APLIKASI DIAGNOSTIK ANTIBODI

5.1 Reaksi Imunopresipitasi

Reaksi antara antibodi dan antigennya dapat langsung diamati secara in vitro pada
titik kesetaraan konsentrasi komponen-komponen ini. Pada titik ini diamati imunopresipitat.
Properti imunopresipitasi telah banyak dieksploitasi selama bertahun-tahun untuk deteksi dan
kuantisasi antigen dan antibodi. Reaksi imunokimia semacam itu telah paling umum
dilakukan dalam matriks semi-padat seperti gel agar. Difusi komponen imunokimia melalui
gel semacam itu menimbulkan gradien konsentrasi yang memastikan bahwa, pada beberapa
titik, kondisi untuk pengendapan imun akan tercapai asalkan kisi kompleks imun terbentuk.
Posisi dan sifat immunoprecipitates dalam gel dapat digunakan sebagai ukuran konsentrasi
imunokomponen. Indikasi kualitatif reaksi kompleks imun terlihat pada imunodifusi ganda.
Dalam bentuknya yang paling sederhana, lempengan agar agar tipis disiapkan dengan dua
sumur kecil di mana volume kecil larutan antibodi dan antigen ditempatkan. Difusi dibiarkan
berlangsung biasanya selama 24 jam. Pembentukan kompleks imun ditandai dengan adanya
garis presipitin putih yang terbentuk di beberapa titik antara kedua sumur (Gambar 5.1a).
Versi yang lebih kompleks dari ini diwakili oleh lempeng Ouchterlony di mana sumur dapat
dibentuk dalam format melingkar dengan sumur lebih lanjut di tengah. Berbagai
pengenceran antiserum yang diberikan dapat ditempatkan di sumur luar dan larutan antigen
standar ditempatkan di sumur pusat. Penilaian titer antibodi kemudian dapat dibuat sesuai
dengan pengenceran di mana pita presipitin terlihat (Gambar 5.1b).
GAMBAR 5.1 5.1 a) Imunodifusi ganda melibatkan penempatan beberapa mikroliter antigen
(Ag) dan antibodi (Ab) di sumur yang berdekatan yang terbentuk dalam lempengan tipis gel
le.g. agar). Jika antibodi dan antigen bereaksi silang, sebuah pita imunopresipitat terbentuk
pada zona eguivalensi. (B) immunodiffusion Ouchterlony terdiri dari antigen yang baik
mengandung dan dikelilingi oleh sumur misalnya cairan dari pusat ke mana berbagai
pengenceran antiserum ditempatkan. Ini memberikan beberapa panduan tentang 'titer'
antiserum.

Bentuk yang lebih kuantitatif dari teknik ini adalah imunodifusi tunggal. Di sini,
hanya satu dari komponen imun yang terdifusi untuk menyebar, yang lain dimasukkan secara
homogen ke dalam gel. Dalam situasi ini, antigen dalam sumur dibiarkan berdifusi melalui
agar-agar yang mengandung antibodi sehingga membentuk cincin presipitasi. Area di dalam
cincin precipitin sebanding dengan konsentrasi antigen (Gambar 5.2a). Dengan demikian,
konsentrasi antigen yang tidak diketahui dapat ditentukan dengan membandingkannya
dengan larutan antigen standar yang dipasang pada pelat yang sama. Titer antibodi dapat
ditentukan dengan cara yang sama jika antigen dimasukkan ke dalam gel dan antiserum yang
ditempatkan di dalam sumur. Bentuk yang lebih umum digunakan dari pengujian ini tidak
didasarkan pada difusi pasif tetapi lebih pada elektroforesis. Di sini, unsur kuantisasi
diperkenalkan karena jarak yang digerakkan oleh pita presipitin sebanding dengan
konsentrasi imunokomponen di dalam sumur. Untuk alasan yang jelas teknik ini dikenal
sebagai roket imuno-elektroforesis (Gambar 5.2b). Metode Immunoelectrophoretic
umumnya lebih cepat dan sensitif daripada teknik difusi pasif. Semua teknik ini mendapat
manfaat dari penggunaan metode pewarnaan protein untuk menyoroti keberadaan pita
presipitin, misalnya dengan menggunakan pewarna biru Coomassie.

