Morfologi Spermatozoa Manusia setelah Simpan Beku dengan

Medium TES-Tris Yolk Citrat (TES-TYC)

Muhammad Anwar Djaelani*

Laboratorium Biologi Struktur dan Fungsi Hewan

Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro, Semarang
*muhammadanwardjaelani@rocketmail.com

ABSTRACT

The aim of this research was to evaluate the effect of semen cryopreservation using TES-
Tris yolk citrat (TES-TYC) medium on morphology of the sperm. Semen fulfilling
inclusion criteria with WHO criteria. The sperm vitality was counted by initial data. The
semen was mixed with TES-TYC medium and cryopreserved in liquid nitrogen. After
one mounth the semen was thawed and recounted its sperm morphology. The data
showed that the morphology of post freezing sperm cryopreserved was not significant
different compared to the morphology of pre freezing sperm. It could be concluded that
morphology of human sperm could not as indicator to evaluate the effect of semen
cryopreservation using TES-Tris yolk citrat (TES-TYC).

Key word : Sperm Morphology, semen cryopreservation.

ABSTRAK

Penelitian tentang morfologi spermatozoa manusia setelah simpan beku dengan medium
TES-Tris yolk citrat (TES-TYC) bertujuan untuk mengevaluasi dampak simpan beku
semen terhadap morfologi spermatozoa. Semen yang memenuhi kriteria inklusi sesuai
dengan kriteria WHO, dilakukan penghitungan morfologinya sebagai data awal.
Selanjutnya semen dicampur dengan medium TES-TYC kemudian disimpan beku dalam
nitrogen cair. Setelah tersimpan satu bulan spermatozoa dituai kemudian dihitung
kembali morfologinya. Data yang didapat menunjukkan bahwa morfologi spermatozoa
post freezing tidak berbeda bermakna dengan morfologi spermatozoa pre freezing Dapat
disimpulkan bahwa data morfologi spermatozoa tidak dapat dijadikan indikator untuk
melihat dampak simpan beku spermatozoa dengan menggunakan medium simpan beku
TES-Tris yolk citrat (TES-TYC).

Kata kunci : Morfologi spermatozoa, simpan beku semen

32
PENDAHULUAN Medium yang banyak
Simpan beku semen (semen digunakan adalah medium TES-Tris
cryopreservation) merupakan yolk citrat (TES-TYC) (Weidel &
penyimpanan semen pada suhu Prins, 1987). Penelitian Prins &
sangat rendah dalam nitrogen cair, Weidel (1986) menunjukkan
dengan medium simpan beku medium TES-TYC dapat
tertentu sebagai protektor. Simpan mempertahankan motilitas
beku semen digunakan untuk spermatozoa post freezing 83 % dari
menanggulangi masalah dalam pre freezing. Mengingat hal tersebut
reproduksi, baik pada manusia medium TES-TYC
maupun hewan. Hal yang perlu direkomendasikan sebagai
dipertimbangkan dalam simpan beku cryoprotective medium untuk simpan
semen adalah dampak dari proses beku spermatozoa manusia (Weidel
pendinginan. Proses pendinginan & Prins, 1987; Hallack et.al.,1996).
akan menyebabkan terbentuknya Berdasarkan uraian tersebut di atas
kristal es intrasellular yang pada saat timbul permasalahan apakah medium
penghangatan kembali (thawing) TES-TYC dapat melindungi
mengalami rekristalisasi. Kristal es spermatozoa manusia selama proses
hasil rekristalisasi ini merupakan simpan beku sehingga spermatozoa
faktor fisik yang mengakibatkan tidak mengalami perubahan
kerusakan sel hingga sel mengalami morfologi. Penelitian ini bertujuan
kematian (Wetzels, 1996; Henry et untuk mengevaluasi dampak simpan
al., 1993). Penggunaan medium beku semen dengan medium TES-
simpan beku dapat mempertahankan TYC terhadap morfologi
agar spermatozoa tidak mengalami spermatozoa setelah simpan beku.
kerusakan selama simpan beku. Pada proses pendinginan,
ketika titik beku dicapai air

