Obesitas adalah faktor risiko utama yang terkait dengan berbagai

penyakit seperti diabetes, penyakit kardiovaskular, hipertensi, gangguan tulang,

dan kanker. Obesitas adalah penyakit di mana adiposit menjadi besar dengan
mengakumulasi sejumlah besar lipid. Pada tingkat sel, ditandai oleh lonjakan
jumlah dan ukuran adiposit terdiferensiasi dalam jaringan adiposa. Adiposit
adalah situs utama yang menyimpan energi dalam bentuk lipid dan secara tidak
langsung bertanggung jawab atas sensitivitas insulin. Adiposit adalah terbentuk
dari pra-adiposit yang merupakan sel fibroblast yang tidak berdiferensiasi. Proses
diferensiasi ini melibatkan serangkaian langkah yang berkembang dalam pola
tertentu yang diatur oleh berbagai transkripsi faktor-faktor seperti peroksisom
proliferator-activated receptor (PPAR-γ) dan CCAAT / protein pengikat
penambah (C / EBPs) yang selanjutnya mengatur berbagai gen spesifik adiposit.

Dalam kondisi obesitas, peningkatan kadar asam lemak bebas yang

beredar adalah salah satu faktor predisposisi dalam pengembangan resistensi
insulin dan kondisi hiperglikemik terkait dengan diabetes mellitus tipe
2(T2DM).Otot rangka menyumbang porsi utama dari pengambilan glukosa dan
dengan demikian resistensi insulin pada otot rangka adalah faktor risiko utama
untuk T2DM. Telah dilaporkan bahwa asam lemak jenuh, seperti asam palmitat
(PA), bertanggung jawab atas gangguan pensinyalan insulin yang, pada
gilirannya, dikaitkan dengan patogenesis resistensi insulin dan kompromi
pembuangan glukosa dalam sel otot. Transporter glukosa 4 (GLUT4) adalah
transporter glukosa paling banyak diekspresikan dalam otot rangka yang
memfasilitasi penyerapan glukosa di dalam sel dan terutama diatur oleh insulin.
Rangkaian peristiwa yang terdiri dari insulin klasik pensinyalan dengan jalur
PI3K / Akt dan translokasi GLUT4 ke membran sel otot terlibat dalam entri
glukosa yang distimulasi insulin ke dalam sel. Selain itu, aktivasi AMPK telah
ditunjukkan sebagai mekanisme alternatif untuk mempromosikan translokasi
GLUT4 ke membran, sehingga merangsang penyerapan glukosa. Sejumlah
penelitian telah melaporkan bahwa antidiabetik mapan obat seperti metformin,
meningkatkan pengambilan glukosa melalui aktivasi AMPK.

Flavonoid adalah kelompok phytochemical terbesar dan banyak tersedia

dalam berbagai sayuran, buah-buahan, biji-bijian, rempah-rempah, minuman dan
tanaman obat. Banyak penyelidikan telah melaporkan berbagai aktivitas biologis
kelas phytochemical ini dan peran mereka dalam pencegahan dan penyembuhan
berbagai penyakit seperti obesitas, diabetes, kanker, penyakit jantung dan
gangguan tulang. Flavonoid dianggap penting dan kandidat alternatif untuk
manajemen penyakit karena phytochemical ini aman, efektif, ekonomis, tidak
beracun tanpa efek samping atau lebih sedikit. Karena itu, flavonoid baru-baru ini
semakin penting untuk mengembangkan terapi untuk obesitas dan manajemen
diabetes

