1.

Jelaskan dengan singkat dan padat tahapan-tahapan Identifikasi

mikroba
Jawab :
Identifikasi mikroba dapat dilakukan dengan metode pewarnaan
gram. Metode pewarnaan gram adalah suatu teknik atau metode
pewarnaan yang paling luas digunakan untuk identifikasi bakteri.
Metode ini merupakan metode pewarnaan diferensial yang
menggunakan lebih dari satu zat warna.
Tahapan-Tahapan Identifikasi mikroba
Proses pewarnaan Gram memiliki beberapa tahap. Pertama,
pemberian pewarna kristal violet pada bakteri yang diletakkan di
atas gelas objek tadi. Pewarna kristal violet ini berguna sebagai
indikator bakteri gram positif. Setelah ditetesi pewarna kristal violet,
objek glas dibilas dengan air aquades, gelas objek dipegang pada
posisi miring kemudian dikeringkan dengan menempelkan kertas
serap yaitu kertas tissue pada bakteri tanpa mengelapnya. Kedua,
pemberian Gram Iodium (lugol) yang berfungsi sebagai pembentuk
kompleks ungu kristal-yodium (UK-Y), kemudian diamkan selama
satu menit lalu dibilas kembali dengan air aquades dan dikeringkan
seperti tadi. Ketiga, pemberian alkohol 95% untuk menghilangkan
warna pada gelas objek sampai warna tidak luntur lagi (± 20 detik)
lalu dibilas dan dikeringkan lagi. Keempat, pewarnaan dengan
larutan safranin yang berfungsi sebagai indikator bakteri gram
negatif ataupun positif selama ± 20 detik kemudian dibilas dengan
aquades dan dikeringkan.
Setelah melakukan tahapan-tahapan tersebut kita akan
mendapatkan warna yang khas, warna ungu kebiruan untuk bakteri
Gram positif yang menyerap pewarna kristal violet dan warna
kemerahan untuk bakteri Gram negatif yang menyerap larutan
safranin.
2. Jelaskan apa yang dimaksud dengan :
a. ALT (Angka Lempeng Total)
b. MPN (Most Probable Number)

Jelaskan juga cara kerja dan cara perhitungannya masing-masing

Jawab :

a. Angka lempeng total adalah angka yang menunjukkan jumlah

bakteri mesofil dalam tiap-tiap 1 ml atau 1 gram sampel
makanan yang diperiksa. Prinsip dari ALT adalah menghitung
pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah sampel
makanan ditanam pada lempeng media yang sesuai dengan
cara tuang kemudian dieramkan selama 24-48 jam pada suhu
35-37°C
CARA KERJA :
1. Cairkan PCA dalam penangas air. Biasanya diperlukan
waktu sekitar 10 menit. Perhatikan bahwa agar dicairkan
dengan baik karena pencairan yang tidak sempurna
menyebabkan gumpalan agar sehingga menyulitkan
perhitungan jumlah.
2. Dinginkan agar sampai suhu 50ºC, kemudian tuangkan agar
ke dalam cawan petri dan biarkan membeku. Tandai cawan
petri dengan nama dan tingkat pengenceran.
3. Buat pengenceran 10-1 – 10-4 dari sampel.
4. Pipet 1 ml cairan dari pengenceran 10 -2, 10-3,10-4 dan
masukkan ke dalam cawan petri yang sesuai. Sewaktu
memasukan cairan ke dalam cawan petri, angkat penutup
caan petri sedikit saja untuk memasukkan cairan mengalir ke
dalam cawan petri.
5. Tuang PCA ke dalam masing-masing cawan petri dan
goyangkan cawan dengan gerakan ke arah jarum jam 5 kali
dan gerakkan berlawanan arah jarum jam 5 kali. Usahakan
 agar PCA tidak tumpah ke luar sewaktu memutar cawan
petri. Berhati-hatilah sewaktu memutar cawan sehingga tidak
menimbulkan buih atau gelembung udara.
6. Biarkan lempengan agar membeku. Setelah membeku,
balikkan lempeng agar dan masukkan ke dalam inkubator
selama 24-48 jam pada suhu 37ºC.
7. Hitung jumlah koloni pada lempeng agar yang memenuhi
kriteria 300-300 koloni.
8. Amati ada tidaknya pertumbuhan koloni pada cawan petri
kontrol.

