Anda di halaman 1dari 22

LAPORAN AKHIR

PRAKTIKUM BIOKIMIA
PENGUKURAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE
BRADFORD DAN LOWRY

Disusun Oleh:
1. Ayu Handayani 1510411004
2. Nurhayati 1510411024
3. Putri Yuliani 1510412005
4. Nofitri Utami 1510412034

Hari/Tgl praktikum : Kamis/ 12 Oktober 2017


Kelompok : I (satu)
Asisten : Rahmi Febri Utami
Koordinator Harian : Iolantri Handra

LABORATORIUM PENDIDIKAN III


JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PEGETAHUAN
ALAM
UNIVERSITAS ANDALAS
PADANG
2016
PENGUKURAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD
DAN LOWRY

I. RESPON ANALISA MASALAH


1. Adanya gelembung di dalam kuvet saat pengukuran absorban dengan
menggunakan spektrofotometri mempengaruhi serapan sinar larutan.
2. Pengenceran larutan sampel yang tidak tepat mempengaruhi konsentrasi
sampel.
3. Larutan yang diukur mengandung partikel/tidak jernih sehingga
menghalangi laju sinar.
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang 
Manusia memerlukan energi untuk melakukan kegiatan dan aktivitas sehari-
hari, energi tersebut dapat diperoleh dari berbagai bahan makanan. Secara umum,
bahan makanan tersebut mengandung karbohidrat, protein, dan lemak. Protein
merupakan biopolymer polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam amino yang
dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein merupakan biopolymer yang
multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel maupun jaringan dan organ, sebagai
enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau pembawa senyawa atau zat ketika
melalui biomembran sel, dan sebagai zat pengatur (Hawab, 2004).
Protein juga merupakan makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel
dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme.
Protein merupakan instrumen yang mengekspresikan informasi genetik. Protein
mempunyai fungsi unik bagi tubuh, antara lain menyediakan bahan-bahan yang
penting peranannya untuk pertumbuhan dan memelihara jaringan tubuh, mengatur
kelangsungan proses di dalam tubuh, dan memberi tenaga jika keperluannya tidak
dapat dipenuhi oleh karbohidrat dan lemak. Protein ada yang reaktif karena asam
amino penyusunnya mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH, -OH,
NH2, dan –COOH. Contoh protein aktif adalah enzim, hormon, antibodi, dan
protein transport. (Fessenden, 1986).
Ada berbagai cara dalam penentuan kadar protein. Refraktori (menyelupkan
refraktomer menurut Pulrich) dengan standar kadar protein ∆n = 0,002/ 1%
protein, sangat cepat pelaksanaannya dan hanya memerlukan sedikit bahan,
namun tidak spesifik jadi hanya baik untuk pengenalan protein. Uji biuret, metode
ini untuk penentuan konsentrasi dengan cara meneteskan protein ke dalam larutan
CuSO4dari berbagai macam konsentrasi. Penentuan kekeruhan dengan
Nephelometer yaitu penentuan intensitas kekeruhan dengan memberikan standar
sulfosalsilat pada larutan protein, namun metode ini jarang digunakan.  Fotometri
(reaksi warna), yaitu dengan meneteskan biuret atau fenol ke dalm larutan protein,
reaksi warna akan menjadi biru dari reagenisa biuret dan reduksi asam heteropoli.
Penyisaan basah menurut Kjeldahl merupakan metode analitik klasik sehingga
perlu persiapan lama dan N dari non protein ikut dalam perhitungan. Selain itu,
penentuan kadar protein yang menggunakan dengan metode Lowry akan
memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein
yang ditera. Dalam percobaan kali ini akan digunakan metode Bradford dna
Lowry yang menggunakan suatu pereaksi pewarna yang mampu mengikat protein
di dalam sampel. Pereaksi yang digunakan dalam metode Bradford
adalah Coomassie Brilliant Blue G-250 dan untuk metoda Lowry menggunakan
Lowry A, B dan C. Konsentrasi protein diukur berdasarkan optikal density pada
panjang gelombang 695 nm untuk metoda Bradford dan 750 nm untuk metoda
Lowry. Untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan, terlebih dahulu
dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan antara konsentrasi dan optical
dencity(OD).
1.2 Tujuan

1. Melakukan analisa kadar protein dalam suatu sampel menggunakan


kurvastandarprotein.
2. Mengukur & menghitung kadar protein dalam sampel.
3. Membandingkan sensitivitas dua metode penentuan kadar protein.

