Anda di halaman 1dari 6

Polimorfisme Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) dan Risiko

Endometriosis di Iran Utara


Banafsheh Emamifar1, Zivar Salehi1, Marzieh Mehrafza2 & Farhad Mashayekhi1

Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) dikenal sebagai molekul kunci dalam
patogenesis endometriosis. Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi apakah dua
polimorfisme −460T> C dan + 405G> C dalam VEGF terkait dengan kerentanan terhadap
endometriosis di Iran utara. DNA genomik yang berasal dari pasien dengan endometriosis
dan wanita sehat dianalisis dengan PCR polimorfisme panjang fragmen restriksi. Total 1080
subjek (480 pasien dengan endometriosis dan 600 kontrol normal) dilibatkan dalam
penelitian ini. Kami menggunakan uji Chi-square (χ2) untuk mengevaluasi setiap alel dan
frekuensi genotip −460T> C dan + 405G> C polimorfisme diantara polimorfisme dan
kontrol. Hubungan antara polimorfisme dan risiko endometriosis diperkirakan dengan odds
ratio dan 95% confidence interval. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam genotip
VEGF EG460T> C dan frekuensi alel antara wanita kontrol dan endometriosis (P = 0,63).
Sebaliknya, peningkatan frekuensi genotip + 405CC diamati pada pasien dengan
endometriosis dibandingkan dengan kontrol. Alel + 405C dikaitkan dengan adanya
endometriosis. Disimpulkan bahwa polimorfisme + 405G> C pada VEGF dapat dikaitkan
dengan risiko endometriosis yang lebih tinggi di Iran utara.

Pendahuluan
Endometriosis secara histologis didefinisikan sebagai adanya kelenjar mirip seperti
endometrium dan / atau stroma di luar rahim [1]. Daerah yang sering terkena di rongga pelvis
termasuk ovarium, cul-de sac dan jenis lain dari peritoneum pelvis, usus dan diafragma.
Jarang ditemukan di luar abdomen, termasuk pleura dan perikardium. Gambarannya mirip
tumor ganas (invasi dan metastasis) tetapi tidak bersifat neoplastik. Terlepas dari kenyataan
bahwa endometriosis adalah salah satu penyakit ginekologi yang paling sering, yang sedang
diteliti, membingungkan dan sangat diperdebatkan [2]. Endometriosis telah lama dikenal
menunjukkan kecenderungan untuk diturunkan, dengan risiko berulang sebesar 4-7% untuk
kerabat tingkat pertama [3]. Risiko ini menunjukkan bahwa, seperti pada kebanyakan orang
dewasa, penyakit ini ditandai oleh etiologi poligenik dan multifaktorial. Namun, interaksi
antara kerentanan genetik dan faktor lingkungan belum cukup dipahami. Angiogenesis sangat
penting untuk proses fisiologis normal seperti pengembangan organ dan penyembuhan luka.
Ini juga penting untuk proses patologis seperti pertumbuhan tumor, aterosklerosis dan
retinopati diabetikum [4-6]. Pada endometriosis, neovaskularisasi sangat penting untuk
penerapan sel-sel endometrium di daerah ektopik [7]. Vascular Endothelial Growth Factor
(VEGF) adalah salah satu penggerak angiogenesis yang paling penting [8]. Pengkodean gen
VEGF terletak pada kromosom 6 dan terdiri dari wilayah pengkodean 14-kb dengan 8 ekson
dan 7 intron [9]. Polimorfisme di wilayah promotor [lokus −2578C> A (rs699947) dan
−460T> C (rs833061)], 5′ -untranslated region (UTR) [+ 405G> C (rs2010963)] atau 3′-UTR
[+ 936C] > T (rs3025039)] telah dikaitkan dengan berbagai level ekspresi VEGF [10-14].
Alel T (–polimorfisme 460T> C) dapat dikaitkan dengan penurunan aktivitas promotor
VEGF. Alel C dari polimorfisme + 405G> C telah dikaitkan dengan tingkat VEGF yang lebih
rendah [12,13].
SNP −460T> C dan + 405G> C (polimorfisme nukleotida tunggal) telah terlibat
dalam sejumlah penyakit dengan basis angiogenik, meskipun hasilnya belum konsisten.
Misalnya, −405C telah dikaitkan dengan retinopati diabetik, psoriasis, dan kadar VEGF
serum yang lebih tinggi [15]. Sebaliknya, yang lain telah melaporkan bahwa alel −405G
dikaitkan dengan produksi protein VEGF yang lebih tinggi oleh sel mononuklear darah
perifer yang distimulasi dengan lipopolisakarida[12]. Peran SNP 460T> C, + 405G> C dalam
VEGF telah diterapkan dalam etiologi endometriosis, namun, hasilnya tetap kontroversial
[16-18]. Sejauh pengetahuan kami, tidak ada investigasi peran VEGF -460T> C dan + 405G>
C polimorfisme dalam kaitannya dengan endometriosis yang telah dilakukan di Iran utara.
Mengingat sifat angiogenetik yang mendasari endometriosis, kami memeriksa hubungan
antara polimorfisme VEGF (−460T> C dan + 450G> C) dan kerentanan terhadap
endometriosis di Iran utara.