PERHITUNGAN JUMLAH BAKTERI

METODE : TIDAK LANGSUNG (TOTAL PLATE COUNT)

Jumlah bakteri pada pengenceran :

10-2 = …… X 100 =

10-3 = ……X 1000 =

10-4 = ……X 10.000 =

10-5 = ……X 100.000 =

jumlah =P

maka jumlah bakteri/ml = P/N

N = jumlah cawan petri yang ditumbuhi koloni 30-300

b. Metode MPN (Most Probable Number) adalah metode yang

digunakan untuk menghitung koliform di dalam air dengan
menggunakan pengujian fermentasi dalam tabung. Tiga
pengujian itu diantaranya adalah uji penduga (Presumtive Test),
uji penegas (Confirmed Test), dan uji pelengkap (Completed
Test)  Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah
perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk
koloni dalam sampel.
PROSEDUR KERJA
 Uji penduga
1. Disiapkan Alat dan Bahan.
2. Disiapkan 5 tabung reaksi setiap seri pengenceran yang
di pilih.
3. Dimasukan 5 ml sampel air minum pada setiap tabung
reaksi seri pengenceran 10.
4. Dimasukan 0,5 ml sampel pada seri pengenceran 1 .
5. Dimasukan 0,5 ml sampel pada larutan NaCl 4,5 ml .
6. Dimasukan 0,5 ml campuran NaCl tadi pada setiap
tabung reaksi seri pengenceran 10-1.
7. Dimasukan 0,5 ml larutan NaCl 4,5 ml yang telah
dilarutkan sampel pada larutan NaCl 4,5 ml untuk
pengenceran 10-2.
8. Dimasukan campuran NaCl 4,5 ml tadi pada setiap seri
tabung reaksi pengenceran 10-2.
9. Diinkubasi dalam suhu 35 0C selama 24 jam dan
sebelumnya diberi label pada setiap pengenceran yang
dilakukan.
10. Diamati perubahan pada tabung reaksi.
11. Dihitung jumlah bakteri yang terdapat pada sampel.
 Uji penegas
1. Disiapkan alat dan bahan.
2. Dipijarkan jarum ose dan dimasukan ke dalam tabung
reaksi pada uji penduga pada pengenceran 10.
3. Dimasukan jarum ose pada yang elah dimasukan ke
dalam pengenceran 10 ke dalam media BGLBB.
 4. Dipijarkan lagi jarum ose dan di ulangi perlakuan yang
sama hingga ke lima tabung reaksi setiap seri
pengenceran yang di lakukan.
5. Diberi label pada setiap seri tabung reaksi pengenceran
yang dilakukan.
6. Diinkubasi pada suhu 350C selama 24 jam.
7. Diamati gas yang terbentuk pada tabung durham.
8. Dihitung jumlah bakteri yang terdapat pada sampel.
 Uji pelengkap
1. Disiapkan alat dan bahan.
2. Dipijarkan jarum ose pada lampu bunsen.
3. Dimasukan jarum ose pada tabung reaksi pengenceran ke
10.
4. Digoresakan jarum ose yang telah di masukan
padapengenceran 1o pada media EMBA yang terdapat
pada cawan petri dan di gunakan pada kolom yang
tersedia hingga ke lima seri tabung pengnceran 10.
5. Dipijarkan lagi jarum osedan di lakukanperlakuan yang
sama hingga ke lima tabung  reaksi setiap seri
pengenceran yang di lakukan.
6. Diberi label.
7. Diinkubasi pada suhu 350C selama 24 jam.
8. Diamati setiap cawan petri yang terdapat bakteri E.coli.
9. Dihitung jumlah bakteri yang terdapat pada sampel.

