Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999

TEKNIK PEMBUATAN KULTUR MEDIA BAKTERI

YUSUF HIDAYAT DAN SUTARMA

Balai Penelitian Veteriner, JI.R.E. Martadinata 30, Bogor 16114.

RINGKASAN
Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat makanan
(nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan bakteri . Untuk
menaikan tekanan osmose dan menjaga keseimbangan fisikokhemis sel-sel bakteri yang
tumbuh, kedalam media harus ditambahkan NaCL. Wadah yang digunakan pada
pembuatan media dipakai alat-alat gelas dan stainless, sedangkan pH (derajat keasaman)
media bisa diukur dengan kertas penunjuk, pH meter dan zat penunjuk . Untuk sterilisasi
media dapat dilakukan dengan uap air panas bertekanan (autoclave), uap air panas yang
mengalir (steam) atau dengan saringan Seitz EK, sedangkan alat-alat gelas disterilisasi
dengan udara panas kering (oven) . Setiap batch media yang sudah dikontrol sterilitas
dan mutunya harus disimpan pada suhu 5°C-8°C, selama belum/tidak dipakai .

PENDAHULUAN
Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat makanan
(nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan jasad renik
(mikroorganisme) . Media dapat berbentuk padat, cair dan semi padat (semi solid) .
Didalam laboratorium mikrobiologi, kultur media sangat penting untuk isolasi,
pengujian sifat-sifat phisis dan biokhemis bakteria serta untuk diagnosa suatu penyakit .
Zat makanan yang dibutuhkan bakteri pada umumnya sangat bervariasi, dapat
berbentuk senyawa-senyawa organik sederhana atau senyawa-senyawa organik komplek
(majemuk) . Untuk menumbuhkan bakteri pada tanah cukup dengan mempergunakan
senyawa organik sederhana, tetapi bakteri patogen membutuhkan media' yang
mengandung ekstrak daging bagi pertumbuhan dan perkembang biakannya . Ekstrak
daging mengandung antara lain : asam-asam amino dan pepton (Supar dan Ibrohim,
1981) . Pepton adalah sebagai sumber/persediaan nitrogen bagi pertumbuhan bakteri,
mudah larut dalam air, tidak rusak/menggumpal pada suhu tinggi dan juga berfungsi
sebagai buffer (penyangga) . Pepton dapat dibuat dengan pengasaman atau hidrolisa
dengan enzym dari protein hewani atau protein nabati, seperti : otot, hati, darah, susu,
kasein, laktalbumin, gelatin dan kacang kedelai (Cowan, 1975) . Selain mengandung zat
makanan, media harus mengandung NaCL untuk menaikan tekanan osmose media .
Tekanan ini sangat penting bagi keseimbangan fisikokhemis suatu sel bakteri yang
tumbuh dalam media tersebut .
Lebih dari 200 macam media tersedia dan dikenal untuk pembiakan,
pemeliharaan dan identifikasi bakteri, namun demikian tidak semua media dapat
mendorong pertumbuhan bakteri . Ada bakteri tertentu yang memerlukan . media

149
 Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999

spesifik/khusus untuk pertumbuhannya . Menurut jenis dan kegunaannya media dapat

dikelompokan sebagai berikut : media dasar, media penyubur, media selektif, media
disferensial dan media yang mengandung karbohidrat .
Unit Media Balai Penelitian Veteriner Bogor dalam penyiapan kebutuhan media
untuk penelitian bakteriologi khususnya yang bersifat umum, dilakukan tahapan-tahapan
sebagai berikut : penimbangan, penggunaan bahan pelarut dan wadah, pengukuran
derajat keasaman (pH), pengisian dan sterilisasi, kontrol sterilitas dan uji pertumbuhan
serta penyimpanan .
Tulisan ini disajikan sebagai informasi cara membuat kultur media bakteri
secara umum .

