VALIDASI PSPA

VALIDASI METODE ANALISIS SEDIAAN KRIM HIDROKORTISON

MENGGUNAKAN METODE HPLC

Dosen:
apt. Lestyo Wulandari, S.Si., M.Farm.

Kelompok 15 :
1. Ikhar Ridho Dayli (202211101068)
2. Sofyan Dimas Nurhansyah (202211101069)

PROGAM STUDI PROFESI APOTEKER

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2020
 Krim Hidrokortison

1. Penentuan analit dan matriks pada formula krim hidrokortison 1%

a. Analit : Hidrokortison
b. Matriks :
- Cetomacrogol emulsifying wax
- Chlorocresol
- Parafin cair
- Macrogol 300
- White soft parafin
- Purified water

2. Penentuan sifat fisikokimia analit dan matriks

a. Hidrokortison (C21H30O5)

Pemerian : Serbuk hablur, putih sampai praktis putih, tidak berbau

Kelarutan : Sangat sukar larut dalam air dan eter, agak sukar larut dalam aseton
dan etanol, sukar larut dalam kloroform

BM : 362,65 g/mol

Titik Didih :-

Titik Lebur : 220°C

λ max : 254 nm

Log P : 1,61
b. Cetomacrogol emulsifying wax (Cetomacrogol 1000)

Pemerian : Seperti lilin putih atau putih pudar yang meleleh saat dipanaskan
membentuk cairan bening, memiliki aroma seperti setostearil
alkohol

Kelarutan : Tidak larut dalam air, larut dalam alkohol, mudah larut dalam eter,
kloroform, dan propelan aerosol

BM : 1123,5 g/mol

Titik Didih : 35.4-39.6 °C

Titik Leleh : 36-40 °C

λ max : -

Log P : -

c. Chlorocresol

Pemerian : Kristal dimorfosa atau hampir tidak berwarna, atau bubuk kristal
dengan bau fenolik yang khas

Kelarutan : Larut dalam aseton, kloroform, larutan alkali hidroksida, ether, larut
1 bagian dalam 0,4 etanol, larut 1 bagian dalam 260 akuades

BM : 142,58 g/mol

Titik Didih : 235 °C

Titik Leleh : 55,5 - 65 °C

λ max : -

Log P : 0,15
d. Liquid Paraffin

Pemerian : Hablur tembus cahaya atau agak buram, tidak berwarna atau putih,
tidak berbau, tidak berasa, agak berminyak.

Kelarutan : Larut dalam kloroform, eter, minyak atsiri. Sukar larut dalam
etanol dan tidak larut dalam aseton, etanol (95%), dan air. Parafin
dapat dicampur dengan lilin jika dilelehkan.

BM : 400-1400 gram/mol

Titik didih : >370°C

Titik Lebur : 37oC

λmax :-

Log P : 3,39
e. Macrogol 300

Pemerian : cairan kental jernih, tidak berwarna atau praktis tidak berwarna, bau
khas lemah, agak higroskopik.

Kelarutan : larut dalam air, dalam etanol (95%) P, dalam aseton P,

dalam glikol lain dan dalam hidrokarbon aromatik, praktis tidak larut
dalam eter P dan dalam hidrokarbon alifatik.

BM : 285-318 gram/mol

Titik didih : >220°C

Titik Lebur : -15-(-10)oC

λmax :-

Log P :-

f. White Soft Paraffin

Pemerian : Massa lunak putih, translucent, dan tidak berasa. hablur tembus
cahaya atau agak buram, tidak berwarna atau putih, tidak berbau, tidak
berasa, agak berminyak.

Kelarutan : larut dalam benzena, karbon disulfida, kloroform, eter, heksana, dan
terdiri dari sebagian besar minyak dan mudah menguap. tidak larut
dalam air, gliserin, etanol (95%) dan aseton

BM : 209,29 g/mol

Titik didih : >302°C

Titik Lebur : 38-60o C

λmax :-

Log P : 3,74
g. Purified Water

Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna; tidak berbaua

Struktur Kimia :

Kelarutan :-

Berat Molekul : 18,02 gram/mol

Titik didih : 100°C

Titik Lebur : 0oC

λmax :-

Log P :-
3. Penentuan metode analisis yang digunakan
 Metode analisis : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

 Alasan pemilihan metode :

Pada makalah validasi ini metode analisis yang digunakan adalah

kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Pemilihan teknik kromatografi ini
didasarkan pada kelebihannya untuk melakukan pendeteksian secara simultan,
mudah dalam pengoperasian, mempunyai kecepatan analisis dan akurasi hasil yang
cukup tinggi serta memiliki kolom pemisah yang cukup stabil sehingga dapat
digunakan kembali. Metode tersebut mampu memberikan data baik secara
kualitatif maupun kuantitatif dengan tepat dan teliti dibandingkan metode analisa
yang lain.