1.3 Manfaat
Manfaat dari praktikum ini sebagai berikut :
1. Dapat mengerti dan melakukan analisa kadar protein dalam suatu sampel
menggunakan kurva standar protein.
2. Dapat mengukur & menghitung kadar protein dalam sampel.
3. Dapat membandingkan sensitivitas dua metode penentuan kadar protein.
BAB II
KAJIAN TEORI

Protein adalah makromolekul yang penting bagi tubuh. Kadar protein didalam
tubuh pun tidak harus banyak. Kebutuhan protein dalam kondisi masyarakat kita
pada umumnya, sangat sulit terpenuhi khususnya masyarakat yan tinggal di
pedesaan, akibatnya banyak penduduk Indonesia terutama anak-anak busung lapar
akibat kekurangan protein.Protein tersusun atas beberapa asam amino melalui
ikatan peptida. Dalam jaringan hidup, nitrogen terdapat sebagai sumber protein
dalam jumlah relatif besar dan sebagai NPN dalam jumlah relatif kecil, sehingga
adanya NPN besar dalam bahan makanan yang kaya protein perlu diketahui untuk
memberi gambaran nilai gizi yang sebenarnya dalam bahan makanan. Penentuan
kadar protein di dalam makanan biasanya ditetapkan dengan metode kjedhal,
dimana kadar protein didasarkan pada kandungan nitrogen.
Protein merupakan makromolekul yang menyusun lebih dari separuh
bagian dari sel. Protein menentukan ukuran dan struktur sel, komponen utama dari
sistem komunikasi antara sel serta sebagai katais berbagai reaksi biokimia
didalam sel. Protein merupakan salah satu senyawa yang berupa makromolekul
yang terdapat dalam setiap mikroorganisme dengan karakteristik yang berbeda-
beda. Makhluk hidup akan selalu memerlukan protein untuk kehidupannya.
Protein fungsinya untuk kepentingan organisme yang bersangkutan.
Protein yang ditemukan kadang-kadang berkonjugasi dengan
makromolekul atau mikromolekul seperti lipid, polisakarida, dan fosfat. Protein
terkonjugasi yang dikenal antara lain nukleoprotein, fosfoprotein, metaloprotein,
lipoprotein, flavoprotein, dan glikoprotein. Protein yang diperlukan organisme
dapat diklafikasikan menjadi dua golongan utama yaitu protein sederhana, protein
yang apabila terhidrolisis hanya menghasilkan asam amino, kedua protein
terkonjugasi yaitu protein yang dalam hidrolisis tidak hanya menghasilkan asam
amino tapi juga menghasilkan komponen organik maupun anorganik yang disebut
gugus prostetik.
Protein adalah zat makanan yang penting bagi tubuh karena mempunyai
fungsi antara lain sebagai zat pembangun dan pengatur, serta sebagai sumber
tenaga. Protein merupakan makromolekul yang tersusun dari asam amino yang
mengandung unsur-unsur utama C,O,H, dan N. Molekul protein juga mengandung
beberapa belerang, fosfor, besi, dan tembaga. Molekul protein memiliki sifat dan
ciri yang spesifik yang berguna dalam dalam kegiatan analisis. Sifat atau ciri khas
molekul protein tersebut antara lain :
a. Mempunyai ukuran berat molekul besar sehingga mudah mengalami perubahan
bentuk fisik dan aktivitas biologi. Hal ini dapat bermanfaat untuk mengenali
dan memisahkan dari bahan pangan yang lain.
b. Struktur molekul protein mengandung unsur nitrogen relatif banyak sehingga
keberadaan protein di dalam bahan dapat ditentukan berdasarkan kandungan
unsur N.
c. Protein merupakan polimer yang tersusun oleh banyak monomer-monomer
asam amino (lebih dari 20 jenis) sehingga protein didalam bahan pangan juga
banyak jenisnya.
Kualitas protein ditentukan oleh komposisi asam amino, sehingga
mempunyai kualitas yang beraneka ragam tergantung sampai beberapa jauh
protein dapat menyediakan asam amino esensial dalam jumlah memadai. Protein
yang mampu menyediakan asam amino esensial dalam perbandingan yang
menyamai kebutuhan manusia, mempunyai mutu yang tinggi begitupun
sebaliknya.
Enzim merupakan protein yang konsentrasinya dapat diukur dengan
metoda Bradford. Metoda Bradford digunakan untuk mendeteksi konsentrasi
protein hingga 20 μg/mL. Prinsip dasar dari metoda Bradford adalah pengikatan
warna Coomassie Brilliant Blue oleh protein. Keuntungan metode Bradford
adalah menggunakan pereaksi sederhana dan mudah disiapkan serta pembentukan
kompleks berwarna biru yang cepat dan bersifat stabil. Kekurangan dari metode
ini adalah sensitivitas yang kurang terhadap sampel yang mengandung sedikit
protein. Konsentrasi protein diukur dengan mengukur absorbansi pada panjang
gelombang 595 nm. Nilai absorbansi sampel kemudian dibandingkan dengan
kurva standar Bovine Serum Albumin.
Metode lain yang umum digunakan dalam pengukuran konsentrasi protein
adalah metode Lowry. Metode tersebut dapat mendeteksi konsentrasi protein
hingga 10 μg/mL. Prinsip dasar reaksi tersebut adalah reaksi Cu 2+ terhadap ikatan
