3484 6680 1 SM PDF
3484 6680 1 SM PDF
Tristia Rinanda
Abstrak. Gen 16S ribosomal RNA (16S rRNA) memiliki daerah yang conserved (lestari)
sehingga tepat digunakan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR) dan analisis sekuensing untuk
menentukan taksonomi, filogeni dan keanekaragaman antar spesies. Gen ini juga memiliki
hypervariable region yang merupakan ciri khas tiap mikroorganisme. Analisis sekuensing gen
16S rRNA sudah banyak digunakan di bidang mikrobiologi. Metode berbasis molekuler ini dinilai
cepat dan akurat dalam mengidentifikasi bakteri patogen serta memiliki sejumlah keunggulan
dibandingkan metode mikrobiologi konvensional. (JKS 2011; 3:172-177)
Abstract. The 16S rRNA gene is the most conserved DNA in all cells. For this reason, genes that
encode the rRNA (rDNA) have been used extensively on PCR and sequencing analysis method to
determine taxonomy, phylogeny (evolutionary relationships) and also to estimate rates of species
divergence. This gene also consists of hypervariable region which is specifically characterized
every organism Sequencing analysis has been widely use in microbiology. This molecular based
method is becoming a powerful technology for identification of bacterial isolates in the human
clinical diagnostic laboratory and also has several advantages compare to conventional method.
(JKS 2011; 3:172-177)
172
JURNAL KEDOKTERAN SYIAH KUALA Volume 11 Nomor 3 Desember 2011
sekuens rDNA dapat menunjukkan Pemilihan gen 16S rDNA sebagai Target
hubungan evolusi antar organisme. Sekuensing
Penggunaan sekuens 16S rRNA dipelopori Gen pengkode rRNA adalah gen yang
oleh Carl Woese, yang juga menemukan mampu mempertahankan kelestariannya
klasifikasi 3 domain terbesar makhluk selama jutaan tahun keanekaragaman
hidup, yaitu bakteri, archaea dan eukaria4. evolusi. Sebagian besar prokariot memiliki
3 jenis rRNA, yaitu 5S, 16S dan 23S.
173
Tristia Rinanda, Analisis Sekuensing 16S rRNA di Bidang Mikrobiologi
menunjukkan bahwa sifat yang conserved produk PCR dengan ukuran tertentu
dari gen 16S rRNA diduga disebabkan digunakan sebagai cetakan. Primer pada
karena peran yang sangat esensial dari gen tahap PCR juga digunakan dalam
ini terhadap fungsi sel. Pada gen-gen yang sekuensing, hanya saja masing-masing
mengkode enzim, mutasi dapat terjadi primer digunakan secara terpisah dalam
lebih sering dan umumnya dapat ditolerir satu siklus sekuensing (forward saja atau
oleh sel karena hanya menyebabkan reverse saja). Berbeda dengan PCR,
perubahan struktur dan biasanya tidak produk yang dihasilkan dari sekuensing
memegang peranan yang krusial seperti memiliki ukuran yang berbeda-beda. Hal
ini disebabkan karena pada sekuensing
halnya rRNA. Pada bakteri, jika terdapat
ditambahkan ddNTP (di-
gen yang mengkode enzim yang deoxyribonuclease Triphosphat) atau
dibutuhkan untuk penggunaan laktosa, dNTP terminator yang dilabel dengan zat
maka bakteri dapat menggunakan gula lain warna. Terminator ini pada satu siklus
atau protein sebagai sumber energi2. akan berikatan secara acak dan
menghentikan proses pembacaan. Pada
Aplikasi Analisis Sekuensing 16S rRNA tiap basa terminator (ddATP, ddGTP,
di Bidang Mikrobiologi ddCTP, atau ddTTP), terdapat zat warna
Metode sekuensing telah mengalami fluoresen yang dapat menyerap panjang
perkembangan yang cukup pesat. gelombang yang berbeda sehingga basa
Perkembangan teknologi saat ini telah terminator akan dapat dibaca dengan
memungkinkan dilakukannya analisis fluorometri2.
terhadap jutaan sekuens DNA per tahun. Sekuens DNA terbentuk dari hasil
Kualitas analisis sekuensing sangat pensejajaran pembacaan primer reverse
tergantung pada faktor kecepatan prosedur dan forward dan umumnya disebut sebagai
kerja dan teknologi yang digunakan. sekuens konsensus (consensus sequence).