33
intrasellular yang tidak sempat spermatozoa post thawing relatif
keluar sel, akan membeku di dalam tinggi, oleh karena itu medium
sel dan membentuk kristal es yang tersebut direkomendasikan sebagai
berukuran kecil sebagai materi yang cryoprotective medium untuk simpan
kompak (Henry,1993 ; beku spermatozoa manusia. Medium
Wetzels,1996). Kristal es TESTYC mengandung TES-Tris dan
intrasellular ini saat penghangatan Na-sitrat sebagai buffer, gliserol
kembali (thawing) akan beragregasi sebagai cryoprotectant, kuning telur,
dan dapat menyebabkan kerusakan dan fruktosa sebagai sumber energi.
sel yang berakibat kematian sel TES-Tris merupakan buffer yang
(Mazur,1977). Kematian sel dapat berfungsi baik pada pre-freeze
diketahui dengan pengujian vitalitas maupun post-thawing. TES-Tris
spermatozoa (Girraud et. al., 2000). buffer dapat mengikat ion hidrogen
Upaya untuk mempertahankan agar pada medium sehingga
spermatozoa tidak mengalami mempercepat proses dehidrasi.
kerusakan selama simpan beku, (Weidel & Prins, 1987)
adalah dengan cara menambah Gliserol dalam medium merupakan
semen dengan medium tertentu cryoprotectant yang dapat
sebelum dilakukan simpan beku. melindungi spermatozoa dari
Medium simpan beku spermatozoa kerusakan selama proses
umumnya mengandung buffer dan pendinginan berlangsung (Winarso
cryoprotectant. Medium TES-Tris & Hinting, 1999). Pada medium
yolk citrat (TESTYC) merupakan simpan beku tanpa gliserol, hasil
medium yang sering digunakan pada thawing yang didapat menunjukkan
simpan beku spermatozoa. Medium survival spermatozoa yang lebih
tersebut merupakan medium yang rendah dibanding medium yang
dapat mempertahankan motilitas mengandung gliserol. Kondisi

34
tersebut menunjukkan bahwa gliserol merupakan salah satu komponen
dalam medium simpan beku dapat medium TES-TYC (Prins & Weidel,
berfungsi sebagai cryoprotectant 1986). Struktur dan fungsi
dan sangat penting untuk spermatozoa post freezing yang
mempertahankan survival disimpan dengan medium TES-TYC
spermatozoa. Pada proses thawing, lebih baik dibanding struktur dan
simpan beku dalam medium tanpa fungsi spermatozoa post freezing
gliserol menyebabkan terjadinya yang disimpan dengan gliserol saja
penurunan recovery of motile (Hallack et.al.,1996).
spermatozoa oleh karena terjadi Fluiditas merupakan hal penting
penurunan survival spermatozoa. secara biologis bagi membran sel
Dengan adanya gliserol sebagai (Albert et al. 1994). Aktivitas enzim
cryoprotectant dalam medium, dan proses transport melalui
motilitas post thawing akan lebih membran akan terhenti bila struktur
terjaga (Prins & Weidel, 1986). bilayer menjadi kaku. Fluiditas lipid
Kuning telur dalam medium TES- bilayer membran sangat tergantung
TYC bukan merupakan pada temperatur dan komposisinya.
cryoprotectant tetapi berfungsi Pada temperatur rendah, rantai
mempertahankan fluiditas membran phospholipid pada membran berubah
sel (Mortimer,1994). Pada kuning dari fase sol menjadi fase gel,
telur terdapat lemak yang antara lain perubahan tersebut disebut sebagai
tersusun atas gliserol dan kolesterol. fase transisi. Hal ini yang
Komponen tersebut diketahui dapat menyebabkan membran sulit
mempertahankan integritas sel pada membeku. Disamping itu adanya
saat terjadi penurunan suhu. ikatan ganda cis yang membentuk
(Mortimer,1994 ; Albert et al.,1994 ; lekukan pada rantai hidrokarbon dan
Hafez, 1968). Kuning telur ayam membuat rantai hidrokarbon sulit