PERHITUNGAN
 Perhitungan Media LB (lactose Borth)
1
Nilai MPN=Nilai MPN tabel ×
Tingkat Pengenceran Tengah
 1 CFU
Nilai MPN=33 × =3300
10−1
ml
 Perhitungan Media GLBB (green lactose bile borth)
1 CFU
Nilai MPN=26 × =2600
10−1
ml
 Perhitungan Media EMBA (eosin methylene blue agar)
1 CFU
Nilai MPN=0× =0
10 −1
ml
3. Sebutkan dan jelaskan cara kerja metode2 pengujian aktivitas
antimikroba.
Jawab :
Metode Pengujian Daya Antimikroba

Metode pengujian daya antimikroba bertujuan untuk menentukan

konsentrasi suatu zat antimikroba sehingga memeperoleh suatu
sustem pengobatan yang efektif dan efisien. Terdapat dua metode
untuk menguji daya antimikroba, yaitu dilusi dan difusi. Menurut
Pratiwi (2008) dalam Atikah (2013) metode difusi dan metode dilusi
terbagi menjadi beberapa metode, yaitu:

a. Metode Difusi adalah pengukuran dan pengamatan diameter

zona bening yang terbentuk di sekitar cakram, dilakukan
pengukuran setelah didiamkan selama 18-24 jam dan diukur
menggunakan jangka sorong (Khairani, 2009; Sari, dkk,2013)
 Metode disc diffusion atau metode Kirby Baure, metode
ini menggunakan kertas cakram yang berisi zat
antimikroba dan diletakkan pada media agar yang telah
ditanami bakteri uji.
 Metode E-Test digunakan untuk menentukan KHM
(Kadar Hambat Minimum), yaitu konsentrasi minimal zat
antimikroba dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji.
 Metode ini menggunakan strip plastik yang telah berisi
zat antibakteri dan diletakkan pada media agar.
 Ditch plste technique, zat antimirkoba diletakkan pada
parit yang dibuat dengan cara memotong media agar
dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur
dan bakteri uji digoreskan ke arah parit.
 Cup-plate technique, metode ini hampir sama dengan
metode disc diffusion namun bedanya tidak
menggunakan kertas. Pada media agar dibuat sumur,
dan pada sumur tersebut diberi zat antimikroba.
 Gradient-plate technique, media agar dicairkan dan
ditambahkan larutan uji kemudian campuran tersebut
dituangkan ke dalam cawan petri dan diletakkan dalam
posisi miring.
b. Metode Dilusi dibedakan mejadi dua, yaitu:
 Metode Dilusi cair/ broth dilution test, digunakan untuk
mengukur KHM dan KBM. Zat antimikroba diencerkan
pada medium cair yang telah ditambhakan bakteri uji.
Larutan antimikroba dengan kadar terkecil dan terlihat
jernih ditetapkan sebagai KHM. KHM dikultur ulang pada
media cair tanpa penambahan bakteri dan zat
antimirkoba, kemudian diinkubasi selama 18-24 jam.
Media yang tetap cair ditetapkan sebagai KBM.
 Metode dilusi padat/ solid dilution test, metode ini hampir
sama dengan metode dilusi cair, namun menggunakan
media padat/solid. Metode dilusi padat dapat menguji
beberapa macambakteri dalam satu konsentrasi zat
antimikroba.
4. Jelaskan apa yang dimaksud dengan :
a. MIC (Minimum Inhibitony Concentra)
b. MKC (Minimum Killing Concentration)

