8/4/2015

VALIDASI & VERIFIKASI

METODA MIKROBIOLOGI
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
1

Penentu Kehandalan
Analisis Mikrobiologi

Metode Analisa Peralatan Analis/Pelaksana

• Metode Standar
• Neraca • Pengetahuan
• Modifikasi
• LAF • Ketrampilan/kompeten
• Penyederhanaan
• Pipet • Ketelitian
• Inkubator
• Autoklaf

VALIDASI &
VERIFIKASI METODE TRAINING &
KALIBRASI UJI
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
KOMPETENSI

1
 8/4/2015

Jenis Metode Uji

Metode Standar : SNI, ASTM, ISO, dll

Metode Resmi : Farmakope, EPA, dll
Metode yang dikembangkan oleh organisasi
profesional yang memiliki reputasi nasional dan
internasional : AOAC, BAM
Metode Pustaka
In house methode
Metode Modifikasi

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
3

Pemilihan Metode
Faktor yang menjadi pertimbangan :
Asal metode
Status metode
Apakah lab. menguasai teknologinya ?
Apakah SDM/Analis kompeten ?
Biaya & waktu yang dibutuhkan
Metode mudah diaplikasikan
Kondisi akomodasi & peralatan lab. memadai ?

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
4

2
 8/4/2015

Proses untuk mengkorfimasi bahwa

suatu metoda mempunyai unjuk kerja
yang konsisten, sesuai dengan apa
yang dikehendaki dalam penerapan
metode,,,,

Apa itu Validasi ???

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
5

Kapan Validasi dilakukan ??

Metode
non standar

Reagent VALIDASI Menyederhanakan

Baru METODE Metode

In house
Method

Validasi harus dilakukan sebelum setiap metode non standar

digunakan secara RUTIN di Laboratorium
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
6

3
 8/4/2015

Mengapa dilakukan
Validasi ???
ISO/IEC 17025-2005, elemen 5.4 Metode uji &
Validasi metode.
Banyak lab. menggunakan metode uji dari manual
book/alat bukan metode standar/resmi (SNI, ISO,
AOAC, BAM, USP,dll).
Lab. di daerah kesulitan mendapatkan reagensia/media
tertentu biaya, ED singkat memangkas metode
standar.
In house method sebagai alternatif yaitu dengan
memodifikasi metode standar.
Bukti metode baru dapat digunakan/diadopsi oleh Lab dengan
mengevaluasi kemampuan kinerja metode uji,,,
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
7

Apa yang akan dibuktikan dalam Validasi ?

membuktikan bahwa metoda baru dapat
menghasilkan paling tidak hasil yang
sebanding dengan Metoda Standar yang
dikenal (Australian Standar, ISO standar,
BAM, AOAC method, dll).
mempunyai tingkat sensitifitas &
spesifisitas yang sama & dapat diterapkan
dalam kisaran matrik contoh yang biasa
diterima laboratorium untuk pengujian
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
m.o. dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
8

4
 8/4/2015

Konfirmasi melalui pengujian dan

penyajian bukti bahwa persyaratan
yang telah ditetapkan telah di penuhi

Apa itu Verifikasi ???

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
9

Apa yang akan dibuktikan

dalam Verifikasi ?

Membuktikan bahwa metoda

standar yang digunakan telah sesuai
dengan kriteria yang ditetapkan,,
Mempertimbangkan dan memastikan apakah
metode uji tersebut dapat dipakai atau tidak

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
10

5
 8/4/2015

METODA PENGUJIAN
mikrobiologi
Kuantitatif
Hitungan Cawan
- Pour plate : TPC, Y&M, Coliform, Enterobacteriaceae
- Spread Plate : S.aureus, B.cereus
MPN : Coliform, E.coli
Petrifilm : TPC, Y&M, Coliform
dll

•Kualitatif
Isolasi
- Salmonella
- Vibrio Cholera
- L.monocytogenes
- dll M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
11
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo

Parameter Validasi & Verifikasi

Metode Uji

Kuantitatif Kualitatif

Presisi Sensitifitas
Akurasi Spesifisitas
False Positif
False Negatif
Efficiency
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
12

6
 8/4/2015

Presisi
Kedekatan hasil antara beberapa hasil pengukuran ulang yang
diukur dengan cara yang sama.
Parameter :
Relatif Standar Deviasi
Koefisien Variasi

Repeatability
Waktu analisa, alat, penguji/analis sama dalam laboratorium yang
sama.