35
bersatu, sehingga membran tetap METODE PENELITIAN
fluid pada temperatur rendah. Penelitian ini merupakan penelitian
Disamping phospholipid, lipid eksperimental murni dengan
bilayer pada membran sel juga menggunakan Rancangan Acak
tersusun atas kolesterol. Pada Lengkap (RAL) sebagai rancangan
konsentrasi rendah kolesterol dasar (Munawar, 1995) Pelaksanaan
menyebabkan membran sel menjadi Penelitian ini menggunakan fasilitas
kurang fluid tetapi pada konsentrasi Laboratorium Andrologi Rumah
yang tinggi, kolesterol mencegah Sakit Telogorejo Semarang.
rantai karbon bergabung sehingga Semen yang diambil dari 30 pria
mencegah membran menjadi kaku dewasa digunakan sebagai sampel
(rigid) (Albert et al., 1994 ; Anonim, dalam penelitian ini. Penelitian ini
2000) menggunakan kriteria inklusi
Fruktosa dengan konsentrasi 2 % meliputi : volume semen, jumlah
dalam medium TESTYC merupakan leukosit dalam semen, pH semen,
penyimpan sumber energi bagi kekentalan semen, dan jumlah,
spermatozoa pada kondisi in vitro, motilitas serta vitalitas spermatozoa
sedangkan keberadaan sitrat pada sesuai kriteria WHO (Anonim,1999).
medium berfungsi sebagai buffer dan Tiga puluh sampel semen tersebut
tersusun dalam bentuk Na-sitrat. kemudian ditambahkan medium
Untuk mereduksi keasaman TES-TYC selanjutnya disimpan
dilakukan dengan cara mengeluarkan beku dalam nitrogen cair
ion H+ dari dalam sel. Satu ion H+ Variabel penelitian ini adalah
akan dipompa keluar dari sel untuk morfologi spermatozoa yang diamati
tiap Na+yang masuk ke dalam sel. sebelum dan sesudah simpan beku.
Dengan demikian pH intrasellular Pengujian ketepatan metode simpan
akan terjaga sekitar 7,2. beku dilakukan dengan menghitung

36
Cryosurvival Factor (Mortimer, menggunakan program komputer
1994). SPSS (Santosa, 1999)
Pembuatan medium TEST-Tris yolk
HASIL DAN PEMBAHASAN
citrat (TES-TYC) sesuai metode
Tabel 1. Hasil penghitungan rerata
Winarso & Hinting,1999 ; Prins & morfologi spermatozoa normal
sebelum dan setelah simpan beku
Weidel 1986 ; Mortimer, 1994. (dalam %)
Penyimpanan semen (semen
Morfologi Morfologi
cryopreservation) sesuai metode sebelum simpan setelah simpan
beku beku
Winarso & Hinting (1999). Penuaian 23,20 ± 4,09a 22,65 ± 3,89a
(thawing) semen sesuai dengan Keterangan : Data yang diikuti superscrip
yang sama menunjukkan
metode Weidel & Prins (1987). berbeda tidak nyata. Data
yang diikuti superscrip yang
Data hasil penelitian diuji pola berbeda menunjukkan
berbeda nyata.
distribusinya dengan menggunakan
uji Kolmogorov-Smirnov, dan Price & Wilson (1995),
dilanjutkan dengan uji homogenitas menyatakan bahwa gangguan yang
variansi. Hasil uji pola distribusi hebat pada sel menyebabkan
menunjukkan semua data mengikuti kerusakan yang irreversible sehingga
pola distribusi normal dan sel akan mengalami kematian yang
variansinya homogen maka untuk sulit diketahui dengan pengamatan

melihat perbedaan jumlah morfologi morfologi sel. Bila sel yang

spermatozoa normal sebelum simpan mengalami kematian dibiarkan
beku dan morfologi spermatozoa dalam waktu yang lebih lama maka
normal setelah simpan beku kematian tersebut baru

dilakukan uji statistik menggunakan memperlihatkan perubahan

analisis parametrik dengan morfologi yang dapat diketahui.
menggunakan uji t (Munawar, 1995). Sesuai pernyataan tersebut, pada
Analisis statistik dilakukan dengan penelitian ini, saat penambahan