peptida pada protein dan reduksi kompleks reagen follin oleh asam amino pda
protein. Keuntungan dari metode Lowry adalah memiliki sensitivitas yang tinggi.
Kekurangan dari metode Lowry adalah reagen yang digunakan tidak sederhana
dan reagen mudah bereaksi dengan senyawa lain selain protein.
Sejumlah metode telah ditemukan untuk pengukuran kadar protein
berdasarkan spektroskopi UV-Vis. Metode ini berdasarkan kemampuan protein
menyerap (atau membaurkan) cahaya di daerah UV-Vis. Secara kimiawi atau fisik
memodifikasi protein untuk membuatnya menyerap cahaya di daerah UV-Vis.
Keuntungan metode spektroskopi UV-Visible yaitu teknik UV-Visible
adalah teknik yang cepat dan sederhana, serta sensitif terhadap protein dan
konsentrasi rendah. Kelemahan metoda spektroskopi UV-Visible memerlukan
larutan yang encer dan jernih seperti tidak mengandung kontaminan yang dapat
mengabsorpsi atau memantulkan cahaya pada panjang gelombang dimana protein
akan dianalisis.
Prinsip analisis protein dengan pengikatan zat warna yaitu zat warna yang
dapat bereaksi dengan gugus polar protein membentuk kompleks tidak larut.
Kompleks dipisahkan dengan sentrifus atau penyaringan dan diukur densitas
optiknya. Bahan pewarna yang digunakan adalah orange G, orange 12, dan amido
black. Sisa bahan pewarna yang tidak bereaksi diukur dengan kolorimetri. Dalam
analisis ini diperlukan kurva standar hubungan antara densitas optik dengan kadar
protein. Gugus α-amino dari suatu protein dapat direaksikan dengan trinitrobenzen
sulfonat membentuk senyawa berwarna yang dapat diukur absorbannya.
Metodan lainnya yaitu metoda Kjeidahl, sejak abad ke-19, metode Kjeldahl
telah dikenal dan diterima secara universal sebagai metode untuk analisis protein
dalam berbagai variasi produk makanan dan produk jadi (Rhee, 2005). Penetapan
kadar protein dengan metode Kjeldahl merupakan metode empiris (tidak
langsung) yaitu melalui penetapan kadar N dalam bahan yang disebut protein
kasar (Estiasih, dkk., 2012).
Metode Kjeldahl merupakan salah satu dari uji kadar protein yang memiliki
tingkat kepercayaan lebih tinggi dalam menentukan kandungan nirogen (N) dalam
susu. Kelebihan metode ini adalah sederhana, akurat, dan universal juga
mempunyai kebolehulangan (Reproducibility) yang cukup baik, akan tetapi
metode ini bukannya tidak memiliki kekurangan. Kekurangan metode ini adalah
memakan waktu lama (Time Consuming), membutuhkan biaya besar dan
ketermpilan tekhnis tinggi (Julianti dan Sumardi, 1981).
Prinsip metode Kjeldahl ini adalah senyawa-senyawa yang mengandung
nitrogen tersebut mengalami oksidasi dan dikonversi menjadi ammonia
danbereaksi dengan asam pekat membentuk garam amonium. Kemudian
ditambahkan basa untuk menetralisasi suasana reaksi dan kemudian didestilasi
dengan asam dan dititrasi untuk mengatahui jumlah N yang dikonversi (Estiasih,
dkk., 2012).
Keuntungan menggunakan metode Kjeldahl ini adalah dapat diaplikasikan
untuk semua jenis bahan pangan, tidak memerlukan biaya yang mahal untuk
pengerjaannya, dapat dimodifikasi sesuai kuantitas protein yang dianalisis.
Adapun kerugiannya adalah yang ditentukan adalah jumlah total nitrogen yang
terdapat didalamnya bukan hanya nitrogen dari protein, waktu yang diperlukan
relatif lebih lama (minimal 4 jam untuk menyelesaikannya), presisi yang lemah,
pereaksi yang digunakan ada yang bersifat beracun, korosif dan berbahaya bagi
kesehatan, dan adanya variasi faktor konversi untuk masing-masing sampel
(Chang, 1998).
Metoda lainnya yaitu metoda Dumas, pada metode ini sampel dioksidasi
pada suhu sangat tinggi (700-900°C). Hasil oksidasi menghasilkan gas O 2, N2 dan
CO2. Gas nitrogen yang dilepaskan dikuantitasi menggunakan kromatografi gas
dengan detektor konduktivitas termal (Thermal Detector Conductivity/TDC)
kemudian jumlah nitrogen yang diperoleh dikonversi. Jumlah nitrogen dalam
sampel sebanding dengan kadar proteinnya (Pomeranz dan Meloan, 1987).
Keuntungan metode ini adalah merupakan metode alternatif dari metode
Kjeldahl tetapi waktu analisis yang diperlukan lebih singkat dari metode Kjeldahl,
tidak menggunakan senyawa yang berbahaya, banyak sampel dapat diukur
sekaligus karena perkembangan alatnya yang sudah menggunakan sistem otomatis
(Chang, 1998).
BAB III
METODE KERJA
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat dan fungsinya
No Alat Fungsi
1 Spektrofotometer Untuk mengukur absorban
2 Tabung reaksi Untuk meletakkan sampel
Untuk mengambil larutan dengan
3 Pipet gondok
volume tertentu
4 Pipet tetes Untuk mengambil larutan
5 Pengaduk Untuk mengaduk campuran
Untuk tempat sampel pada
6 Kuvet
pengukuran absorban