Data lainnya yang mendukung penggunaan metode KCKT dalam validasi

krim hidrokortison ini adalah penelitian yang dilakukan oleh Henny Puspitasari
2009, dan Herdini dkk, 2020 yang mampu melakukan validasi krim hidrokortison
dengan metode KCKT dengan hasil validasi berupa linieritas, LOD & LOQ,
selektivitas, spesifisitas, presisi, akurasi, dan robustnes yang baik serta memenuhi
persyaratan bahwa metode KCKT mampu digunakan untuk analisis krim
hidrokortison, sehingga berdasarkan hal tersebut maka dipilihlah metode analisis
KCKT.

Metode KCKT yang semakin berkembang untuk penentuan obat telah

mendapat perhatian yang cukup besar dalam beberapa tahun terakhir karena
pentingnya metode tersebut untuk pengendalian kualitas dalam analisis farmasi.
Pada makalah ini dijelaskan, analisis dilakukan dengan KCKT jenis reverse phase
dengan fase diam yang digunakan yaitu kolom C-18. Detektor yang digunakan
adalah UV-Vis.
4. Preparasi Standar dan Sampel Krim Hidrokortison
a. Preparasi larutan standar
- Larutan stok standar 500 ppm disiapkan dengan menimbang 25 mg
hidrokortison dan dilarutkan dalam 50 ml metanol
- Diencerkan dengan metanol untuk mendapatkan larutan baku kerja 10, 20, 30,
40, 50, 60 ppm dengan cara :
Dipipet 0,5 mL dari larutan stok standar dimasukkan dalam labu ukur 25 mL
didapatkan 10 ppm
Dipipet 1 mL dari larutan stok standar dimasukkan dalam labu ukur 25 mL
didapatkan 20 ppm
Dipipet 3 mL dari larutan stok standar dimasukkan dalam labu ukur 25 mL
didapatkan 30 ppm
Dipipet 2 mL dari larutan stok standar dimasukkan dalam labu ukur 25 mL
didapatkan 40 ppm.
Dipipet 1 mL dari larutan stok standar dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 50 ppm
Dipipet 1,2 mL dari larutan stok standar dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 60 ppm
- Fase gerak disaring melalui filter ukuran pori 0,22 μm sebelumnya untuk
injeksi
b. Preparasi larutan sampel
- Larutan stok sampel 500 ppm disiapkan dengan menimbang 1,25 gram krim
hidrokortison dan dilarutkan dalam 25 ml metanol
- Diencerkan dengan metanol untuk mendapatkan larutan baku kerja 10, 20, 30,
40, 50, 60 ppm dengan cara :
Dipipet 0,5 mL dari larutan stok sampel dimasukkan dalam labu ukur 25 mL
didapatkan 10 ppm
Dipipet 1 mL dari larutan stok sampel dimasukkan dalam labu ukur 25 mL
didapatkan 20 ppm
Dipipet 3 mL dari larutan stok sampel dimasukkan dalam labu ukur 25 mL
didapatkan 30 ppm
Dipipet 2 mL dari larutan stok sampel dimasukkan dalam labu ukur 25 mL
didapatkan 40 ppm.
Dipipet 1 mL dari larutan stok sampel dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 50 ppm
Dipipet 1,2 mL dari larutan stok sampel dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 60 ppm
- Fase gerak disaring melalui filter ukuran pori 0,22 μm sebelumnya untuk
injeksi
5. VALIDASI METODE ANALISIS
a) Kualifikasi instrumen
Semua analisis Kromatografi dilakukan pada gradien biner Sistem Jasco HPLC
dengan detektor UV-Vis (JASCO UV-2075 plus) dengan menggunakan perangkat
lunak Borwin Chromatographic. Kolom Hypersil BDS-C18 (250 mm × 4,6 mm
i.d.) MS-II digunakan untuk pemisahan.
b) Prevalidasi
1. Optimasi kondisi analisis
Penentuan panjang gelombang
 Panjang gelombang dari hidrokortison ditentukan dengan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis dalam rentang panjang gelombang 200-400 nm.
 Dibuat larutan sampel hidrokortison 1 µg/mL dalam fase gerak untuk
scanning.
2. Preparasi fase gerak
 Pelarut organik asetonitril dan aquabides dalam rasio masing-masing
60:40 dalam volume 50 mL. asetonitril dipipet 35 mL, aquabides dipipet
15 mL.
 Campuran larutan didegradasi dalam penangas air ultrasonik selama 10
menit.
3. Penentuan fase diam
Fase diam yang digunakan pada optimasi kondisi analisis yaitu dengan
menggunakan kolom Hypersil BDS-C18 (250 mm × 4,6 mm i.d.) MS II untuk
pemisahan.
4. Optimasi konsentrasi uji
 Preparasi standar
Dibuat larutan standar dalam pelarut dengan konsentrasi 1,2, 4, 6, 8, 10,
20, 30, 40 dan 50 µg/mL dengan cara seperti di atas.
 Preparasi sampel
Dibuat larutan standar dalam pelarut dengan konsentrasi 1,2, 4, 6, 8, 10,
20, 30, 40 dan 50 µg/mL dengan cara seperti di atas.
3. Preparasi eluen
4. Analisis dengan KCKT
a. Dinyalakan komputer dan alat KCKT
 b. Dicuci kolom menggunakan aquades (dipilih program mencuci pada alat
KCKT) sampai tekanan konstan
c. Dicuci kolom menggunakan eluen sampai tekanan konstan
d. Diatur kondisi analisis pada komputer, metode perhitungan, dan batch
proses
e. Disuntikan masing-masing larutan standard dan sampel
f. Diamati hasil kromatogram
g. Dihitung nilai N dan H puncak larutan standar dan dihitung resolusi
puncak larutan sampel terhadap puncak penggangu.