37
medium sampai saat spermatozoa menyebabkan terjadinya rehidrasi
membeku dan saat dilakukan pada saat thawing, sehingga dapat
thawing sampai saat pengamatan menyebabkan volume sel bertambah.
morfologi spermatozoa waktunya Spermatozoa yang mengalami
relatif singkat, sehingga apapun yang kematian mengalami kenaikan
menyebabkan kematian spermatozoa permeabilitas membran. Selanjutnya
belum dapat mengubah morfologi menurut Price & Wilson (1995),
spermatozoa. Pada pengamatan selama dapat bertahan pada kondisi
morfologi spermatozoa terlihat pembengkakan, bila sel tersebut
spermatozoa yang mengalami tidak pecah maka dapat kembali
kematian tersebut berbentuk seperti pada kondisi normal. Dengan adanya
morfologi spermatozoa normal yang fruktosa yang merupakan substansi
lain, kemungkinan yang non permeating, akan
menyebabkan morfologi mempertahankan osmolaritas
spermatozoa setelah simpan beku medium di luar sel, sehingga
tidak berbeda bermakna dengan kemungkinan spermatozoa
morfologi spermatozoa sebelum mengalami pembengkakan sangat
simpan beku kecil. Pembengkakan pada
Akibat dehidrasi dan masuknya spermatozoa setelah simpan beku
gliserol sebagai permeating kemungkinan dapat juga terjadi
cryoprotectant ke dalam namun hal tersebut tidak terdeteksi
spermatozoa yang terjadi pada saat pada saat pengamatan, karena
penambahan medium sampai saat pengamatan morfologi spermatozoa
pembekuan, maka osmolaritas tidak dilakukan dengan klasifikasi
spermatozoa lebih tinggi Tygerberg strict criteria yang
dibandingkan osmolaritas medium menggunakan pedoman ukuran
disekelilingnya. Hal tersebut spermatozoa. Dengan demikian pada

38
pengamatan morfologi, spermatozoa spermatozoa akan berbentuk seperti
yang mengalami pembengkakan spermatozoa berkepala pinhead atau
tersebut sebelum berbentuk coiling, bahkan kepala spermatozoa tidak
dihitung sebagai morfologi nampak lagi. Spermatozoa dengan
spermatozoa normal. Hal tersebut di kepala berbentuk seperti
atas merupakan kemungkinan lain spermatozoa berkepala pinhead atau
yang menyebabkan morfologi spermatozoa tak berkepala menurut
spermatozoa setelah simpan beku Mortimer (1994), dalam
tidak berbeda bermakna dengan penghitungan prosentase morfologi
morfologi spermatozoa sebelum tidak dihitung sebagai spermatozoa.
simpan beku (p>0,05). Menurut Spermatozoa setelah simpan beku
Underwood (1995), kerusakan akibat yang mengalami plasmolisis tidak
trauma mekanik yang parah adalah terhitung sebagai spermatozoa. Hal
robeknya membran sel sehingga tersebut di atas merupakan
menyebabkan sitoplasma keluar. kemungkinan berikutnya yang
Pada penelitian ini tidak dilakukan menyebabkan morfologi
pengamatan ultra struktur membran spermatozoa setelah simpan beku
sel, namun mengacu pernyataan tidak berbeda bermakna dengan
tersebut di atas kemungkinan morfologi spermatozoa sebelum
kerusakan membran sel spermatozoa simpan beku (p>0,05).
cukup parah, sehingga menyebabkan Kemungkinan lain adalah jika
sitoplasma sel keluar. Pada saat kerusakan membran spermatozoa
pengamatan morfologi spermatozoa, ringan maka jika terjadi rehidrasi air
terlihat bagian kepala spermatozoa akan keluar lagi melalui membran
yang sitoplasmanya keluar akan yang rusak sehingga tidak terjadi
mengalami pengkerutan. Jika pembengkakan dan pada pengamatan
pengkerutan hebat maka kepala morfologi, bentuk spermatozoa