TAHAPAN PEMEMBUAT MEDIA

Penimbangan, penggunaan pelarut dan wadah
Media yang akan dibuat selain yang siap pakai, artinya untuk membuatnya
tinggal menimbang dengan jumlah tertentu kemudian melarutkannya, ada pula yang
harus diramu dengan komposisi yang ditentukan (Anonymous, 1982 dan 1994) .
Timbangan yang praktis dipakai adalah timbangan "top loading" Sartorius yang
mempunyai angka 2 atau 3 desimal (2 atau 3 angka dibelakang koma) .
Untuk menghindari adanya bahan-bahan yang dapat mempengaruhi kelarutan
(solubilitas) zat yang digunakan, merubah warna media jika kena panas, meracuni
(bakterisidal) atau dapat menghambat pertumbuhan bakteri dalam pembuatannya
digunakan air suling (aquadest) sebagai pelarutnya . Sedangkan untuk wadah •tempat
melarutkan, jika jumlahnya sedikit dipakai alat-alat gelas seperti erlenmeyer atau gelas
piala, jika pembuatannya dengan jumlah banyak dipakai ember yang terbuat dari
stainless . Wadah dari tembaga atau seng tidak digunakan untuk menghindari terjadinya
kelarutan pada kedua metal tersebut, karena keduanya diketahui mudah teroksidasi dan
korosif. Jumlah sekecil apapun dari kedua metal ini jika terlarut dalam media akan
bersifat sebagai bakterisidal (Collin dan Patricia, 1987) .
Pengukuran derajat keasaman (pH)
Pengukuran derajat keasaman atau eksponen hidrogen (pH) media sangat
penting . Jika terlalu asam atau basa, maka pertumbuhan bakteri akan dihambat . Hampir
semua bakteri tumbuh pada media pH 7 .00 - 7 .50, dan hanya beberapa saja yang
tumbuh pada media yang pH nya dibawah 7 .0, misalnya Mycobakterium, yaitu bakteri
tahan asam yang tumbuh pada media pH 6 .8 . Pengukuran pH hendaknya dilakukan
pada suhu kamar, untuk menghindari penyimpangan/kesalahan . Pengukuran bisa
dilakukan dengan : kertas penunjuk (indikator), pH meter elektrik dan zat penunjuk .
Untuk memperoleh pH media yang kehendaki, jika terlalu rendah dipakai tetesan larutan
NaOH I N, sebaliknya jika terlalu tinggi diturunkan dengan tetesan larutan HCL' 1 N .
Zat penunjuk dipakai khususnya pada media diferensial yang mengandung
karbohidrat atau unsur karbon lain, digunakan untuk mempelajari sifat-sifat bakteri .
Jika penunjuk yang dipakai adalah phenol red, maka warna media adalah merah, karena
pH 7 .0 - 7 .5 . Kemudian jika terjadi fermentasi karbohidrat oleh bakteri, maka media

1 50
 Lokakarva Fungsional Non Pene lai 1999

akan berubah menjadi asam, pH nya akan turun yang menyebabkan warna . media
berubah menjadi kuning . Bermacam-macam zat penunjuk yang biasa dipakai serta jarak
perubahan warnanya dapat dilihat pada Tabel 1 .
Pengisian dan Sterilisasi
Pengisian media yang sudah diukur pH nya kedalam tabung/botol sebaiknya
jangan terlalu penuh untuk menghindari tumpah atau pecah jika disterilkan .. Untuk
bentuk padat yang mengandung 2% agar-agar atau bentuk semi solid yang mengandung
0,2% - 0,5% agar-agar, sehelum diisikan harus dipanaskan dahulu supaya agarnya larut
dan homogen . Sedangkan untuk pembuatan media agar plat . dimasukan kedalam
erlenmeyer yang kemudian ditutup dengan kapas/alumunium foil .
Media dalam tabung, botol atau erlenmeyer, kemudian disterilkan dengan uap
air jenuh bertekanan (autoclave) . Pada proses ini ada hubungan antara suhu yang
diinginkan dengan tekanan uap airnya (Tabel 2) . Dengan sterilisasi sel-sel vegetatif dan
spora bakteri akan mati . Jika media tersebut mengandung bahan-bahan yang tidak bisa
disterilkan dengan autoclave, dapat disterilkan dengan uap air yang mengalir, suhunya
100° C (steam) . Lama sterilisasi dengan steam bervariasi antara 10 - 30 menit,
tergantung bahan yang disteril, media yang mengandung selenit atau tetrationat cukup
10 menit, dan untuk karbohidrat 30 menit (Cowan, 1975) . Untuk mensterilkan bahan-
bahan yang tidak tahan terhadap panas, misal serum, beberapa macam vitamin
dilakukan sterilisasi dengan menggunakan saringan, yaitu mengunakan kertas saring
ashes (SEITZ EK), dengan bantuan pompa vakum yang bisa menyedot atau menekan
udara . Sedangkan untuk mensterilkan alat-alat gelas, dipakai sterilisasi panas kering (hot
air open), suhunya 160°C selama I jam atau 170°C selama 40 menit (Collin dan
Patricia, 1987) . Pada pengisian kedalam cawan-cawan petri dilakukan secara aseptik
didalam "biohazard" atau dekat nyala api bunsen untuk menghindari kontaminan dari
udara . Pada pembuatan media agar slope (agar miring), media dalam tabung/botol yang
masih panas/cair dimiringkan dan diganjal dengan tabung kaca, lalu diatur sedemikian
sehingga ujung media tidak terlalu dekat dengan leher botol/tabung . Pengisian media
kedalam tabung/botol dan cawan petri yang biasa digunakan dapat dilihat pada Tabel 3 .
Kontrol sterilitas, uji pertumbuhan dan penyimpanan
Setiap batch media yang dibuat sebelum digunakan harus dikontrol dahulu
sterilitasnya, yaitu dengan menyimpan didalam inkubator pada suhu 37"C selama 24
jam . Media yang terkontaminasi harus dibuang .
Beberapa sampel media yang sudah dikontrol sterilitasnya diuji pertumbuhannya
dengan bakteri yang cocok untuk penggunaan media tersebut, misal untuk media agar
Brilian green (BRG) digunakan bakteri Salmonella, dan untuk agar Mac Conkey (MCC)
digunakan bakteri E.coli . Media yang baik adalah apabila media BRG dengan
pertumbuhan Sabnonella harus berubah warna menjadi merah, dan media MCC dengan
pertumbuhan E.coli harus berubah menjadi merah .