3.1.2 Bahan dan fungsinya


No Bahan Fungsi
1 Susu kedelai Sampel protein
2 Akuades Pelarut atau Blanko
3 Coomassie briliant blue Reagen pada metoda Bradford
Larutan standar BSA Larutan standar protein
4
1000 ppm
5 Kalium natrium tartarat Untuk membuat reagen Lowry B
Agar sampel protein menjadi suasana
6 NaOH
alkalis
7 CuSO4.5H2O Untuk membuat reagen Lowry B
8 Follin ciocalteu Reagen metoda Lowry
9 Sampel protein Bahan yang akan di uji

3.2 Cara Kerja

A. Pembuatan kurva standar BSA untuk metoda Bradford


BSA 0,1 g ditimbang dan dilarutkan dalam labu ukur 100 mL dengan
akuades. Kurva standar BSA dapat dibentuk dengan cara membuat pengenceran
BSA secara berseri dari larutan induk dibuat deret standar rotein BSA: 0; 0,1; 0,2;
0,3; 0,4; 0,5; mg/mL msing-masing sebanyak 1 mL. Masukkan 0,5 mL untuk
masing-masing konsentrasi ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan 10 mL pereaksi
Brdford ke tabng reaksi yang sudah berisi. Diinkubasi pada suhu ruang selama 10-
15 menit. Diukur nilai adsorban larutan standar sengan sektrofotometer ada
panjang gelombang 595 nm. Grafik dibuat dengan persamaan regresi.

