Western blotting adalah teknik penting yang digunakan dalam biologi sel dan molekuler.

Dengan menggunakan western blot, peneliti dapat mengidentifikasi protein spesifik dari
campuran kompleks protein yang diekstraksi dari sel. Teknik ini menggunakan tiga elemen
untuk menyelesaikan tugas ini: (1) pemisahan berdasarkan ukuran, (2) transfer ke
penyangga padat, dan (3) menandai protein target menggunakan antibodi primer dan
sekunder yang tepat untuk divisualisasikan. Makalah ini akan mencoba menjelaskan teknik
dan teori dibalik western blot, dan menawarkan beberapa cara untuk memecahkan masalah.
Kata kunci: Penelitian bio-medis, protein, western blot pengantar Western blot sering
digunakan dalam penelitian untuk memisahkan dan mengidentifikasi protein. Dalam teknik
ini, campuran protein dipisahkan berdasarkan berat molekul, dan berdasarkan jenisnya,
melalui elektroforesis gel. Hasil ini kemudian ditransfer ke membran yang menghasilkan pita
untuk setiap protein. Membran tersebut kemudian diinkubasi dengan label antibodi khusus
untuk protein yang diinginkan. Antibodi yang tidak terikat dicuci dan hanya menyisakan
antibodi yang terikat pada protein yang diinginkan. Antibodi yang terikat kemudian dideteksi
dengan mengembangkan film. Karena antibodi hanya mengikat protein yang diinginkan,
hanya satu pita yang harus terlihat. Ketebalan pita sesuai dengan jumlah protein yang ada;
sehingga melakukan standar dapat menunjukkan jumlah protein yang ada. Makalah ini
pertama-tama akan menjelaskan protokol untuk western blot, disertai dengan gambar untuk
membantu pembaca dan teori untuk merasionalkan protokol tersebut. Ini akan diikuti oleh
penjelasan teoritis prosedur, dan di bagian selanjutnya, tip pemecahan masalah untuk
masalah umum.

Lisat sel adalah bentuk sampel yang paling umum digunakan untuk western blot. Ekstraksi
protein mencoba mengumpulkan semua protein di dalam sel sitosol. Ini harus dilakukan
dalam suhu dingin dengan protease inhibitor untuk mencegah denaturasi protein. Karena
sampel jaringan menampilkan derajat struktur yang lebih tinggi, penemuan mekanis, seperti
homogenisasi, atau sonikasi diperlukan untuk mengekstraksi protein. Setelah mengekstraksi
protein, sangat penting untuk mengetahui konsentrasi ekstraknya. Hal ini pada akhirnya
memungkinkan peneliti untuk memastikan bahwa sampel dibandingkan dengan dasar yang
setara. Konsentrasi protein sering kali diukur menggunakan spektrofotometer.
Menggunakan konsentrasi ini memungkinkan untuk mengukur massa protein yang sedang
dimuat ke setiap sumur melalui hubungan antara konsentrasi, massa, dan volume.

Setelah menentukan volume sampel yang sesuai, sampel diencerkan ke dalam buffer
pemuatan, yang berisi gliserol sehingga sampel mudah tenggelam ke dalam sumur gel.
Pewarna pelacak (bromophenol blue) juga ada di buffer memungkinkan peneliti untuk
melihat sejauh mana pemisahan telah berkembang. Sampel dipanaskan setelah diencerkan
ke dalam buffer pemuatan, untuk mengubah sifat struktur orde tinggi, sambil
mempertahankan jembatan sulfida. Merusak struktur tinggi memastikan bahwa muatan
negatif asam amino tidak dinetralkan, memungkinkan protein untuk bergerak dalam medan
listrik (diterapkan selama transfer listrik). Juga sangat penting untuk memiliki kontrol positif
dan negatif untuk sampel. Untuk kontrol positif, sumber protein target yang diketahui, seperti
protein yang dimurnikan atau lisat kontrol digunakan. Ini membantu untuk mengkonfirmasi
identitas protein, dan aktivitas antibodi. Kontrol negatif adalah garis sel nol, seperti β-aktin,
digunakan juga untuk memastikan bahwa pewarnaan tidak spesifik.
Lisis sel untuk mengekstrak protein Protein dapat diekstraksi dari berbagai jenis sampel,
seperti jaringan atau sel. Di bawah ini adalah protokol untuk mengekstrak protein dari sel
yang melekat. Sel yang melekat:

Cuci sel dalam labu atau wadah kultur jaringan dengan menambahkan cold phosphate
buffered saline (PBS) dan goyang perlahan. Buang PBS. (Tip: Simpan hidangan kultur
jaringan di atas es seluruhnya).