Bahan dan metode


Subjek
Empat ratus delapan puluh pasien dengan endometriosis dilibatkan dalam penelitian ini.
Diagnosis endometriosis dikonfirmasi secara histologis. Hanya pasien dengan endometriosis
stadium 1 dan 2 yang dilibatkan dalam penelitian ini. Pasien yang menerima terapi endokrin
sebelum operasi dikeluarkan dari penelitian ini.
Kontrol (n = 600) terdiri dari wanita yang menjalani ligasi tuba tanpa temuan
endometriosis pelvis, penyakit inflamasi atau fibroid uterus. Karakteristik patologi klinis dari
kasus endometriosis dan kontrol disajikan pada Tabel I. Semua peserta diberi penjelasan
tentang sifat penelitian dan setelahnya diperoleh informed consent. Selama proses baik
laboratorium, status klinis dan hasil pasien tidak diketahui oleh para peneliti.

Deteksi polimorfisme
Darah (1 ml) dimasukkan ke dalam asam etilenadiaminetetraasetat dengan pungsi vena rutin.
DNA genom diisolasi dari seluruh darah dengan kit DNG plus (Cinnagen, Iran). Konsentrasi
DNA dikuantifikasi dengan spektrofotometer. DNA genom yang dimurnikan dipertahankan
pada suhu -20 ° C sampai reaksi PCR. PCR dilakukan untuk mendeteksi polimorfisme
−460T> C dan + 405G> C dalam gen VEGF menurut laporan sebelumnya [19]. Urutan
primer ditunjukkan pada Tabel II. Kondisi amplifikasi untuk 200 ng DNA adalah: 10 mM
dari Tris-HCl (pH 8,4); 50 mM KCl; 2,0 mM dari MgCl2; Masing-masing 0,2 mM dari
dNTPs; 0,2 pmol / L dari masing-masing primer dan 1,0 U dari Taq DNA polymerase. Siklus
denaturasi awal pada 94 ° C selama 5 menit diikuti oleh 30 siklus amplifikasi pada 94 ° C
selama 30 detik untuk denaturasi DNA, 60 ° C selama 30 detik untuk annealing primer, dan
72°C selama 60 detik untuk ekstensi rantai . Siklus terakhir 5 menit pada 72°C dilakukan
untuk perpanjangan akhir rantai. Produk PCR dicerna dengan enzim restriksi Bstu1 (New
England Biolab) untuk −460T> C dan BsmFI (New Englands Biolabs) untuk + 405G> C.
Produk yang dicerna lalu dianalisis pada gel agarosa 3% yang diwarnai dengan etidium
bromida. Alel −460C dipotong menjadi dua bagian dari 155 dan 20bp, sementara alel T tetap
utuh. Alel + 405G gen VEGF dipotong menjadi dua fragmen 273 dan 196 bp, sementara alel
C tetap utuh. Analisis polimorfisme dilakukan oleh dua operator secara independen secara
blind. Sepuluh persen dari hasil dianalisis ulang dan dikonfirmasi pada analisis acak.