Kondisi analisis sebagai berikut :

Fase diam : kolom Hypersil BDS-C18 (250 mm × 4,6 mm i.d.) MS II
Fase diam tersebut dipilih karena merupakan kolom yang sering digunakan
yaitu C-18 dengan sifatnya yang non polar.
Fase gerak : asetonitril : aquades (60:40).
Fase gerak tersebut dipilih karena merupakan asetonitril dan aquades biasanya
digunakan untuk fase gerak yang bersifat polar dan juga larutan tersebut
terutama dapat melarutkan analit. Analit yang bersifat polar akan lebih cepat
keluar pada fase diam yang non polar. Pada HPLC ini digunakan metode
isokratik dengan perbandingan fase gerak yang tidak sebanding.
Kecepatan alir : 1,0 mL/min
Waktu run : 2 min
Retention time : 1,668 min
Retention time pendek karena komponen fase gerak bersifat larut air dan
memiliki porsi polar yang lebih banyak.
Suhu kolom : 25 ºC
Volume injeksi : 20 µL
Panjang gelombang deteksi : 252 nm
Panjang gelombang tersebut dipilih karena pada panjang gelombang tersebut
merupakan panjang gelombang maksimal sehingga dapat memberikan serapan
yang maksimal juga.
Konsentrasi uji : 30 µg/mL
Konsentrasi uji tersebut dipilih karena dapat menghasilkan % akurasi yang
lebih besar di dalam rentang persyaratan dan juga nilai N yang dihasikan lebih
besar serta nilai H yang dihasilkan lebih kecil sehingga dipilih konsentrasi uji
pada 30 µg/mL.
6. Validasi
a) Uji spesifisitas
1. Preparasi Standar
Dibuat larutan standar dalam pelarut metanol dengan konsentrasi sesuai hasil
optimasi konsentrasi (30 ppm) dengan langkah ditimbang 15 mg hidrokortison
dilarutkan dalam 100 mL metanol, didapatkan konsentrasi larutan standar 150
ppm. Selanjutnya diencerkan larutan standar dengan cara memipet 10 mL
larutan standar dan dilarutkan dalam 50 mL metanol sehingga didapatkan
konsentrasi 30 ppm.

2. Preparasi Sampel
Dibuat larutan sampel dalam pelarut metanol dengan konsentrasi sesuai
dengan hasil optimasi (30 ppm) dengan langkah dipipet 3 ml larutan stok
sampel yang sebelumnya telah dibuat dari penimbangan 1,25 gram sampel
dilarutkan dalam 25 ml metanol. 3 ml yang telah dipipet kemudian dilarutkan
dalam 25 ml larutan metanol sehingga didapatkan konsentrasi 30 ppm.