Identifikasi mikroorganisme penyebab Sekuens konsensus ini kemudian
infeksi dilakukan dengan menumbuhkan dibandingkan dengan data sekuens yang
bakteri dari berbagai spesimen klinis pada tersedia di database menggunakan software
media tertentu2. tertentu. Beberapa sistem dapat
Pada metode mikrobiologi konvensional menentukan urutan nukleotida melalui
membutuhkan waktu yang lama pada saat pembacaan satu primer, namun pembacaan
identifikasi berdasarkan karakteristik dengan dua primer memberikan hasil yang
fisiologis dan biokimianya sedangkan pada lebih akurat. Beberapa database yang dapat
identifikasi berbasis molekuler melalui digunakan untuk membandingkan sekuens
analisis sekuensing, waktu yang 16S rRNA antara lain GenBank
dibutuhkan jauh lebih singkat. Langkah (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ribosomal
analisis sekuensing dimulai dengan Database Project (RDP-II)
mengisolasi DNA dari kultur bakteri, baik (http://rdp.cme.msu.edu/html/), Ribosomal
kultur padat maupun cair. DNA yang Database Project European Molecular
diperoleh akan dijadikan sebagai cetakan Biology Laboratory
dalam tahap amplifikasi dengan PCR. (http://www.ebi.ac.uk/embl/), Smart Gene
Primer yang digunakan dalam PCR adalah IDNS (http://www.smartgene.ch) dan
primer 16S rRNA yang bersifat universal Ribosomal Differentiation of Medical
berukuran sekitar 1500 pb, sehingga dapat Microorganisms (RIDOM)
mengamplifikasi daerah 16S rRNA dari (http://www.ridom.com/)1,2.
seluruh bakteri. Produk PCR dimurnikan Dalam penggunaan klinis sangat penting
terlebih dahulu dengan menggunakan kit untuk dipertimbangkan apakah diperlukan
komersial untuk menghilangkan sisa-sisa sekuensing dari keseluruhan gen (sekitar
primer serta fragmen nukleotida2,3,4. 1500 pb). Sekuensing keseluruhan gen
Produk PCR yang telah dimurnikan dapat digunakan untuk membedakan strain
ditentukan urutan nukleotidanya dengan dari suatu mikroorganisme. Dalam
metode sekuensing. Pada tahap sekuensing penemuan spesies baru, sekuensing
174
JURNAL KEDOKTERAN SYIAH KUALA Volume 11 Nomor 3 Desember 2011
Tabel 3. Prosedur dan waktu yang dibutuhkan untuk mengidentifikasi bakteri dalam kegiatan
Laboratorium rutin (Clarridge, 2004)
Waktu Pemrosesan (dalam
No Prosedur Waktu
mesin/instrumen)
1 Pemanenan. Organisme diperoleh dengan 3-5 menit per
menumbuhkannya pada media kultur padat atau sampel
cair.
2 Ekstraksi DNA 30 menit 10 menit dan 3 menit
3 Amplifikasi dengan PCR 30 menit 2 jam
4 Karakterisasi produk PCR dengan 20 menit 1 jam
elektroforesis
5 Purifikasi produk PCR 1 jam
6 Siklus Sekuensing 30 menit 30 menit
7 Purifikasi produk PCR 1 jam
8 Sekuensing gen 16s RNA. Setelah running, 1 jam 2,5 jam
petugas dapat melakukan pekerjaan lainnya
9 Analisis hasil sekuensing 5-15 menit per
sampel
10 Pencarian nama/spesies dalam database. Jika Tidak
sekuens DNA organisme tersebut telah ada diikutsertakan
dalam database, maka waktu yang dibutuhkan dalam kalkulasi
hanya sekitar 1 menit. Jika merupakan waktu
organisme baru, maka sekuens harus
dibandingkan secara detil dengan data dari
sejumlah database. Waktu yang diperlukan
untuk kegiatan ini sekitar 15-30 menit.