Intermediate Precision
Waktu analisa atau alat atau penguji/analis beda dalam
laboratorium yang sama (variasi inter laboratorium)

Reproducibility
Waktu analisa, alat, penguji/analis beda dalam laboratorium yang
berbeda.
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
13

Presisi

∑ ((Log a – log b) / x1)2

RSD =
2n

CV (coefisien of variation) = RSD x 100%

Syarat :

RSD = max. 0,1 (ideal < 0,02)

CV = max.10 %
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
14

7
 8/4/2015

Akurasi
Kedekatan hasil analisis dengan nilai sebenarnya.
Parameter :
Recovery (Perolehan Kembali)
Teknik analisis yang dilakukan dengan menambahkan
kultur acuan pada konsentrasi tertentu dalam suatu
matriks contoh.
Perhitungan
H x 100 %
A
H = Hasil pengujian dengan metode (sample + spike) -
sample
A = Hasil sebenarnya dari MO target (spike)
Syarat : > 70 %
Catatan : Gunakan sample yang tidak mengandung MO
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
15

Sensitifity : kemampuan metoda dalam

memberikan hasil positif terhadap sampel
yang positif

Spesificity : kemampuan metoda dalam

memberikan hasil negatif terhadap sampel
yang negatif

False positive rate : persentase jumlah sampel

yang salah identifikasi sebagai positif

False negative rate : persentase jumlah sampel

yang salah identifikasi sebagai negatif
Confidence limit :95 %
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
16

8
 8/4/2015

Tahapan Validasi/Verifikasi

Memilih Organisme Uji

Memilih matriks sample
Melakukan pengujian sesuai prosedur
Interpretasi hasil

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
17

Syarat,,,,

Menggunakan peralatan yang

terkalibrasi
Dilakukan oleh personil yang kompeten
Media/Reagent yang digunakan sesuai
spesifikasinya.
Kondisi lingkungan memadai

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
18

9
 8/4/2015

Memilih Organisme Uji

Sesuai SR 02
- MO acuan berasal dari koleksi yang diakui
- Menjamin ketertelusuran
- Dipelihara oleh Penanggungjawab MO acuan
- Pemeliharaan sebagai berikut :

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
19

Strain (ATCC, NTCC)

Subkultur sekali

*
Persediaan acuan
(Liofilisasi)

Dicairkan

Kultur kerja

*
(Penggunaan rutin)
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
* : uji kemurnian dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
20

10
 8/4/2015

Memilih Organisme Uji

3-5 strain untuk validasi dan min. 1 strain untuk
verifikasi dari organisme target.
Kultur acuan yang dinyatakan sebagai kontrol positif
harus merupakan salah satu dari strain tersebut.
Strain yang lain dipilih dari hal berikut :
Strain dari organisme target yang diisolasi oleh
laboratorium dari sampel terdahulu dalam matrik
yang diperiksa.
Strain dari organisme target yang dikumpulkan oleh
cultur collection.

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
21

Memilih Matrik Sampel

Tujuan seleksi sampel adalah untuk memilih
sampel yang mewakili lingkup variasi yang
akan ditemui dalam matriks yang telah
ditentukan.
Dapat menggunakan sample yang tercemari
secara alami atau dapat menggunakan sample
yang dicemari (spike sample).
Perhatian harus diutamakan pada mendeteksi
jumlah dan homogenitas kontaminan.
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
22

11
 8/4/2015

Metode Spike Sample

Menghitung Populasi pada Biakan Murni

Hari ke 1

1 loop
Inkubasi selama
18-24jam pada
suhu 35-37 0C
Biakan murni BHI-
dalam agar Broth/media
miring lainnya 10 ml

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
23

Metode Spike Sample

Menghitung Populasi pada Biakan Murni

Hari ke 2
Dst 10-7 10-8 10-9
10-1 10-2 10-3
.

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
1 ml
BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml
10 ml 1 ml

Hit. Jumlah Inkubasi selama 48

koloni/ml jam pada suhu 36±1 0C
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
24

12
 8/4/2015

Metode Spike Sample

Menghitung Populasi pada Biakan Murni
Hari ke 4
Menghitung jumlah bakteri dalam cawan petri

Ulangan 10-7 10-8 10-9 Hasil

1 241 24 3 2,4 x 109 kol/ml

2 238 22 2

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
25

Persiapan matriks

Pipet 100 gr/ ml 900 ml BPW

sample (Buffer Peptone Water)

Homogenisasi

Catatan,,,
Gunakan sample yang
tidak tercemari MO target
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
26

13
 8/4/2015

Pembuatan Spike Populasi Rendah

Dst
10-1 10-2 . 10-8

90 ml
sample
1 ml 1 ml 10 ml
1 ml
BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml
10 ml Didapatkan 1 : 10
spike sample
populasi rendah
(2 kol/ml atau/gr)
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
27

Pembuatan Spike Populasi Sedang

Dst
10-1 10-2 . 10-7

90 ml
sample
1 ml 1 ml 10 ml
1 ml
BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml
10 ml Didapatkan 1 : 10
spike sample
populasi sedang
(2,0 x 101 kol/ml
atau/gr)
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
28

14
 8/4/2015

Pembuatan Spike Populasi Tinggi

10-1 10-2 10-6

90 ml
sample
1 ml 1 ml 1 ml 10
ml
BHI-Broth BPW 9 ml BPW 9 ml BPW 9 ml
10 ml Didapatkan 1 : 10
spike sample
populasi tinggi
(2,0 x102 kol/ml atau /gr)

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
29

Prosedur Validasi & Verifikasi

Kuantitatif (Hitungan Cawan)

- Lakukan pengujian sedikitnya 15 kali

(perkiraan populasi pada contoh : rendah, sedang, tinggi)

- Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila

menggunakan metode spike sample) atau tidak
mengandung organisme target.

