlindungan yang
signifikan. Tidak seperti tindakan EPO dalam erythropoiesis, di mana area

14
di bawah kurva memprediksi kemanjuran biologis (29 ) pencapaian
konsentrasi puncak minimum tampaknya penting untuk perlindungan
jaringan.

Kami telah menunjukkan bahwa ada rentang waktu terapi yang luas
untuk analog nonerythropoietic dari EPO (EPO carbamylated), diberikan
dalam rejimen multi-dosis setelah SCI tekan ( 30 ) dan untuk EPO dosis
tunggal, diberikan iv pada 5.000 unit / kg- bw ( 31). Dalam penelitian ini,
jendela temporal untuk dosis tunggal EPO yang diberikan melalui rute ip
tampak lebih sempit. Meskipun peningkatan awal dicatat untuk hewan
yang diobati dengan EPO, itu bersifat sementara, dan, setelah 14 hari,
kemiringan kurva pemulihan berkurang, dan skor motor pada 1 bulan tidak
berbeda dari kelompok saline. Pengamatan ini menunjukkan bahwa
dampak traumatis pada spinal cord memicu proses yang tidak dapat
dimodulasi dengan dosis tunggal EPO eksogen yang diberikan dengan
penundaan> 12 jam. Jenis cedera yang berbeda secara kualitatif (dengan
komponen vaskular yang sangat menonjol) yang diproduksi oleh model
klip-aneurisma tampaknya tidak memiliki komponen cedera kritis ini,
karena dosis tunggal dapat ditunda selama 24 jam tanpa kehilangan
efikasi yang signifikan ( 31 ).

15
Fig. 6.
Skor motor lapangan terbuka setelah cedera menunjukkan dosis, waktu,
dan ketergantungan rute EPO. ( Kiri ) Untuk dosis tunggal yang diberikan,
baik 5.000 unit / kg-bb dan 500 unit / kg-bb secara signifikan lebih baik
daripada salin, sedangkan 100 unit / kg-bb tidak. ( Tengah ) Meskipun
EPO (5.000 unit / kg-bb) diberikan hingga 48 jam setelah cedera dikaitkan
dengan skor motorik yang jauh lebih baik untuk 3 minggu pertama setelah
cedera, pada 28 hari, 24-dan 48 jam keterlambatan dalam perawatan
adalah tidak berbeda dengan saline. ( Kanan ) EPO yang diberikan iv
dengan dosis lebih rendah 500 unit / kg-bb secara signifikan lebih baik
daripada dosis yang sama yang diberikan.
Interaksi yang rumit antara molekul pro dan antiinflamasi mengatur
patofisiologi sumsum tulang belakang setelah cedera. Dalam beberapa
jam pertama, neutrofil muncul ( 32 ), dengan limfosit dan mikroglia baru
kemudian dimobilisasi ke lokasi cedera (pada 24-48 jam). Gelombang
apoptosis oligodendrosit dimulai kemudian (memuncak pada sekitar hari
8) dan diselesaikan pada 12-14 hari ( 33 , 34 ). Data kami menunjukkan
bahwa bahkan satu dosis EPO dapat secara nyata mengurangi masuknya
mikroglia (sel ED-1-positif) ke situs lesi dalam waktu 1 minggu. Kehadiran
mikroglia dikaitkan dengan kavitasi dan jaringan parut yang ditandai,
seperti yang telah kami amati untuk hewan yang diberi saline, dan tidak
terlihat pada kelompok perlakuan EPO.