11 Melaporkan hasil 30 menit
Total waktu yang dibutuhkan dalam 60 sampel/40 jam 1 sampel /40 menit
pemeriksaan 20 sampel per minggu
175
Tristia Rinanda, Analisis Sekuensing 16S rRNA di Bidang Mikrobiologi
Analisis sekuensing gen 16S rRNA saat ini pneumonia telah mengembangkan
sudah banyak digunakan, terutama di resistensi terhadap optochin sehingga
bidang penelitian. Pemakaian di bidang diperlukan metode identifikasi lain yang
klinis sebagai prosedur diagnostik memang lebih akurat. El Aila et al (2010)
belum banyak digunakan terkait dengan melakukan identifikasi S. pneumoniae
biaya pemeriksaan yang mahal. Namun dengan analisis sekuensing gen 16S rRNA
tidak dapat dipungkiri bahwa tuntutan akan dan memberikan hasil yang lebih akurat 10.
suatu metode diagnostik dengan tingkat Sacchi et al (2002) menggunakan gen 16S
spesifisitas dan sensitivitas tinggi, cepat rRNA untuk mengidentifikasi Bacillus
dan akurat mengharuskan adanya aplikasi antracis, bakteri yang sering digunakan
berbasis molekuler ini dalam identifikasi dalam bioterorisme11.
berbagai sampel klinis. Nolte (2008)
menyatakan bahwa untuk mengidentifikasi Kesimpulan
bakteri yang berasal dari saluran Gen 16S rRNA adalah gen yang bersifat
pernafasan, metode mikrobiologi lestari (conserved) dan dijumpai pada
konvensional dinilai kurang akurat setiap organisme. Struktur yang lestari ini
sehingga tidak lagi dimasukkan dalam menyebabkan gen 16S rRNA dapat
pedoman penatalaksanaan. Metode digunakan dalam PCR dan analisis
identifikasi berbasis molekuler dengan sekuensing. Dalam struktur gen ini
amplifikasi asam nukleat dan sekuensing terdapat sejumlah basa yang disebut
menunjukkan keunggulan dari segi waktu, hypervariable region untuk merupakan ciri
sensitivitas dan akurasi yang lebih baik 7. khas yang membedakan tiap organisme.
Lau et al (2004) juga menggunakan Struktur yang unik ini menjadi dasar
analisis sekuensing gen 16S rRNA untuk dijadikannya gen 16S rRNA dalam
mengidentifikasi Arcobacter dari penderita mengidentifikasi mikroorganisme di
apendisitis akut gangrenosa. Arcobacter bidang mikrobiologi. Analisis sekuensing
adalah bakteri Gram negatif yang 16S rRNA merupakan jawaban atas
sulit untuk diidentifikasi melalui kebutuhan akan suatu metode diagnosis di
karakteristik fenotip .3
Kuppeveld bidang mikrobiologi cepat dan akurat
et al (1992) menggunakan sekuensing 16S utnuk melengkapi metode mikrobiologi
rRNA untuk menentukan spesies konvensional yang memiliki beberapa
Mycoplasma yang secara klinis sulit serta kelemahan. Selain dari segi waktu
membutuhkan waktu lama untuk pemeriksaan yang lebih singkat, analisis
8
ditumbuhkan/dikultivasi . Selain dari isolat sekuensing juga dapat mengidentifikasi
organisme yang tidak dapat dan sulit
klinis, sekuensing gen 16S rRNA juga
untuk dikultur serta tidak dapat
dapat digunakan untuk mengidentifikasi
diidentifikasi secara fenotip (karena
bakteri patogen yang terdapat di
adanya resistensi terhadap antibiotik
lingkungan. Magray et al (2011)
tertentu). Meskipun analisis sekuensing
melakukan identifikasi bakteri patogen dari
membutuhkan biaya yang lebih mahal,
sumber air minum di Srinagar, India, dan namun ketepatan identifikasi yang
menemukan bahwa Escherichia coli adalah dihasilkan dapat dijadikan pertimbangan
bakteri patogen terbanyak-9. untuk menggunakan metode ini dalam
Sekuensing gen 16S rRNA juga digunakan aplikasi klinis.
untuk mengidentifikasi bakteri tertentu
yang tidak dapat diidentifikasi lagi Daftar Pustaka
secara fenotip. Streptococcus pneumonia 1. Amman RI, Ludwig W, Schleifer KH.
adalah bakteri Gram positif yang Phylogenetic Identification and In Situ
dapat dikarakterisasi secara fenotipik Detection of Individual Microbial Cells
berdasarkan sensitivitasnya terhadap without Cultivation. Microbiol Rev. 1995.
antibiotik optochin. Namun saat ini S. 59(1): 143-69
176
JURNAL KEDOKTERAN SYIAH KUALA Volume 11 Nomor 3 Desember 2011
177