B. Pengukuran kadar protein dengan metode Brodford

Lakukan pengenceran 5x an 10x samel protein. Ambil 0,5 mL sampel


protein dan ditambahkan 10 mL reagen Bradford.diinkubasi selama 10-15 menit.
Diukur nilai adsorban samel dengan spektrofotometer pada pannjang gelombnag
595 nm. Kemudian hitung konsentrasi sampel protein berdasrakan kurva standar.

C. Pembuatan kurva standar BSA untuk metoda Lowry

BSA 0,1 g ditimbang dan dilarutkan dalam labu ukur 100 mL dengan
akuades. Kurva standar BSA dapat dibentuk dengan cara membuat pengenceran
BSA secara berseri dari larutan induk dibuat deret standar rotein BSA: 0; 0,1; 0,2;
0,3; 0,4; 0,5; mg/mL msing-masing sebanyak 1 mL. Masukkan 2 mL untuk
masing-masing konsentrasi ke dalam tabung reaksi. Kemudian, ditambahkan 1,8
mL Lowry A. Dipanaskan selama 15 menit dan didinginkan pada suhu kamar.
Setelah dingin ditambahkan Lowry B sebanyak 0,2 mL sambil dipanaskan selama
15 menit dan didinginkan pada suhu kamar. Kemudian ditambahkan Lowry C
sebanyak 6 mL dan di panskan kembali selama 15 menit dan didinginkan. Diukur
adsorban pada panjang gelombang 750nm.

D. Penentuan kadar protein metoda Lowry

Lakukan pengenceran 5x an 10x samel protein. Ambil 2 mL sampel protein.


Ditambahkan 1,8 mL Lowry A. Dipanaskan selama 15 menit dan didinginkan
pada suhu kamar. Setelah dingin ditambahkan Lowry B sebanyak 0,2 mL sambil
dipanaskan selama 15 menit dan didinginkan pada suhu kamar. Kemudian
ditambahkan Lowry C sebanyak 6 mL dan di panskan kembali selama 15 menit
dan didinginkan. Diukur adsorban pada panjang gelombang 750nm.
3.3 Skema Kerja
A. Pembuatan kurva standar BSA untuk metoda Bradford

BSA1000 ppm

- Diencerkan 10 ppm dalam labu ukur 100 mL

Larutan induk

- Dibuat larutan deret standar 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5


mg/mL
- Masing-masing dimasukkan 0,5 mL kedalam tabung
reaksi
- Ditambahkan 10 mL pereaksi Bradford
- Inkubasi suhu ruang selama 10-15 menit
- Diukur nilai absorban pada λ = 595 nm
- Dibuat grafik

Hasil

B. Pengukuran kadar protein dengan metoda Bradford

Sampel protein

- Dilakukan pengenceran 5x dan 10x


- Diambil 0,5 mL sampel protein
- Dimasukkan reagen Bradford
- Ikuti prosedur 3-4
- Diukur nilai absorban larutan standar dan sampel
- Dihitung konsentrasi sampel protein

Hasil
C. Pembuatan kurva standar BSA untuk metoda Lowry

BSA 1000 ppm

- Diencerkan 10 ppm dalam labu ukur 100 mL

Larutan induk

- Dibuat deret standar 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/mL


- Disiapkan masing-masing konsentrasi 2 mL
- Ditambahkan 1,8 mL reagen Lowry A
- Dikocok dan diinkubasi selama 10 menit suhu 50 oC
- Didiamkan selama 20 menit
- Ditambahkan 0,2 mL reagen Lowry B
- Dikocok dan diinkubasi suhu kamar selama 10 menit
- Ditambahkan reagen Lowry D
- Diinkubasi selama 10 menit pada suhu 50 oC
- Didiamkan selama 20 menit
- Diukur serapan pada panjang gelombang 750 nm
- Dibuat grafik
Hasil