Banyak perhatian telah difokuskan pada peran kunci potensial dari sitokin
proinflamasi TNF-α, IL-1β, dan IL-6 untuk amplifikasi kerusakan setelah

16
cedera SSP ( 35 ). Dalam percobaan kami, TNF-α dan IL-6 pada hewan
yang tidak diobati memuncak pada hari ke 2 dan

Gbr. 7.
MPSS menetralkan perlindungan sumsum tulang belakang yang dimediasi
EPO. ( A ) MPSS memusuhi efek perlindungan EPO dalam pemulihan
skor motor medan terbuka. Meskipun pemulihan awal secara signifikan
lebih baik daripada salin, pada 3 minggu, hewan yang menerima MPSS
dan EPO tidak berbeda dari yang menerima saline. ( B ) Immunoblotting
untuk EPOR dalam sumsum tulang belakang pada 24 atau 48 jam setelah
cedera palsu (laminectomy dan impactor positioning only) (CTR)
mengungkapkan ekspresi protein EPOR yang paling jelas dalam rostral
(R), situs lesi (L), dan bagian ekor (C) kabelnya. Setelah cedera impaksi,
imunoreaktivitas EPOR meningkat tajam pada tiga level yang diperiksa.
Tidak ada perbedaan yang dicatat antara hewan yang diobati dengan
MPSS- versus saline (SAL).
dan setelah itu menurun, bahkan tanpa perawatan. Puncak yang
diamati tertunda dibandingkan dengan laporan dalam penelitian lain dari

17
kisaran 1-6 jam neuron dan mikroglia, masing-masing ( 36 , 37 ).
Selanjutnya, Pan et al. ( 38)) telah menunjukkan induksi cepat (menit) dari
mRNA sitokin proinflamasi pada SCI yang timbul dari sumsum tulang
belakang itu sendiri. Penjelasan untuk perbedaan-perbedaan ini saat ini
kurang tetapi dapat bergantung pada keparahan cedera dan, oleh karena
itu, mekanisme patofisiologis produksi sitokin. Meskipun perbedaan yang
jelas dalam produksi puncak sitokin, ada konsensus dalam literatur bahwa
MPSS menekan peradangan (ditinjau dalam ref. 39 ).

Namun, menarik bahwa, meskipun MPSS secara nyata

mengurangi konsentrasi sitokin, baik secara lokal di dalam pusat gempa
dan lebih jauh, tidak ada peningkatan dalam hasil yang diamati dalam
penelitian kami. Dengan demikian, cedera permanen tidak selalu
tergantung pada adanya proses inflamasi. Sangat mengejutkan bahwa
penindasan yang dimediasi MPSS terhadap IL-6 tidak terkait dengan skor
motor yang meningkat, karena perubahan sitokin ini telah dikaitkan
dengan modulasi paralel cedera pada SCI eksperimental ( 40 , 41 ). Perlu
dicatat bahwa, berbeda dengan MPSS, perawatan eksperimental lain
yang melemahkan respon inflamasi akut, misalnya, hydroxymethylglutaryl
CoA reductase inhibitor atorvastatin ( 42 ) atau antithrombin ( 43)), antara
lain, menunjukkan manfaat yang signifikan dalam model praklinis.

Ketika MPSS digunakan bersama dengan dosis EPO jika tidak

cukup untuk mendorong pemulihan, peningkatan awal skor motor diamati
selama 2 hari pertama, mirip dengan apa yang terlihat dengan
keterlambatan pemberian EPO saja, menunjukkan bahwa MPSS
menetralkan pelindung dini yang dimediasi EPO yang dimediasi
tanggapan, kemungkinan tindakan noninflamasi EPO. Sejumlah
penjelasan potensial ada. Sebagai contoh, MPSS mungkin menumpulkan
regulasi-up EPOR, mediator kritis respon terhadap cedera, untuk EPO
endogen dan eksogen. Atas dasar data blot EPOR Barat yang diperoleh
dari sumsum tulang belakang yang cedera, EPOR hadir dalam model ini
tidak hanya pada awal tetapi meningkat setelah impaksi dengan cara yang
sama, dengan atau tanpa MPSS. Dari catatan, bagaimanapun, antibodi

18
yang digunakan mendeteksi monomer EPOR,18 ) dari IL-3. Analisis
protein berdasarkan EPOR saja, oleh karena itu, tidak akan mendeteksi
perubahan kelimpahan subunit umum β. Atau, MPSS dapat mengganggu
perakitan perlindungan jaringan transduksi hetercomplex. Penjelasan lain
berdasarkan reseptor adalah bahwa, meskipun MPSS mengurangi
ekspresi sitokin, itu mungkin tidak melakukan hal yang sama untuk
reseptor sitokin. Oleh karena itu, tingkat jejak sitokin masih bisa memberi
sinyal secara biologis. Saat ini, tidak ada data yang tersedia untuk
mengevaluasi kemungkinan ini.