39
tersebut seperti bentuk spermatozoa
normal.
KESIMPULAN
Pada penelitian ini dapat
disimpulkan bahwa data morfologi
spermatozoa tidak dapat dijadikan
indikator untuk melihat dampak
simpan beku spermatozoa dengan
menggunakan medium simpan beku
TES-TYC.
DAFTAR PUSTAKA
Alberts, B., D. Ray, J. Lewis, K. Raff,
K. Roberts, J.D. Watson. 1994
Molecular Biology of the cell. 3rd
Edition. Garland Publishing Inc.
New York. pp 483 – 502.
Anonim. 1999. WHO Laboratory
Manual for the examination of
human semen and sperm- cervical
mucus interaction.4th Ed. Cambridge
University Press. United Kingdom.
Anonim.2000. Cell Membrane.
http://www.altavista.com
Critzer, J.K., A.R. Huse-Benda, D.V.
Aaker, B.W. Arneson, G. David
Ball. 1988. Cryopreservation of
human spermatozoa. III. The Effect
of Cryoprotectant on Motility. Fertil
Steril. : 50(2) : 314-320.
Constatinides, P.1993. General
Pathology. Appleton & Lange.
pp39– 42 Connecticut
Girraud, M.N., C. Motta, D. Boucher,
and G. Grizard. 2000. Membrane
fluidity predicts the outcome
cryopreservation of human
spermatozoa. J Hum Reproduction.
15 (10): 2160-2164.
Hafez, E.S.E. 1968. Reproduction in
Farm Animals. 2nd Ed. Lea &
Febiger. Philadelphia. pp 51-56.
Hallack J., R.S. Sidhu, A.J. Thomas Jr.
1996. Effect of test yolk buffer and
glycerol cryoprservation on human
speramtozoa morphology and
function. ASRM Abstracts.
Henry, M.A., E.E. Noiles, D. Gao, P.
Mazur, J.K. Critzer. 1993.
Cryopreservation of human
spermatozoa. IV. The effect of
cooling rate and warming rate on the
maintenance of motility, plasma
membrane integrity, and
mitochondrial function. Fertil.
Steril. 60 (5) : 911 – 917.
Johnson M., B. Everitt, 1988. Essential
Reproduction. 3rd Edition.Oxford.
Blackwell scientific Publ. : 52-62.
Mazur P. 1977. The Role of intracellular
Freezing in the Death of Cells
Cooled at Supraoptimal Rates. J.
Cryobiology. 14 : 251-272
Mortimer D. 1994. Practical laboratory
andrology. University Press. New
York Oxford pp 301 –320.
Munawar. Biometri II. 1995. Jurusan
Biologi FMIPA UNSRI.
Palembang.
Nieschlag, E., & H.M. Behre. 1996
Andrology. Male Reproductive
Health and Dysfunction. Springer
Publ. Berlin. pp 65 – 105
Polcz T.E., J.B. Stronk, G.B. Huszar.
1996. Repeated Cryopreservation of
Ejaculated Human Spermatozoa,
Recovery and Maintenance of
Sperm Motility and Viability..
ASRM Abstract.
40
Price, S.A., & L.M. Wilson Patofisiologi
Konsep Klinis Proses - Proses
Penyakit. Penerjemah Peter
Anugrah. Edisi 4. Jakarta.EGC 1995
: 22-28
Prins, G.S. & L. Weidel. A. 1986.
Comparative study of buffer system
as cryoprotectant for human
spermatozoa. Fertil. Steril. 46:147–
149.
Romanoff A.L., Anastasia J. Romanoff.
1963. The avian egg. 2nd Edition.
New York. John Willey & Sons Inc.
311 – 343.
Santoso Singgih. SPSS (Statistical
Product and Service Solution).
1999. Jakarta : PT Elex Media
Komputindo, 300 – 380.
Underwood, J.C.E., Patologi Umum dan
Sistematik. Penerjemah Sarjadi.
Edisi 1 Jakarta. EGC. 1994 : 115-
120.
Weidel L., and G.S. Prins. 1987.
Cryosurvival of Human
Spermatozoa Frozen in Eight
Different Buffer Systems. J. Androl.
8 : 41 – 47.
Wetzels, A.M.M. 1996. IVF Laboratory
aspects of in-vitro fertilization. N.V.
Organon. Netherlands. pp 228 –
240.
Winarso, H. & A. Hinting. 1999.
Simpan beku sperma manusia. Post
graduate course Penatalaksanaan
infertilitas pria dan analisis semen.
FK Unair. Surabaya.
41