D. Penentuan Kadar Protein Metoda Lowry

Sampel protein

- Dilakukan pengenceran 5x dan 10x


- Diambil 2 mL sampel protein
- Dimasukkan reagen Bradford
- Ikuti prosedur 3 - 6l
- Dihitung konsentrasi sampel protein
Hasil
IV. DATA DAN PERHITUNGAN
4.1 Data
1. Pembuatan Kurva Standar BSA untuk Metoda Bradford
Panjang gelombang Konsentrasi Absorban
595 nm 0 0,133
595 nm 10 0,159
595 nm 20 0,192
595 nm 30 0,196
595 nm 40 0,188
595 nm 50 0,182
Sampel 5X 0,180

2. Pembuatan Kurva Standar BSA untuk Metoda Lowry


Panjang gelombang Konsentrasi Absorban
750 nm 0 0,049
750 nm 10 0,048
750 nm 20 0,044
750 nm 30 0,044
750 nm 40 0,063
750 nm 50 0,057
Sampel 5X 0,046

4.3 Perhitungan
A. Pengenceran dari larutan induk

M1 V1 = M2 V2

100 mg/mL 100mL= 1000 mg/mL V2


V2 = 10 mL
B. Pengenceran untuk variasi konsentrasi
1. Konsentrasi 0 mg/mL

M1 V1 = M2 V2
0 mg/mL .10mL= 100 mg/L . V2
V2 = 0 mL
2. Konsentrasi 10 mg/mL

M1 V1 = M2 V2
10mg/mL.10mL= 100 mg/mL . V2
V1 = 1 mL
3. Konsentrasi 20 mg/mL

M1 V1 = M2 V2
20mg/mL.10mL= 100 mg/mL . V2
V2 = 2 mL
4. Konsentrasi 30 mg/mL

M1 V1 = M2 V2
30mg/mL.10mL= 100 mg/mL . V2
V2 = 3 mL
5. Konsentrasi 40 mg/mL

M1 V1 = M2 V2
40mg/mL.10mL= 100 mg/mL . V2
V2 = 4 mL
6. Konsentrasi 50 mg/mL

M1 V1 = M2 V2
50mg/mL.10mL= 100 mg/mL . V2
V2 = 5 mL

B. Pengukuran Kadar Protein Metoda Bradford


Konsentrasi Absorban
0 0,133
10 0,159
20 0,192
30 0,196
40 0,188
50 0,182
5X 0,180

Tabel dan persaman regresi

X Y Xy x2
0 0,133 0 0
10 0,159 1,59 100
20 0,192 3,84 400
30 0,196 5,88 900
40 0,188 7,52 1600
50 0,182 9,10 2500
Σ x = 150 ΣY = 1,05 Σxy = 27,93 Σ x2 = 5500

X = konsentrasi
Y = absorban
n.Σxy - Σx.Σy
B =
n. Σx 2 - (Σx)2
6(27 ,93) – 15 0(1,05)
=
6(55 00 ) - (15 0 )2
= 0,001
A = ý – B.x́
= 0,175 – 0,001 . 25
= 0,150
Persamaan regresi
Y =A+BX
= 0,150 + 0,001 X
Penentuan konsentrasi sampel
5x 0,180
Y = 0,180
Y = A + Bx
0,180 = 0,150 + 0,001 X
X = 30 mg/mL

C. Pengukuran Kadar Protein Metoda Lowry


Konsentrasi Absorban
0 0,049
10 0,048
20 0,044
30 0,044
40 0,063
50 0,057
5X 0,046
Tabel dan persamaan regresi

X Y Xy x2
0 0,049 0 0
10 0,048 0,48 100
20 0,044 0,88 400
30 0,044 1,32 900
40 0,063 2,52 1600
50 0,057 2,85 2500