151


Lokakarva Fungsionu! Non Penelitt 1999

Media-media yang sudah dikontrol sterilitas dan uji pertumbuhannya selaina

belum digunakan harus disimpan didalam lemari pendingin (cool room) suhu 5"C-8‚C .
Beberapa contoh media siap pakai dapat dilihat pada gambar 1 .

st)It)1b+1ttlit)11 °1 t. -SC At1141I1)14+1fJ!111I t 11011+0f4I1)It)14I4 ° ° t t)tt

4h1-0101t °1 4 44 4)a0 1uIt+11-04t)1 0 I01 4 11414 . Of, t)It) 1 0It °1 f utt01014 1
)ttIIU4t °+ 01444$1141-14)4+)14110Ift11+I1 . 01to1411t It 1 II °I tkoIt)Ift1U , 09t)ft
4-04.4101t,14-)4it11)14111+0f ~OI1)141f011)11 14 , if+IIt1It114If+)tt)90lh °0
1014014111VIt 111014111)141It4otoatiIV1o .4f-Oft
01ft10a41410a4 , 04 . 144t' 11 .04
4,+04 )01 1164 )14)44ttz011)t4 . 01 1 )a1110141of , it II IIt01014 .14, 90u 8 01f .1
0 4- 14-2W .e10a004- . 04 t+)10 f411 4 , I1+14 04t01t111114 , 11 . 0Ito9t)I(I 0 1 . 04 °I ft
V ,Z1146414f , 0411114 1 14+114 1,tiIIt0140a41 11'6 1 .bItIIt1&4 . 4 . 6 0 9 t0
i °+ i1+1f )i1134+01 +1 t11114 , 11)14 , 14 to I111111fl-I6to9toIt)ttt °O f . 0tt
f0ft) 9 412 4 °0 441111 t/ 441(t1 0 1t11411 . II If+) ftott)$4 , 1t , ~0010a01 0 1
>s1)t04 .14 )t u114 , - 1+1 . 1410411t , 04of0 411t)It)1f ., 04(Itfle(0C . 0#' . 10t
404+)1ut1 ° ° -- -e014, 4 4 844 ~11 1 1411+,1414 41016)9 4 +* ° . It 1 9 01t)I
)It1auaa .ii + ))4 4ttlN t A~I4 1 . :,, 11++) t11n f f O a a
ti (I 14),
f+ ° 1 f°) )1U11+'t. .)40)1141)1a4' .+41 11 4 041 °1 -11141F 4191t01
ltHtOS41t t)tt 14L,~
'14 ''St t)t+ to 41 1) 1 , , 14' . t•1 014- . 4It °
11~i4H~"tf 4 ) 1t)` 141 ))1'4L f to 1 t*t ' 1t(0 9 00 9
1 °0 0 :,- )e ! t 10, 0 ° 00, ; 1011$ , .04W °fv)

Gambar 1 . Contoh media siap pakai

KEMUNGKINAN KESALAHAN YANG BISA TERJADI

Kesalahan pertama kemungkinan dalam penimbangan, pencampuran bahan,
penggunaan bahan yang salah serta pengukuran keasaman (pH) media . Kesalahan
selanjutnya yang bisa terjadi antara lain adalah
° Berkurangnya kapasitas pertumbuhan : disebabkan oleh sterilisasi
berlebihan (over sterilisasi), pencairan yang berulang dari media padat,
tercampur dengan garam-garam logam, dan salah penggunaan moralitas
larutan yang dapat merubah pH .
° Penyusutan kekentalan : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, hidrolisis
media yang mengandung agar karena pH rendah, dan pencairan berulang
dari media padat .