Dan jelaskan cara kerjanya masing-masing

Jawab :

a. Konsentrasi minimun penghambatan atau lebih dikenal

dengan MIC (Minimum Inhibitory Concentration) adalah
konsentrasi terendah dari antibiotika atau antimikrobial yang
dapat menghambat pertumbuhan mikroba tertentu. Nilai MIC
adalah spesifik untuk tiap-tiap kombinasi dari antibiotika dan
mikroba.
Cara kerja :
1. Dibuat perencanaan pengenceran dan perhitungan
konsentrasi campuran pada masing- masing tabung besar
dan tabung kecil.
2. Dibuat pengenceran bertingkat larutan sedian uji dengan
air suling steril dalam tabung reaksi besar . Tabung reaksi
kecil pertama diisi dengan 1ml NB double strength ,
sedangkan semua tabung reaksi kecil yang lain diisi
dengan dengan 1ml NB biasa.
3. Dipipet 1ml hasil pengenceran terakhir dari tabung reaksi
besar ke dalam tabung reaksi 1 berisi NB double strength
dan ke dalam tabung reaksi 2 yang berisi NB biasa
.Kedua-duanya dikocok sampai homogen. Seterusnya,
dipipet 1ml campuran dari tabung 2 ke dalam tabung 3
kemudian dikocok homogen.
 4. Demikian dilakukan seterusnya sehingga tabung terakhir
dan 1ml dari tabung terakhir dibuang.
5. Ditambahkan satu ose bakteri ke dalam setiap tabung kecil
dan dikocok sampai homogeny.
6. Dilakukan juga satu kontrol positif dan satu kontrol negatif.
Kontrol positif diisikan dengan 1ml NB biasa dan satu ose
suspense bakteri manakala control negatif pula hanya diisi
dengan 1ml NB .
7. Semua tabung uji kecil diinkubasikan dalam oncubator
pada suhu 37 ˚C selama 18-24 jam .
8. Diamati kekeruhan yang terjadi, dibandingkan perubahan
warna dengan kontrol positif dan kontrol negative.
Ditentukan MICnya. MIC terletak pada tabung uji bening
yang terakhir atau sebelum tabung uji keruh pertama
b. Konsentrasi bunuh terkecil atau lebih dikenal dengan MKC
(Minimum Killing Concentration) adalah konsentrasi terendah
dari antibiotika atau antimikrobial yang dapat membunug
pertumbuhan mikroba tertentu. Nilai MKC adalah spesifik
untuk tiap-tiap kombinasi dari antibiotika dan mikroba.
Cara kerja :
 Dibuat perencanaan pengenceran dan perhitungan
konsentrasi campuran pada masing- masing tabung besar
dan tabung kecil.
 Dibuat pengenceran bertingkat larutan sedian uji dengan
air suling steril dalam tabung reaksi besar . Tabung reaksi
kecil pertama diisi dengan 1ml NB double strength ,
sedangkan semua tabung reaksi kecil yang lain diisi
dengan dengan 1ml NB biasa.
 Dipipet 1ml hasil pengenceran terakhir dari tabung reaksi
besar ke dalam tabung reaksi 1 berisi NB double strength
dan ke dalam tabung reaksi 2 yang berisi NB biasa
 .Kedua-duanya dikocok sampai homogen. Seterusnya,
dipipet 1ml campuran dari tabung 2 ke dalam tabung 3
kemudian dikocok homogen.
 Demikian dilakukan seterusnya sehingga tabung terakhir
dan 1ml dari tabung terakhir dibuang.
 Ditambahkan satu ose bakteri ke dalam setiap tabung
kecil dan dikocok sampai homogeny.
 Dilakukan juga satu kontrol positif dan satu kontrol negatif.
Kontrol positif diisikan dengan 1ml NB biasa dan satu ose
suspense bakteri manakala control negatif pula hanya
diisi dengan 1ml NB .
 Semua tabung uji kecil diinkubasikan dalam oncubator
pada suhu 37 ˚C selama 18-24 jam .
 Diamati kekeruhan yang terjadi, dibandingkan perubahan
warna dengan kontrol positif dan kontrol negative.
Ditentukan MKCnya.
5. Sebutkan jenis-jenis media dan komposisinya serta tujuan
penggunaannya.
Jawab :
JENIS-JENIS MEDIA