Σ x = 150 ΣY = 0,305 Σxy = 8,05 Σ x2 = 5500

X = konsentrasi Y = absorban
n.Σxy - Σx.Σy
B =
n. Σx 2 - (Σx)2
6(8,05) – 15 0( 0,3 05 )
=
6(55 00 ) - (15 0 )2
= 0,0002
A = ý – B.x́
= 0,0508 – 0,0002 . 25
= 0,045
Persamaan regresi
Y = A + BX
= 0,045 + 0.0002 X

Penentuan konsentrasi sampel


5x 0,046

Y = 0,046
Y = A + Bx
0,046 = 0,045 + 0.0002 X
X = 5 mg/mL
IV.3 Grafik

Penentuan Kadar Protein Metode Bradford


0.25

0.2
f(x) = 0 x + 0.15
R² = 0.54
Adsorban

0.15

0.1

0.05

0
0 10 20 30 40 50 60
konsentrasi

Penentuan Kadar Protein Metode Lowry


0.07
0.06
0.05 f(x) = 0 x + 0.04
R² = 0.35
Adsorban

0.04
0.03
0.02
0.01
0
0 10 20 30 40 50 60
konsentrasi
5.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini mengenai pengukuran kadar protein dengan metode
Bradford dan Lowry digunakan yang bertujuan melakukan analisa kadar protein
dalam suatu sampel menggunakan kurva standar protein. Sampel yang digunakan
adalah susu kedelai yang akan ditentukan kadar proteinnya. Penentuan kadar
protein pada sampel menggunakan kurva standar protein dari larutan standar BSA
( Bovin Serum Albumin).
Larutan standar BSA dibuat dengan berbagai variasi konsentrasi. Hal ini
bertujuan untuk membuat kurva standar protein dalam menentukan kadar protein
dalam sampel. Deret standar protein BSA yang digunakan adalah
0;0,1;0,2;0,3;0,4;0,5 mg/mL.
Pereaksi Bradford digunakan untuk membentuk kompleks yang akan
memberikan warna pada larutan. Warna yang terbentuk adalah warna biru. Hal ini
bertujuan agar larutan dapat diukur absorban dengan menggunakan
spektrofotometer. Syarat pengukuran dengan spektrofotometer adalah larutan
harus berwarna dan transparan. Pengukuran absorban larutan standar dengan
metoda bradford dilakukan pada panjang gelombang 595 nm. Pada
pengukurannya nilai absorban yang didapatkan terlalu besar, dan larutan harus
diencerkan kembali, karena reagen bradford yang digunakan tidak pada suhu
rendah lagi, dan telah teroksidasi oleh udara bebas. Pada pengukuran didapatkan
hasil yang tidak sesuai denga teori, dimana seharusnya konsentrasi dari larutan
besar maka sinar yang diserap juga besar, tetapi hasil yang didapatkan nilai
absorbaannya tidak sesuai dengan teori.
Pada metoda lowry dilakukan pada panjang gelombang 750 nm, karena
merupakan panjang gelombang serapan optimum dari larutan standar. Pada
pengukuran didapatkan juga hasil yang tidak sesuai denga teori, dimana
seharusnya konsentrasi dari larutan besar maka sinar yang diserap juga besar,
tetapi hasil yang didapatkan nilai absorbaannya naik turun.
Dari nilai absorban larutan standar didapatkan nilai absorban dari berbagai
variasi konsentrasi larutan standar. Nilai absorban diplotkan untuk mendapatkan
persamaan garis lurus. Nilai y merupakan nilai absorban, a merupakan intersep, b
merupakan kemiringan (gradien), dan x merupakan konsentrasi sampel yang
ditentukan.
Penentuan kadar protein dapat dianalisis menggunakan dua metode yaitu
Bradford dan Lowry. Pada metoda Bradford analisa kadar protein berdasarkan
serapan sinar dimana konsentrasi protein besar sehingga sinar yang diserap juga
besar. Pada metode Lowry analisa kadar protein berdasarkan intensitas warna
dimana konsentrasi protein besar maka intensitas warna juga besar. Keuntungan
pada metoda Bradford adalah akurat karena ditentukan berdasarkan nilai
absorban, lebih sederhana karena hanya memakai satu pengompleks, dan
pengerjaan yang lebih cepat. Sedangkan pada Lowry banyak penggangu pada
pengukuran analisa kadar protein. Selain itu juga banyak menggunakan reagen,
semakin banyak reagen yang dimasukan kemungkinan kesalahan juga besar.
Dari percobaan metoda Bradford didapatkan persamaan regresi dari
larutan standar BSA (Bovin Standar Albumin) sebesar y = 0,150 + 0,001 X.
Dengan konsentrasi sampel yang didapatkan pada pengenceran 5x sebesar 30
mg/mL. Sedangkan pada metoda lowry didapatkan persamaan regresi dari larutan
standar BSA (Bovin Standar Albumin) sebesar y = 0,045 + 0.0002 X. Dengan
konsentrasi sampel yang didapatkan pada pengenceran 5x 5 mg/mL.
Kesalahan yang mungkin terjadi yaitu kurang teliti dalam pengenceran
sehingga didapatkan konsentrasi yang salah serta pengukuran nilai absorban yang
tidak sesuai dengan teori dimana semakin besar konsentrasi maka semakin besar
nilai absorban. Dimana didapatkan secara percobaan naik-turun.
VI. KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
Dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa :
a. Kurva standar protein pada metoda bradford yang didapatkan persamaan
regresi sebesar y = 0,150 + 0,001 X
b. Kurva standar protein pada metoda Lowry yang didapatkan persamaan
regresi sebesar y = 0,045 + 0.0002 X
c. Pengukuran kadar protein dari sampel dapat dilakukan dengan metoda
Bradford lebih teliti dibandingkan Metode Lowry.
d. Pengukuran kadar protein pada metoda bradford dilakukan pada panjang
gelombang 595 nm dan 750 nm pada metoda lowry.