Tabel I. Karakteristik wanita sehat dan pasien endometriosis


Variabel Kontrol n=600 Pasien Endometriosis
N=480
Median usia dalam tahun 32 (25-38) 31 (24-37)
(rentang)
Gejala
Nyeri pelvis kronis 102 (17%) 415 (86.4%)
Dismenorea 72 (12%) 384 (80%)
Dispareunia 34 (5.6%) 330 (68.7%)
Sulit hamil 66 (11%) 187 (38.9%)

Analisis statistik
Kami menggunakan uji Chi-square (χ2) untuk mengevaluasi setiap alel dan frekuensi genotip
−460T> C dan + 405G> C polimorfisme antara kasus dan kontrol. Hubungan antara
polimorfisme dan risiko endometriosis diperkirakan dengan odds ratio dan 95% confidence
interval (CI). Semua analisis dilakukan dengan menggunakan Med Calc versi 9.3 dan tingkat
probabilitas <0,05 digunakan sebagai kriteria kemaknaan.

Tabel II. Primer dan enzim restriksi yang digunakan dalam penelitian
Varian pRIMER Enzim Restriksi
(NCBI SNP Cluster ID)
–460T>C (rs833061) 5′-TGTGCGTGTGGGGTTGAGAG-3′ Bstu1
5′-TACGTGCGGACAGGGCCTGA-3′
+405G>C (rs2010963) 5′-TTGCTTGCCATTCCCCACTTGA-3′ BsmF1
5′-CCGAAGCGAGAACAGCCCAGAA-3′

Hasil
Usia pasien endometriosis berkisar antara 24-37 tahun. Berkenaan dengan gejala klinis,
sejumlah besar kasus dengan endometriosis dilaporkan dengan nyeri panggul kronis,
dismenore, dispareunia, dan juga masalah dalam kehamilan.
Gejala endometriosis juga dilaporkan oleh wanita yang tidak terdiagnosis. Perbedaan
signifikan diamati antara kelompok dalam prevalensi semua gejala (P <0,001).
Kami telah mengevaluasi data genotip dari 480 pasien endometriosis dan 600 orang
sehat dengan PCR-RFLP. Distribusi genotip -460T> C dan + 405G> C, genotip spesifik
untuk pasien dengan endometriosis dan kontrol ditunjukkan pada Tabel III. Frekuensi genotip
yang diamati di antara subyek kontrol sesuai dengan keseimbangan Hardy-Weinberg (χ2 =
0,90, P = 0,63 untuk VEGF −460T> C, χ2 = 99,65, P <0,0001 untuk VEGF + 405G> C).
Distribusi persentase dari tiga genotip CC, CT dan TT −460 pada pasien endometriosis
adalah 13,5, 38,9 dan 47,5%, sedangkan pada kelompok kontrol frekuensi ini masing-masing
adalah 12, 38 dan 50%. Tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik ditemukan
dalam distribusi alel T dan C antara kasus dan kontrol (P = 0,72) (Gambar 1). Frekuensi dari
tiga genotip CC, CG dan GG + 405G> C pada kelompok endometriosis masing-masing
adalah 31,8, 47,91 dan 20,2%, sedangkan pada kelompok normal adalah 11, 46 dan 43%.
Risiko endometriosis yang lebih tinggi diamati dengan adanya genotip CC +405 terhadap
pembawa CG atau GG (OR = 3,78, 95% CI 2,74-55,21, P <0,0001). Ada risiko signifikan
endometriosis terkait dengan alel C (OR = 2,47, 95% CI 1,39-4,37, P = 0,002).