3. Preparasi Eluen
4. Analisis dengan KCKT
5. Analisis kualitatif puncak analit dengan detektor

b) Uji Linieritas
Uji linearitas yang memenuhi persyaratan dilihat dari nilai koefisien regresi (r)
yang dihasilkan, apabila nilainya ≥0,999 maka dianggap telah linier. Linearitas
ditentukan dengan menghitung garis regresi dari plot area puncak vs konsentrasi
larutan standar.
1. Preparasi standar
- Dibuat standar azitromycin dalam pelarut dengan konsentrasi antara 10%
sampai 200 % dari konsentrasi uji sebanyak 5-10 titik konsentrasi yaitu 4,
8, 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 ppm.
- Dibuat 2 larutan stok standar, stok standar (1) dibuat dengan menimbang 1
mg standar hidrokortison dilarutkan dalam 50 ml metanol, sehingga
didapatkan larutan stok standar 1 dengan konsentrasi 20 ppm. Selanjutnya
dibuat larutan stok standar (2) dengan menimbang 10 mg hidrokortison dan
dilarutkan dalam 100 ml metanol sehingga didapatkan larutan stok standar
2 dengan konsentrasi 100 ppm.
- Larutan stok standar 1 dan 2 selanjutnya diencerkan untuk mendapatkan
konsentrasi uji dengan cara :
 Dipipet 1 mL dari larutan stok standar 1 dimasukkan dalam labu ukur 5 mL
didapatkan 4 ppm.
Dipipet 2 mL dari larutan stok standar 1 dimasukkan dalam labu ukur 5 mL
didapatkan 8 ppm.
Dipipet 5 mL dari larutan stok standar 1 dimasukkan dalam labu ukur 10
mL didapatkan 10 ppm.
Dipipet 5 mL dari larutan stok standar 2 dimasukkan dalam labu ukur 25
mL didapatkan 20 ppm.
Dipipet 3 mL dari larutan stok standar 2 dimasukkan dalam labu ukur 10
mL didapatkan 30 ppm.
Dipipet 2 mL dari larutan stok standar 2 dimasukkan dalam labu ukur 5 mL
didapatkan 40 ppm.
Dipipet 5 mL dari larutan stok standar 2 dimasukkan dalam labu ukur 10
mL didapatkan 50 ppm.
Dipipet 1,2 mL dari larutan stok standar 2 dimasukkan dalam labu ukur 5
mL didapatkan 60 ppm

2. Preparasi eluen
3. Analisis dengan KCKT
4. Menghitung nilai parameter linearitas dan rentang dari data hasil
scanning dicocokkan dengan persyaratan uji linearitas

c) Batas Deteksi dan Batas Kuantifikasi

Persyaratan nilai dari LOD harus di bawah konsentrasi linearitas. LOD dan LOQ
dapat ditentukan dengan cara standar deviasi dari respon berdasarkan standar deviasi
blanko serta ditentukan dari rasio standar deviasi respon blanko menggunakan standar
deviasi residual dari garis kalibrasi atau standar deviasi intercept (s) dan slope (S)
dengan rumus : LOD : 3,3 s/S ; LOQ : 10 s/S.
1. Preparasi standar
Dibuat 3 seri konsentrasi larutan stok standar dengan langkah (1) ditimbang
standar hidrokortison 0,5 mg kemudian dilarutkan dalam 50 mL sehingga
didapatkan larutan stok standar 1 dengan konsentrasi 10 ppm. (2) Selanjutnya
ditimbang standar hidrokortison 0,15 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL
sehingga didapatkan konsentrasi 15 ppm. (3) ditimbang standar hidrokortison
 0,25 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL sehingga didapatkan konsentrasi
25 ppm. Ketiga larutan stok standar selanjutnya di encerkan untuk
mendapatkan larutan baku kerja dengan konsentrasi 0,15; 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2;
2,5; dan 3 ppm dengan cara :
Dipipet 0,1 mL dari larutan stok standar 1 dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 0,15 ppm.
Dipipet 0,1 mL dari larutan stok standar 3 dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 0,25 ppm.
Dipipet 0,2 mL dari larutan stok standar 3 dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 0,5 ppm.
Dipipet 1 mL dari larutan stok standar 1 dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 1 ppm.
Dipipet 1 mL dari larutan stok standar 2 dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 1,5 ppm.
Dipipet 2 mL dari larutan stok standar 1 dimasukkan dalam labu ukur 5 mL
didapatkan 2 ppm.
Dipipet 1 mL dari larutan stok standar 3 dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 2,5 ppm.
Dipipet 2 mL dari larutan stok standar 2 dimasukkan dalam labu ukur 10 mL
didapatkan 3 ppm