Banyak jenis uji imunopresipitasi telah dijelaskan tetapi contoh-contoh di atas

mewakili prinsip-prinsip umum dari semuanya. Karena pembentukan imunopresipitat
diamati secara langsung dalam semua metode ini, sensitivitasnya sangat terbatas dan dalam
kasus terbaik adalah dalam kisaran 20 ug ml hingga 2 mg ml.
GAMBAR 5.2: (a) Imunodifusi tunggal terdiri dari sumur yang terbentuk di lempeng gel
tempat antibodi sebelumnya telah dimasukkan sebagai bagian dari gel sementara cairan.
Ketika solusi antigen (Ag) ditempatkan di sumur, area yang dicakup oleh cincin precipitin
sebanding dengan jumlah antigen. (B) Immunoelectrophoresls roket diatur dengan cara yang
sama seperti (a) kecuali bahwa protein bermigrasi di bawah pengaruh medan listrik yang
diterapkan daripada oleh difusi. Ini memungkinkan sensitivitas yang lebih besar untuk
dicapai. Kedua sistem ini dapat dibalik dengan memasukkan sejumlah antigen dalam gel
untuk mengkarakterisasi antibodi di dalam sumur.

sensitivitas dapat diperoleh dalam reaksi immunoprecipitatiorn fase-solusi di mana

jumlah yang lebih kecil dari precipitin dapat dideteksi oleh turbidimetri atau nephelometry,
dan khususnya di mana pembentukan kompleks imun dapat dideteksi oleh aglutinasi partikel.
Tes aglutinasi awal membuat banyak penggunaan eritrosit yang dilapisi dengan antigen.
Metode selanjutnya menggunakan mikropartikel lateks karena kekokohannya yang lebih
besar. Pereaksi semacam itu dapat digunakan sebagai alat untuk mendeteksi antibodi
(aglutinasi) atau antigen terlarut (aglutinasi inhibisi) .Dalam yang pertama, keberadaan
antibodi menyebabkan partikel berlapis antigen untuk saling silang dan sedimen sebagai
lapisan difusi sedangkan jika antibodi tidak ada, partikel sedimen sebagai pelet ketat di
bagian bawah tabung reaksi.Untuk pendeteksian antigen terlarut, jumlah antibodi yang
diketahui cukup untuk menyebabkan aglutinasi juga diperkenalkan sebagai reagen dalam
pengetahuan bahwa pengenalan suatu antigen terlarut akan menghasilkan pembentukan
kompleks imun fase-larutan dan dengan demikian menghambat aglutinasi. Arsitektur lain
juga dapat dipertimbangkan (Gambar 5.3). Pengujian jenis ini sering mampu menghasilkan
sensitivitas di bawah 1 ug ml-1.

GAMBAR 5.3: Skematis diagram antibodi aglutinasi lateks di mana antibodi reaksi silang
dapat dideteksi oleh kemampuannya untuk melintang-silang partikel-partikel lateks yang
dilapisi dengan antigen yang relevan dengan partikel lateks berlapis-antigen. glutinasi 'dapat
dideteksi secara visual.

5.2 Radioimmunoassay

Rendahnya sensitivitas deteksi kompleks imun merupakan faktor pembatas utama

dalam penggunaan teknik imunopresipitasi yang dijelaskan dalam Bagian 5.1. Sensitivitas
yang lebih besar dapat dicapai dengan menggunakan teknik radioimmunoassay (RIA).
Dalam bentuk aslinya, RIA yang dijelaskan oleh Yalow dan Berson melibatkan penentuan
konsentrasi insulin dalam sampel serum. Sampel serum diinkubasi dengan sejumlah antibodi
anti-insulin dalam jumlah terbatas.

GAMBAR 5.4 Representasi skematis RIA

.
bersama dengan sejumlah kecil insulin yang sebelumnya telah diberi label dengan yodium
radioaktif (Gambar 5.4). Dengan demikian, karena antigen berlabel dan antigen sampel
dipaksa untuk bersaing dalam jumlah terbatas tempat pengikatan antibodi, jumlah
radioaktivitas yang terikat dalam bentuk kompleks imun secara proporsional sebanding
dengan jumlah antigen (insulin) yang ada dalam sampel. Secara alami, itu perlu untuk
memisahkan antigen yang terikat antibodi dan bebas sebelum mengukur radioaktivitas
kompleks imun dalam penghitung y. Dalam hal ini pemisahan dicapai dengan kertas
kromato-elektroforesis Metodologi dasar ini telah disempurnakan selama bertahun-tahun dan
digunakan secara luas. Label radioaktif yang paling umum digunakan adalah yodium-125
dan tritium (3H). Yang pertama adalah pemancar energi tinggi dengan sensitivitas deteksi
tinggi dan waktu paruh pendek (60 hari), sedangkan yang terakhir adalah pemancar B energi
rendah dengan sensitivitas deteksi V rendah dan waktu paruh yang lama (12 tahun) .