Berdasarkan fungsinya, media dapat dibedakan menjadi enam

yaitu:
1. Media Basal (media dasar) adalah media yang digunakan
sebagai bahan dasar untuk membuat media lain yang lebih
kompleks. Media ini dapat mendukung pertumbuhan hampir
semua jenis mikrobia, contohnya adalah nutrient broth, kaldu
pepton, dsb.
2. Media diferensial adalah media yang bila ditumbuhi oleh
mikroba yang berbeda, mikroba tersebut akan tumbuh dengan
ciri khusus sehingga dapat dibedakan. Contohnya: Media Triple
Sugar Iron Agar (TSIA), Media Sulfit Indol Motility (SIM), dsb.
 Dan media differensial merupakan media yang ditambahkan
bahan-bahan kimia atau reagensia tertentu yang menyebabkan
mikroba yang tumbuh memperlihatkan perubahan-perubahan
spesifik sehingga dapat dibedakan dengan jenis lainnya.
3. Media selektif adalah media yang memungkinkan suatu jenis
mikroba tumbuh dengan pesat, sementara jenis mikroba yang
lain terhambat. Contohnya: Media Salmonella Shigella Agar
(SSA), Thiosulphate Citrate Bile Salt (TCBS), dsb. Dan media
selektif, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan
tertentu yang akan menghambat pertumbuhan mikroba yang
tidak diinginkan yang ada dalam suatu spesimen. Inhibitor yang
digunakan berupa antibiotik, garamk dan bahan-bahan kimia
lainnya.
4. Media diperkaya (enrichment) adalah media yang dirancang
untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme. Media
tersebut memiliki konstituen nutrisi yang mendorong
pertumbuhan mikroba tertentu. Contohnya: kaldu selenit, atau
kaldu tetrationat untuk memisahkan bakteri Salmonella thyposa
dari tinja. DanMedia diperkaya (enrichment media), media yang
ditambahkan bahan-bahan tertentu untuk menstimulasi
pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Hal ini dilakukan untuk
menstimulasi pertumbuhan mikroba yang jumlahnya sedikit
dalam suatu campuran berbagai mikroba contoh Chocolate
media dan Yeast-Extract-poptasium Nitrat Agar.
5. Media pengkayaan adalah media ini umumnya mengandung
bahan-bahan tertentu yang di satu pihak dapat menghambat
pertumbuhan bakteri tertentu,tetapi di lain pihak sebaliknya
dapat menunjang pertumbuhan bakteri tertentu lainnya.misalnya
media muller-kauffman mengandung natrium tetrationat yang
menunjang pertumbuhan salmonella tetapi menghambat
pertumbuhan Escherichia.
6. Media uji(identifikasi) adalah media yang digunakan untuk
identifikasi mikroba, medium litmus milk.umumnya ditambah
dengan substansi tertentu yang menjadi indikator, misalnya
7. Medium umum, media yang ditambahkan bahan-bahan yang
bertujuan menstimulasi pertumbuhan mikroba secara umum.
Contoh Nutrien Agar (NA) untuk menstimulasi pertumbuhan
bakteri, Potato Dextose Agar (PDA) untuk menstimulir
pertumbuhan fungi.
8. Medium khusus(spesifik), merupakan medium untuk
menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan kemampuannya
untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu
misalnya, medium tetes tebu untuk Saccharomyces cerevisiae.

9. Medium penguji (Assay medium), yaitu medium dengan

susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian senyawa-
senyawa tertentu dengan bantuan bakteri misalnya medium
untuk menguji vitamin-vitamin, antibiotika dan lain-lain.

10. Medium perhitungan jumlah mikroba yaitu medium spesifik yang

digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu
bahan, misalnya medium untuk menghitung jumlah bakteri E.
coli air sumur.