152
 Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999

Warna menjadi keruh (gelap) : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan akibat

terjadi karamelisasi karbohidrat (gula-gula), dan pemanasan yang tidak merata .
Perubahan pH : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, pencampuran yang tidak
merata (homogen), hidrolisis dari bahan-bahan yang dipakai, menggunakan wadah yang
bersifat alkali, dan pemanasan berulang .
Pengendapan : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, pemanasan media agar
yang terlalu lama dengan temperatur tinggi, dan bahan-bahan yang dipakai tidak sesuai .

KESIMPULAN
Dalam pembuatan kultur media yang perlu diperhatikan adalah
1 . Mengandung zat-zat makanan (nutrisi) yang bisa dipergunakan untuk
pertumbuhan dan perkembang biakan bakteri .
2 . Mempunyai tekanan osmosis/tegangan permukaan dan derajat keasamari (pH)
yang sesuai .
3 . Tidak mengandung zat-zat penghambat/inhibitor dan bakterisidal .
4 . Steril .

DAFTAR BACAAN

ANONYMOUS 1994 . Difco Manual of Dehydrated Culture Media and Reagents for
Microbiological and Clinical Laboratory Procedures . Tenth edition . Detroit,
Michigan USA .

ANONYMOUS 1982 . The Oxoid Manual of Culture Media, Ingredients and other
Laboratory Service, Fifth edition . Basingstoke - England .

COLLIN .C H and PATRICIA M .LYNE 1987 Microbiological Method, Fifth edition .

Butterworths, London .
COWAN ST 1975, Cowan and Steel's Manual for identification of medical bacteria .
Second edition, Cambridge University Press . Cambridge .

SUPAR dan IBROHIM 1981 . Kultur Media dan Cara Pembuatannya . Balai Penelitian
Penyakit Hewan Bogor .

1 53
 Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999

Lampiran I
Tabel 1 . Zat penunjuk yang biasa dipakai untuk pembuatan kultur media
bakteri ')
Konsen Penambahan Jarak pH
Penunjuk trasi NaOH 0,05 Pelarut Perubahan warna
(%) xx ) N per gram asam ke basa
penunjuk (ml)
-Methyl red 0,2 - alkohol 50% 4,2-6,3 merah - kuning
- Andrade's 0,5 30 "1 air 5 - 8 merah muda -
kuning (pink)
-Litmus 2,5 - alkohol 40% 5 - 8 merah - biru
Bromcresol 0,2 37 air/alkohol 50 % 5,2-6,8 kuning - unggu
purple
Bromthimol blue 0,2 32 air/alkohol 50 % 6,0-7,6 Kuning - biru
Neutral red 0,1 - air/alkohol 50% 6,8-8,0 Merah - kuning
Phenol red 0,2 57 air 6,8-8,4 Kuning - merah
x"x)
") Surnber Cowan 1975 ; ") 30 nil NaOH I N ; 10 ml larutan penunjuk untuk 1 liter media

Tabel 2 . Hubungan antara suhu dan tekanan uap air jenuh pada sterilisasi
dengan autoclave ')
Suhu (° C) Tekanan uap air Waktu Sterilisasi
kg/cm2 Win' (menit)
100 0 0 -
105 0,20 2,8 30
110 0,43 6,1 25
115,5 0,72 10,2 20
121 1,06 15,0 15
127 1,50 21,2 6
134,5 2,11 30 2
'' Sumber : Cowan 1975 Keterangan : 1 lb = 454 gram

154
 Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999

Lampiran 2 .

Tabel 3 . Pengisian kultur media kedalam botol, tabung clan cawan petri

Spesifikasi Isi Media (ml)

Alat gelas
Tinggi Diameter Isi Cair Semi Padat
(cm) (cm) (MI) Solid
Tabung 10 1,20 8 5 5 4
12,50 1,50 17 8,50 8,50 7 .
15 1,50 21 10 10 8
10 1,00 7 3,50 3,50 2,50
Botol
- MacCartney 8 2,50 24 12 12 10
- Universal 9 2,60 30 13 13 10,50
- Universal 7 .20 2,70 30 14 - 12
- Bijou 4,80 2,00 6,50 3 3 2,50
-Bijou 6,50 2,30 15,50 7 - 6
-Roux 26,50 - 1100 - - 150
Cawan petri 1,40 9,00 62,50 - - 15 - 20
1,20 6,50 35 - - 12- 15
1,60 11,50 125 - - 25 - 30
1,50 10,00 100 - - 20-25
I
Keterangan : Bentuk padat dalam tabung/botol untuk pembuatan media agar slope/agar miring

155