5.2.1 Pelabelan radioaktif

Telah digunakan secara luas untuk pelabelan protein karena dapat dimasukkan ke dalam
residu tirosin dan histidin. Karena itu bukan bagian dari struktur protein normal itu dikenal
sebagai label eksternal dalam situasi ini. 3H paling sering digunakan untuk pelabelan
molekul kecil seperti steroid di mana ia dapat digunakan sebagai atom hidrogen; sedemikian
Karena sensitivitas deteksi 125I begitu sup sering dibuat menggunakan 125I sebagai tempat n
kasus normal 3H digambarkan sebagai label label internal untuk molekul kecil. Ini berfungsi
hormon tiroid karena mereka secara alami cukup baik dalam kasus mengandung yodium yang
dapat diganti dengan 15I sebagai lab internal 125I umumnya hanya dapat digunakan sebagai
Namun, ini adalah kasus khusus dan label eksternal. Seringkali, molekul kecil yang
bersangkutan harus dimodifikasi untuk menerima atom 1251. Hal ini telah dilakukan oleh
pengenalan kimia rantai samping tipe-tyrosyl dan histidyl ke dalam s yang mewakili
perubahan kimiawi utama pada e dan seringkali menghasilkan masalah dengan antibodi
selanjutnya pengakuan. Namun, pendekatan ini telah berhasil digunakan dalam beberapa
kasus . Sementara pengenalan 9H membutuhkan prosedur sintetis khusus, pengenalan 1251
relatif mudah jika molekul yang diberi label memiliki moitas akseptor yang sesuai. Ada
beberapa variasi prosedur dasar. Semua metode bergantung pada penggunaan anion
radioaktif iodida (1251-) yang biasanya dalam bentuk larutan natrium iodida. 125I-
dioksidasi sebelum penambahan molekul yang akan diberi label atau dengan adanya molekul
yang akan diberi label. Molekul yodium yang terbentuk kemudian bereaksi secara spontan
dan cepat dengan rantai samping tirosil atau histidil untuk menghasilkan zat berlabel. Reaksi
kemudian paling sering dihentikan dengan memasukkan zat pereduksi untuk membentuk
kembali 125I- yang tidak reaktif. Produk berlabel dipisahkan dari campuran dengan teknik
yang sesuai. Jika molekul berlabel adalah protein, itu paling mudah dipisahkan dari
komponen dengan berat molekul lebih rendah dengan menggunakan kolom filtrasi gel kecil.
Jika molekul berlabel itu sendiri relatif smali, dimungkinkan untuk dimurnikan dengan
kromatografi lapis tipis atau cairan bertekanan tinggi. kromatografi.

Metode iodinasi yang paling banyak digunakan menggunakan oksidan yang sangat
berbeda. Metode sebelumnya melibatkan larutan pencampur 125I- (1 mCi) dan zat yang
diberi label dengan larutan (10 ul) kloramin T (2,5 mg ml-1 dalam buffer fosfat, 0,2 mol l1,
pH 7,4). Setelah sekitar 10 detik reaksi dihentikan dengan penambahan larutan (10 ul)
natrium metabisulfit (6 mg ml-1 dalam buffer fosfat, 0,2 mol 1-1, pH 7,4) sebelum
pemurnian. Volume reaksi total biasanya kurang dari 100 ul. Metode yang paling baru dan
banyak digunakan adalah penggunaan oksidan fase padat. Di sini, gelas kecil / manik-manik
plastik dilapisi dengan oksidan (misalnya, iodogen) ditambahkan ke larutan 125 dan larutan
zat yang akan diberi label diperkenalkan. Setelah beberapa menit, campuran dikeluarkan dari
manik dan dimurnikan untuk menghasilkan produk berlabel. Metode yang terakhir ini agak
lebih ringan daripada metode sebelumnya dan khususnya disukai dalam situasi di mana zat
yang akan diberi label rentan terhadap kerusakan dengan mengoksidasi atau mengurangi zat.