Tabel III. Frekuensi genotipe polimorfisme −460T> C dan + 450G> C diantara kasus dan kontrol serta
hubungannya dengan risiko endometriosis.
Polimorfisme Kasus n (%) Kontrol n (%) OR (95% CI) p
–460T>C
CC 65 (13.5) 72 (12) 1.07 (0.89–1.30) 0.63
C/T 187 (38.9) 228 (38) 1.02 (0.89–1.17)
T/T 228 (47.5) 300 (50) 0.94 (0.82–1.08)
+405G>C
CC 153 (31.8) 66 (11) 3.78 (2.74–5.21) <0.0001
CG 230 (47.9) 276 (46) 1.08(0.84–1.37)
GG 97 (20.2) 258 (43) 0.33(0.25–0.44)

Gambar 1. Frekuensi alel VEGF −460T> C dan + 405G> C dalam endometriosis dan kontrol.

Diskusi
Telah diterima secara luas bahwa faktor genetik dan lingkungan dapat terlibat dalam etiologi
endometriosis. Gen kandidat yang secara khusus dipelajari untuk hubungan atau keterkaitan
dengan endometriosis meliputi galactose-1-phosphate uridyl transferase [20], gen
detoksifikasi fase I dan II [21], adhesion intercellular adhesion molecule-1 [22] dan VEGF
[16,19]. Namun, sejauh ini, konsensus tegas mengenai hubungan dari setiap kandidat gen
potensial dan penyakit ini masih kurang. Sejumlah besar penelitian telah menyelidiki dan
mengamati bahwa asam ribonukleat dan mRNA VEGF secara signifikan lebih tinggi pada
wanita dengan endometriosis, yang mendukung peran kunci untuk VEGF dalam angiogenesis
patologis dalam endometriosis [23-26]. Polimorfisme −460T> C dan + 405G> C terletak di
wilayah promotor dan 5’UTR. Polimorfisme dalam VEGF telah diidentifikasi yang diyakini
memiliki aktivitas fungsional. Beberapa studi kasus-kontrol telah menunjukkan hubungan
VEGF SNP dengan risiko berbagai penyakit, termasuk payudara [27], prostat [28], dan
penolakan allograft ginjal [29]. Peran 60460T> C, + 405G> C dan + 936C> T SNPs dalam
VEGF telah terlibat dalam etiologi endometriosis, namun, hasilnya tetap kontroversial [16-
18]. Dalam penelitian ini, kami menyelidiki kontribusi polimorfisme VEGF −460T> C dan +
405G> C terhadap risiko endometriosis di Iran utara. Kami menemukan bahwa genotipe
varian + 405C / C dikaitkan dengan risiko endometriosis yang lebih tinggi bila dibandingkan
dengan GG homozigot dan CG (OR = 3,78; 95% CI = 2,74-55,21). Polimorfisme + 405G> C
diperkirakan terletak di dalam daerah pengikatan faktor transkripsi MZF1, dengan alel C
mengurangi spesifisitas pengikatan; disarankan bahwa produksi VEGF yang lebih rendah
terlihat dengan alel C adalah karena gangguan situs pengikatan MZF1 [12]. Namun, beberapa
studi telah melaporkan hasil yang bertentangan untuk fungsi + 405G> C polimorfisme atau
tidak ada hubungan dengan tingkat VEGF [15].
Kami juga menemukan bahwa 60460T> C tampaknya tidak terkait dengan risiko
endometriosis pada populasi kami. Hsieh et al. (2004) menunjukkan hubungan yang
signifikan antara polimorfisme 60460T> C dan kerentanan terhadap endometriosis, namun,
beberapa penelitian menunjukkan hasil yang berlawanan [16-18,22].
Sebagai kesimpulan, hasil kami menunjukkan bahwa polimorfisme + 405G> C dalam
VEGF dapat dikaitkan dengan risiko endometriosis yang lebih tinggi di Iran utara. −460T> C
tampaknya tidak terkait dengan risiko endometriosis pada populasi kami. Karena
polimorfisme genetik sering bervariasi di antara kelompok etnis yang berbeda, hasil yang
berbeda dalam populasi yang berbeda mungkin disebabkan oleh latar belakang genetik yang
berbeda.