Tambahkan PBS dan gunakan pengikis sel untuk mengeluarkan sel. Pipet campuran
tersebut ke dalam tabung microcentrifuge

. Centrifuge pada 1500 RPM selama 5 menit dan buang supernatannya.

Tambahkan 180 μL buffer lisis sel dingin es dengan campuran protease inhibitor segar 20
μL. (Tip: Jika konsentrasi protein tidak cukup tinggi di akhir, disarankan untuk mengulangi
prosedur dengan proporsi yang lebih tinggi dari campuran protease inhibitor).

Inkubasi selama 30 menit di atas es, lalu klarifikasi lisat dengan berputar selama 10 menit
pada 12.000 RPM, pada 4 ° C.

Pindahkan supernatan (atau campuran protein) ke tabung baru dan simpan di atas es atau
dibekukan pada -20 ° C atau -80 ° C.

Ukur konsentrasi protein menggunakan spektrofotometer.

Persiapan sampel

tentukan volume ekstrak protein untuk memastikan 50 μg di setiap sumur.

Tambahkan buffer sampel 5 μL ke sampel, dan buat volume di setiap jalur disamakan
dengan menggunakan suling ganda H2O (dd H2O). Campur dengan baik. (Tip: Disarankan
volume total 15 μL per jalur).

Panaskan sampel dengan dry plate selama 5 menit pada suhu 100 ° C.

Setelah menyiapkan larutan gel susun 10%, pasang rak untuk pemadatan gel

Tambahkan larutan stacking gel dengan hati-hati sampai levelnya sama dengan bar hijau
yang menahan pelat kaca . Tambahkan H2O ke atas. Tunggu selama 15-30 menit sampai
gel mengeras.

Tambahkan larutan gel menggunakan pipet transfer Lapisi stacking gel dengan gel pemisah,
setelah mengeluarkan air.

Masukkan sisir, pastikan tidak ada gelembung udara.

Tunggu sampai gel mengeras.

Elektroforesis

Tuang buffer

Tempatkan gel di dalam elektroforator dan sambungkan ke daya

Pastikan penyangga menutupi gel sepenuhnya, dan lepaskan sisir dengan hati-hati.

Load marker (6 μL) diikuti oleh sampel (15 μL) di setiap sumur

Jalankan gel dengan tegangan rendah (60 V) untuk memisahkan gel; gunakan tegangan
yang lebih tinggi (140 V) untuk susun gel

Nyalakan gel selama kurang lebih satu jam, atau sampai bagian depan pewarna mengalir
dari dasar gel

Elektrotransfer

Potong 6 lembar filter agar sesuai dengan ukuran gel, dan satu membran polivinilidena
fluorida (PDVF) dengan dimensi yang sama.

Basahi spons dan kertas saring di transfer buffer basahi membran PDVF dalam metanol.
Pisahkan piring kaca dan ambil gelnya

. Buat sandwich transfer sebagai berikut: Spons 3 Kertas Filter Gel PVDF 3 Kertas Filter (Tip:
Pastikan tidak ada gelembung udara di antara gel dan membran PVDF, dan peras cairan
ekstra).

Pindahkan sandwich ke peralatan transfer, yang harus diletakkan di atas es untuk menjaga
suhu 4 ° C. Tambahkan buffer transfer ke peralatan, dan pastikan sandwich ditutup dengan
buffer. Tempatkan elektroda di atas sandwich, pastikan bahwa membran PVDF berada di
antara gel dan elektroda positif

Transfer harus dilakukan di atas es Transfer selama 90 menit

Blocking dan antibody incubation

Blok membran dengan susu skim 5% di TBST selama 1 jam.

Tambahkan antibodi primer dalam 5% bovine serum albumin (BSA) dan inkubasi
semalaman dalam suhu 4 ° C pada shaker

Cuci membran dengan TBST selama 5 menit. Lakukan ini 3 kali

Tambahkan antibodi sekunder dalam susu skim 5% di TBST, dan inkubasi selama 1 jam.

Cuci membran dengan TBST selama 5 menit. Lakukan ini 3 kali

Siapkan campuran ECL (mengikuti proporsi larutan A dan B yang disediakan oleh pabrikan).
Inkubasi membran selama 1–2 menit

Visualisasikan hasilnya di ruangan gelap [Gambar 11]. (Tip: Jika latar belakang terlalu kuat,
kurangi waktu pencahayaan). Gambar 11 Gambar 11 Gunakan kaset untuk mengekspos
membran di ruangan gelap resep Larutkan bahan berikut dalam 800 ml H2O suling 8,8 g
NaCl 0,2g KCl 3g basis Tris Tambahkan 500ul dari Tween-20 Sesuaikan pH menjadi 7,4
Tambahkan H2O suling ke 1L Sterilkan dengan penyaringan atau autoklaf