6.2 Saran
Untuk kelancaran praktikum selanjutnya maka disarankan agar:
a. Lakukan inkubasi sesuai waktu di prosedur
b. Pahami kerja alat spektrofotometer dan teliti saat melakukan pengukuran
c. Lakukan pengeceran jika sampel yang digunakan terlalu pekat.
DAFTAR PUSTAKA

Dr. R. H. 2005. Analisis Makan 2 Analisis Protein. Jakarta : Erlangga

Herdyastuti, Nuniek. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Ekstraksi Kadar Enzim


Bromelin dari Batang Nanas. Berk. Penel Hayati : 12 (75-77)

Lehninger, Albert. 1997. Dasar-dasar Biokimia Jilid I. Jakarta : Elangga.


Lampiran I. Tugas Sebelum Praktikum

1. Jenis protein berdasarkan strukturnya:


a. Struktur primer adalah struktur dasar dari protein. Struktur primer protein
menentukan identitas, mengatur struktur sekunder, tersier, dan kuartener.
Struktur primer protein dibentuk oleh ikatan peptida yang
menghubungkan asam amino penyusun protein.
b. Struktur sekunder protein terbentuk oleh adanya ikatan hidrogen antar
asam amino dalam rantai protein sehingga strukturnya tidak lurus,
melainkan bentuk coil. Ikatan hidrogen terutama terjadi pada asam amino
yang memiliki gugus hidroksil, amida dan fenol.
c. Struktur tersier. Dengan adanya ikatan antar asam amino-ikatan
hidrogen, interaksi hidrofobik, jembatan garam, interaksi elektrostatik
dan jembatan sulfida pada struktur molekul protein sehingga terbentuk
struktur tersier.
d. Struktur kuartener terbentuk oleh adanya interaksi antar beberapa rantai
molekul protein yang berbeda melalui ikatan hidrogen, interaksi
hidrofobik, interaksi elektrostatik, dan jembatan sulfida. Struktur kolagen
dan insulin membentuk struktur kuartener.
3. Fungsi protein antara lain:
Sebagai enzim, senyawa transport, protein kontraktil, protein regulator,
katalisator, dan protein struktural.
4. Reaksi protein yang terjadi pada dua metoda yang digunakan.
- Metode Bradford
Protein akan diikat oleh pereaksi pewarna CBB yang panjang gelombang
595 nm.
- Metode Lowry
Memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi
protein.