Dalam penelitian ini, kami memilih empat flavonoid yaitu:

quercetin,rutin, myricetin, dan kaempferol, yang hadir secara luas di berbagai
bidang sumber tanaman, untuk menentukan aktivitas anti-obesitas dan
antidiabetes dan mekanisme kerja yang mendasarinya. Menurut laporan yang ada,
flavonoid ini adalah konstituen aktif paling berlimpah yang hadir di berbagai
tanaman yang memiliki aktivitas antidiabetes. Selain itu, disana adalah beberapa
laporan yang sudah ada sebelumnya yang menunjukkan efek anti hiperlipidemia
dan antihiperglikemia dari flavonoid ini. Menariknya,fitokimia ini termasuk
dalam kelas yang sama "flavonol" yang memiliki 3-hidroksiflavon. Keragaman
dalam flavonol ini disebabkan oleh hidroksil (–OH) pengaturan kelompok dalam
posisi yang berbeda dari struktur dasar. Secara struktural, kaempferol
mengandung empat hidroksil kelompok pada posisi 3, 4 ′, 5 dan 7. Sedangkan
quercetin dan myricetin memiliki gugus hidroksil pada posisi 3, 3 ′, 4 ′, 5, 7 dan 3,
3 ′, 4 ′, 5, 5 ′, 7 masing-masing. Rutin adalah quercetin glikosida dengan rutinosa
disakarida terikat pada posisi 3 pada cincin C. Salah satu strategi untuk mengobati
diabetes mellitus adalah menurunkan penyerapan glukosa dengan menghambat
transporter glukosa seperti GLUT2 dan transporter glukosa yang tergantung-
natrium 1 (SGLT1) Dalam sebuah studi, subkelas flavonoid yang berbeda
diperiksa dengan mengukur transpor glukosa dalam oosit Xenopus yang
mengekspresikan SGLT1 manusia. Flavonol ditemukan menjadi yang paling aktif
di antara subkelas yang diteliti dalam menghambat aktivitas SGLT1. Quercetin
kira-kira 2 kali lipat lebih efektif daripada luteolin, menunjukkan bahwa gugus
hidroksil pada posisi 3 adalah penting untuk aktivitas. Dalam penelitian lain,
ditemukan myricetin dan analog glukosida, isoquercitrin inhibitor ampuh dan non-
kompetitif transporter glukosa usus GLUT2 diekspresikan dalam oosit Xenopus.
Berdasarkan laporan lain, quercetin memiliki efek penghambatan pada α-
glukosidase, enzim hidrolisis karbohidrat. Secara struktural, hidroksilasi, metilasi
dan metoksilasi memainkan peran penting dalam meningkatkan potensi
penghambatan untuk α-glukosidase. Hidroksilasi 5 ′ H hingga OH kuersetin telah
dilaporkan meningkatkan potensi penghambatan untuk α-glukosidase. Demikian
pula, hidroksilasi 3 ′ H menjadi OH dalam kaempferol juga meningkatkan efek
penghambatan pada α-glukosidase. Dalam penelitian lain, analisis penghambatan
α-glukosidase komparatif mengungkapkan bahwa rutin jauh kurang aktif daripada
aglikonnya, quercetin, menunjukkan bahwa O-glikosilasi pada posisi C-3
merugikan aktivitas penghambatan α-glukosidase.

Dengan demikian, berdasarkan laporan di atas dapat dipahami bahwa

beberapa flavonoid ini diketahui memiliki aktivitas antidiabetik dan anti-obesitas.
Namun, modus tindakan mereka yang tepat dalam menguraikan aktivitas-aktivitas
ini masih tetap sulit dipahami. Sejauh pengetahuan kami, efek dari flavonoid ini
pada sel-sel otot L6 yang resisten dan penjelasan jalur pensinyalan insulin belum
diteliti secara rinci. Selain itu, dalam penelitian ini, kami membuat analisis
komparatif yang diuji flavonoid di bawah satu platform untuk efeknya pada
adipogenesis dan resistensi insulin dalam sel adiposit dan otot masing-masing
menggunakan pendekatan in vitro dan in vivo.
2. Material dan metode