15I juga dapat dimasukkan ke dalam protein dan peptida dengan metode tidak
langsung. Metode yang paling banyak digunakan pada awalnya dijelaskan oleh Bolton dan
Hunter 16]. Di sini, ester N-hidroksisuksinimida dari asam propanoat 3- (4-hidroksifen)
pertama kali diberi label dengan 12 dengan metode oksidatif dan dimurnikan. Jumlah yang
tepat dari senyawa ini kemudian dicampur dengan larutan zat yang akan diberi label yang
kemudian secara spontan berpasangan dengan amina alifatik primer atau sekunder, seperti
rantai samping lisin. Dengan cara ini, substansinya tidak pernah terpapar pada kondisi
pengoksidasi yang dapat merusak. Lebih lanjut, metode ini memiliki spesifisitas yang
berbeda, mis. Sidis lisin atau amina N-terminal dibandingkan dengan residu tirosin, yang
mungkin menguntungkan dalam keadaan tertentu.

5.2.2 Sistem pemisahan

Area penting dalam teknik immunoassay adalah pengembangan metode yang efisien
untuk memisahkan kompleks imun dari campuran reaksi sebelum kuantisasi aktivitas terikat.
Jelas, diperlukan teknik yang lebih mudah daripada elektroforesis untuk aplikasi rutin. Salah
satu metode pemisahan pertama yang digunakan melibatkan penambahan sejumlah kecil
suspensi arang ke campuran reaksi. Sedimentasi arang kemudian memungkinkan supernatan
dihilangkan dan pelet diisolasi. Molekul kecil yang bebas mengikat arang dengan jelas
sedangkan, ketika molekul kecil terikat pada antibodi, itu tidak mengikat ke arang. Dengan
cara ini aktivitas reagen berlabel yang diukur dalam pelet arang mewakili bahan yang tidak
terikat sedangkan aktivitas dalam supernatan mewakili aktivitas yang terikat dalam bentuk
kompleks imun. Terlepas dari kesederhanaan relatif dari metode ini, ia memiliki beberapa
kelemahan, tak terkecuali kemampuan arang untuk mengikat molekul yang relatif kecil
seperti haptens dan peptida kecil.

Metode alternatif untuk penggunaan arang melibatkan presipitasi istimewa dari

kompleks imun diikuti oleh pemisahan dan kuantisasi. Salah satu metode untuk melakukan
ini adalah dengan menggunakan imunopresipitasi dengan memperkenalkan antibodi kedua
yang memiliki spesifisitas yang sesuai untuk antibodi reagen primer. Dengan cara ini
kompleks imun sekunder terbentuk, yang pada saat presipitasi mengendapkan antigen.
Mengingat persyaratan untuk pengendapan kekebalan, konsentrasi antibodi kedua yang
digunakan harus ditentukan dengan hati-hati dan juga perlu untuk menghadirkan jumlah
imunoglobulin pembawa yang sesuai dari spesies yang sama dengan antibodi primer.
Endapan tersebut dapat ditingkatkan dan dibuat lebih kuat dengan diperkenalkannya larutan
polietilen glikol (PEG) (-1%, b / v). Kebutuhan untuk menggunakan antibodi kedua untuk
menghasilkan presipitasi dapat dihilangkan dengan mengendapkan berat molekul besar.
kompleks imun dengan larutan PEG yang lebih terkonsentrasi (-13%, b / v).

Metode-metode di atas agak tidak nyaman dan secara bertahap telah digantikan oleh
penggunaan pereaksi fase padat di mana, misalnya, antibodi diimobilisasi ke mikropartikel
atau matriks fase padat makro seperti manik-manik dilapisi, tabung atau microwell (lihat
Bagian 2.4.2). Secara umum, kopling ke suspensi partikel mikro seperti selulosa atau partikel
yang dapat dilapis dengan amino-silan telah dilakukan dengan menggunakan metode kimia,
sedangkan kopling ke permukaan bergantung pada adsorpsi pasif. Tabel 2.2 merangkum
kelebihan dan kekurangan dari metode ini.