- Hitung RSD dari masing-masing populasi dan gabungan

semua populasi.
Catatan. Jika dilakukan oleh analis berbeda, dapat dihitung presisi dari masing-
masing analis untuk mengetahui kinerja analis
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
30
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo

15
 8/4/2015

Kuantitatif MPN (Most Probable Number)

Kriteria
Sensitifity
Spesificity
False positive rate
False negative rate
Efficiency
Confidence limit :95 %

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
31

Prosedur

Siapkan sampel (kontaminasi alami atau sengaja) sesuai

prosedur.
Inokulasi larutan contoh pada media atau tabung-tabung
pertumbuhan.
Hitung jumlah tabung yang positif dan negatif.
Konfirmasi dengan uji biokimia terhadap koloni yang
terdapat pada cawan atau setiap tabung yang positif dan
negatif.
Hitung Sensitifity, Spesificity, False Positif, False
Negatif, dan Efficiency.

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
32

16
 8/4/2015

Konfirmasi

Validasi
Semua presumptive positive dan negative
harus dikonfirmasi

Verifikasi
Semua presumptive positive yang
dikonfirmasi
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
33

Perhitungan
Confirmed Presumtive

Positif Negatif

Positif A B
(positive) (false negative)
Negatif C D
(false positive) (negative)
Sensitifitas = A/(A+B) x 100
Efficiency = (a+d)/n x 100
Spesifitas = D/(C+D) x 100
False positive rate = c/(a+c) x 100
False negatif rate = b/(b+d) x 100
Jumlah tabung : a + b + c + d = n
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
34

17
 8/4/2015

Kualitatif

Lakukan pengujian sedikitnya 10 kali

(perkiraan populasi pada contoh :

rendah dan tinggi)

- Lakukan juga sample tanpa

diinokulasi (bila menggunakan metode
spike sample) atau tidak mengandung
organisme target.

-Hitung Sensitifity, Spesificity, False

Positif, False Negatif, dan Efficiency
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
35

Penghitungan Verifikasi
Confirmed Presumtive
positif negatif
A B
positif (positive) (false
negative)
negatif C D
(false positive) (negative)

Sensitifitas = A/(A+B) x 100

Spesifitas = D/(C+D) x 100 Jumlah contoh : a + b + c + d = n

False positive rate = c/(a+c) Efficiency = (a+d)/n x 100

False negatif rate = b/(b+d)

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
36

18
 8/4/2015

Perhitungan Validasi
Confirmed Metoda non standar
positif negatif
A B
positif (positive) (false negative)

negatif C D
(false positive) (negative)

Sensitifitas = A/(A+B) x 100

Spesifitas = D/(C+D) x 100 Jumlah contoh : a + b + c + d = n

False positive rate = c/(a+c) x 100 Efficiency = (a+d)/n x 100

False negatif rate = b/(b+d) x 100
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
37

Method Validation of Microbiological

Methods,
Guidance Note : C & B and ENV 002.
Singapore Acreditation Council,
July 2002
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
38

19
 8/4/2015

Kapan Validasi kultur Media

dilakukan ?
Kultur media diganti dengan media baru
(XLD Agar diganti dengan Rambach Agar)
Kultur media diganti dengan brand lain
(OXOID diganti dengan MERCK)
Kultur media diganti dengan non kultur test
(XLD diganti dengan Singlepath Salmonella)
Metode kultur diganti dengan metode lain
Mis. ELISA, PCR
39

Performance Kultur Media

Misalnya : media Baird Parker Agar untuk pengujian S.aureus
Reference media : TSA

Parameter Strain Uji Kriteria Karakteristik koloni

Produktivitas S.aureus ATCC 25923 Kuantitatif > 0,5 Black colonies with
lightening halo
Selektivitas E.coli ATCC 25922 Kualitatif Total -
penghambat
Elektivitas S.epidermidis ATCC 12228 Kualitatif - Black colonies without
lightening halo

PRoduktivitas = Test method

Reference method

Non Selektif : > 0.7

40

20
 8/4/2015

The end…..
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam
Mbentuk
-BRIO apapun
Trainingtanpa ijin tertulis
Proprietary - dilarang Embrio Biotekindo
dari menggandakan 16
41
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo

21