2. Preparasi eluen
3. Analisis KCKT
4. Menghitung nilai parameter batas deteksi dan batas kuantitasi dari data
hasil scanning dengan program validasi

d) Presisi
Persyaratan RSD pada uji presisi yaitu <2%. Pada literatur tercantum hasil presisi
sebesar 0.23 %.
1. Preparasi standar
a. Dibuat larutan standar hidrokortison dalam pelarut sebanyak 5 macam
dengan konsentrasi antara 80-120% dari konsentrasi uji.
b. Dibuat 3 macam larutan stok standar (1) ditimbang 10 mg hidrokortison
dilarutkan dalam 10 mL pelarut sehingga didapatkan konsentrasi 1000
 ppm. (2) ditimbang 14 mg hidrokortison dilarutkan dalam 10 mL pelarut
sehingga didapatkan konsentrasi 1400 ppm. (3) ditimbang 8 mg
hidrokortison dilarutkan dalam 5 mL pelarut sehingga didapatkan
konsentrasi 1600 ppm.
c. Dilakukan pengenceran larutan stok standar sehingga didapatkan 5 macam
konsentrasi dalam rentang 80-120% dari konsentrasi uji yaitu 0,313;
0,625; 1,25; 2,5; dan 5 ppm dengan cara sebagai berikut :
 Dipipet 5 mL dari larutan stok standar 1 dimasukkan dalam labu ukur
200 mL didapatkan 25 µg/mL.
 Dipipet 3 mL dari larutan stok standar 1 dimasukkan dalam labu ukur
100 mL didapatkan 150 µg/mL.
 Dipipet 1 mL dari larutan stok standar 2 dimasukkan dalam labu ukur
50 mL didapatkan 28 µg/mL.
 Dipipet 1 mL dari larutan stok standar 3 dimasukkan dalam labu ukur
50 mL didapatkan 32 µg/mL.
 Dipipet 5 mL dari larutan stok standar 2 dimasukkan dalam labu ukur
200 mL didapatkan 35 µg/mL

2. Preparasi sampel
Dibuat larutan sampel dalam pelarut metanol dengan konsentrasi sesuai
dengan hasil optimasi (30 ppm) dengan langkah dipipet 3 ml larutan stok
sampel yang sebelumnya telah dibuat dari penimbangan 1,25 gram sampel
dilarutkan dalam 25 ml metanol. 3 ml yang telah dipipet kemudian
dilarutkan dalam 25 ml larutan metanol sehingga didapatkan konsentrasi
30 ppm, di replikasi sebanyak 5 kali.

3. Preparasi eluen
4. Analisis dengan KCKT
5. Menghitung parameter kepresisian dari data hasil scanning dan
dicocokkan dengan persyaratan presisi.
e) Akurasi
Persyaratan RSD dalam uji akurasi yang baik yaitu <1,9% dengan nilai persen
recovery 98-102%. Literatur menyebutkan hasil akurasi sebesar 98.24% dan 98.84 %.
1. Dibuat sampel akurasi dengn cara adisi, dengan penambahan standar
sebanyak 30%, 45%, dan 60%.
2. Preparasi standar
Dibuat standar azitromycin dalam pelarut dengan konsentrasi antara 80- 180%
dari konsentrasi uji sebanyak 5 titik, digunakan kosentrasi 25, 35, 40, 45, dan
50 ppm
3. Preparasi eluen
4. Preparasi sampel
Ditimbang sampel sejumlah tertentu dari sampel adisi, kemudian dilarutkan
dalam metanol sampai didapat konsentrasi hidrokortison sesuai hasil optimasi
konsentrasi uji. Masing-masing sampel adisi dilakukan 3 replikasi
5. Analisis dengan KCKT
6. Menghitung parameter akurasi dari data hasil scanning dan dicocokkan
dengan persyaratan akurasi.
7.
 Dapus

 Rowe, R.C., Paul, J.S., Marian, E.Q., 2009. Handbook of Pharmaceutical Excipients
6th Edition. Pharmaceutical Press : London
 Farmakope Indonesia Edisi V
 Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
 Durgbank.ca
 Medicine.org.uk
 Henny, 2009, Optimasi Pemisahan Campuran Hidrokortison dan Kloramfenikol
Dalam Krim merek X Menggunakan Metode KCKT, Yogyakarta, Universitas Sanata
Dharma
 Herdini, Nurmalasari Dewi, Hadi Veriah, 2020, Analisis Hidrokortison Asetat dalam
Sediaan Krim Pemutih Wajah Secara Kromatogragi Cair Kinerja Tinggi, Jurnal Sains,
Teknologi & Informatika Vol 7