SCI dikaitkan dengan kehilangan awal autoregulasi vaskular, yang,

jika tidak disukai, mengarah ke pemulihan motorik cepat ( 44 , 45 ) yang
sangat mirip secara temporer dengan apa yang telah diamati setelah
pemberian EPO. Dalam model cedera praklinis lainnya, misalnya, kejang
arteri basilar yang disebabkan oleh perdarahan subaraknoid ( 46 , 47 )
atau penyempitan arteri-splanchnic dalam pengaturan syok septik ( 24 ),
dibalik dengan dosis tunggal EPO. Perlu dicatat bahwa pemberian
glukokortoid dosis tinggi telah dikaitkan dengan disfungsi vaskular (ditinjau
oleh Yand dan Zhang dalam ref. 48 ). Mekanisme utama tampaknya
adalah produksi dan fungsi oksida nitrat yang tidak teratur ( 49, 50 ).

Selanjutnya, MPSS dapat meningkatkan pembersihan EPO dari

pembuluh darah, misalnya, dengan menambah ekskresi ginjal. Penjelasan
ini tampaknya sangat tidak mungkin, karena analog EPO dengan waktu
paruh yang sangat singkat (beberapa menit) sangat efektif ketika
diberikan sebagai bolus tunggal segera setelah cedera tekan pada
sumsum tulang belakang ( 51 ). Meskipun MPSS dosis tinggi dapat
menghambat pelepasan simpatis setelah cedera ( 52 ) (yang, kedua,
dapat menekan efek antiinflamasi yang dimediasi IL-10) ( 53 , 54 ), tidak
ada bukti yang mendukung kemungkinan ini. Potensi efek sistemik yang
dimediasi endokrin lainnya dari MPSS adalah mungkin dan akan
membutuhkan evaluasi.

19
 Pemberian glukokortikoid dosis tinggi telah terbukti menghambat
tidak hanya sitokin proinflamasi tetapi juga faktor pertumbuhan
neuroprotektif, misalnya faktor neurotropik turunan glial ( 14 ), faktor
neurotropik turunan otak (BDNF), dan NT-3 ( 55 ). Sebuah studi baru-baru
ini menunjukkan bahwa kegiatan perlindungan saraf EPO untuk neuron
hippocampal in vitro tergantung pada produksi BDNF ( 56).) secara
langsung relevan. Dalam pandangan ini, MPSS dapat menekan produksi
neurotropin yang dimediasi-EPO, bertanggung jawab atas efek buruk
glukokortikoid pada hewan yang diberi garam (yaitu, mengganggu EPO
yang diproduksi secara endogen dan dengan EPO eksogen). Penjelasan
ini untuk efek antagonis MPSS pada efek menguntungkan EPO
memerlukan evaluasi lebih lanjut.

Singkatnya, penelitian ini menunjukkan dosis dan waktu yang luas

untuk penggunaan EPO di SCI. MPSS tampaknya meniadakan tindakan
kritis fase awal EPO. Meskipun penelitian lebih lanjut diperlukan untuk
memahami efek dari dosis ganda MPSS, kehati-hatian menentukan
bahwa MPSS atau glukokortikoid lainnya harus dihindari dalam uji klinis
untuk menentukan kemanjuran EPO pada penyakit sumsum tulang
belakang manusia. Apakah efek penetralan yang serupa dari MPSS
terjadi dengan terapi lain tidak diketahui tetapi harus dipertimbangkan
kemungkinannya.

20
 DAFTAR PUSTAKA

Gorio A, Madaschi L. Di Stefano B etal. Methylprednisolone neutralizes

the beneficial effects of erythropoietin in experimental spinal cord injury.
Proc Nat Acad Sciences United States of Am. 2005; 102:16379-16384.

21