1. material

3T3-L1 (sel fibroblast tidak terdiferensiasi) dan L6 (tidak berdiferensiasi

sel otot) jalur sel diperoleh dari Pusat Nasional Ilmu Sel (NCCS), Pune, India.
Semua reagen biakan sel termasuk RPMI-1640, DMEM, trypsin, serum sapi janin
(FBS), dan larutan antibiotik (penicillin-streptomycin) dibeli dari GIBCO (BRL,
Inchinnan, UK). Dimethyl sulphoxide (DMSO), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)
-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), tingkat kultur sel PA dan bahan kimia
tingkat analitik dibeli dari HiMedia (Mumbai, India). Semua antibodi primer dan
sekunder adalah dibeli dari Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). Glukosa darah
kadar ditentukan oleh Accu-check aktif glukometer dan strip glukosa yang
diperoleh dari Roche Diagnostics (Barcelona, Spanyol). Untuk persiapan obat,
quercetin; rutin; kaempferol dan myricetin adalah dilarutkan dalam dimetil
sulfoksida untuk membuat larutan stok. Akhir konsentrasi DMSO di media adalah
0,1%.

2. Sell culture

Sel 3T3-L1 dan L6 dikultur dalam DMEM ditambah dengan 10% FBS,
2mM L-glutamin, 0,1mM asam amino nonesensial dan 1mM natrium piruvat
bersama dengan antibiotik 1% (100 U / ml penisilin dan 100 μg / ml streptomisin).
Sel-sel dipertahankan pada suhu 37 ° C dalam atmosfer yang dilembabkan dalam
inkubator CO2 5%.

3. Uji MTT untuk menentukan viabilitas sel

Sitotoksisitas yang disebabkan oleh beberapa senyawa uji diukur sesuai

dengan protokol yang dijelaskan sebelumnya (Varshney, Gupta, & Roy, 2017).
Secara singkat, sel-sel (5 × 103 sel / sumur) diperlakukan dengan konsentrasi
yang berbeda (1, 10 dan 50 μM) dari setiap flavonoid selama 24 jam. Dosis dan
periode inkubasi yang dipilih didasarkan pada laporan sebelumnya (Crespo et al.,
2008; Ono et al., 2003; Yamamoto et al., 2011). Setelah inkubasi, reagen MTT
ditambahkan pada konsentrasi akhir 0,5 mg / ml dan sel-sel selanjutnya diinkubasi
pada suhu 37 ° C selama 4 jam. Setelah itu, produk formazan yang terbentuk
dilarutkan dalam 200 μl DMSO dan absorbansi direkam pada 570 nm
menggunakan Fluostar Optima Plate Reader (BMG Labtech, Jerman). Persentase
viabilitas sel dihitung dengan rumus berikut:

8. kultur sel L6 dan diferensiasi

Sel-sel L6 dipertahankan dalam ditambah glukosa DMEM tinggi dengan

10% panas FBS yang tidak aktif dan larutan streptomisin-penisilin 1% pada 37 °
C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2. Untuk membedakan Sel-
sel L6, setelah sel-sel mencapai pertemuan 80%, mereka ditambah dengan media
diferensiasi myogenik (DMEM ditambah 2% serum kuda dan larutan penisilin /
streptomisin 1%) selama 7 hari.

9. Uji serapan glukosa

Setelah diferensiasi sel-sel L6, media diferensiasi digantikan dengan

DMEM yang mengandung 0,2% BSA dan myotube yang dibedakan diinkubasi
dengan konsentrasi yang berbeda (1, 10, 50 μM) dari quercetin, rutin, myricetin
dan kaempferol ada atau tidaknya 0,5mM PA selama 24 jam. Sel-sel kemudian
dicuci dengan buffer bikarbonat Krebs-Ringer dan kemudian ditempatkan dalam
buffer yang sama yang mengandung 0,2% BSA dan glukosa 20mM selama 1 jam
inkubasi. Sel-sel diinkubasi dengan atau tanpa insulin (100 nM) di hadapan
quercetin, rutin, myricetin dan kaempferol hingga 60 menit. Kemudian alikuot 25
μl dikeluarkan dari campuran inkubasi dan konsentrasi glukosa ditentukan
menggunakan kit estimasi glukosa GOD-POD (Diagnostik Erba Mannheim
GmbH, Jerman).