Enzima,

Biofuel.
Efectos en la
velocidad de
reacción
enzimática

Esta práctica se realizó

con la finalidad de
determinar qué factores
afectan a la actividad
enzimática.

Grupo 1: Beatriz
Pedre, Sonia
Carballo, Lucía
Martínez, Vanesa
Gacio y Ana
Barreiro
28/01/2011
 PRÁCTICA 1

· DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO

FORMADO.

Tabla 1. Comparación de las cubetas de reacción a las cubetas estándar.

TIEMPO (min) CUBETA ESTÁNDAR QUE CANTIDAD DE p-

ES MÁS SIMILAR nitrofenol (nmol)

0 Inicio S1 0

8 Fin S1 0

1 E1 S2 0

2 E2 S3 12,5

4 E3 S4 25

6 E4 S4 50

8 E5 S5 100

· DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO

FORMADO.

1. Localizar las cinco cubetas de los estándar etiquetados S1-S5 en su

mesa de laboratorio, sus concentraciones se observan en la Tabla 1.
El blanco del espectrofotómetro a 410 nm se realiza con la cubeta S1.
A continuación, medir y registrar la absorbancia a 410nm para el
resto de estándar en el cuadro 3. Se usará esta información para
generar una curva que relaciona la absorbancia a 410 nm con la
cantidad presente de p-nitrofenol.

Tabla 3. Valores de absorbancia de las normas.

ESTÁNDAR CANTIDAD DE p- ABSORBANCIA A 410

nitrifenol nm

S1 0 0,000

S2 12.5 0,188

S3 25 0,391

S4 50 0,789

S5 100 1,615
 2. Medir la absorbancia de la cubeta de reacción catalizada pro la enzima
(E1-E5) y su cubeta de control (Inicio-Fin) a 410 nm, y registrar sus
resultados en la Tabla 4. Usted usará esta información para determinar
la cantidad de producto, p-nitrofenol, formado en las cubetas de
reacción.

Tabla 4. La determinación de p-nitrofenol producidos utilizando una curva

estándar.

TIEMPO (mn) CUBETA CANTIDAD DE p- Absorbacia a

nitrofenol (nmol) 410nm

0 Inicio 3,055 0,049

8 Fin 28,99 0,465

1 E1 0,000 0,000

2 E2 109,11 1,750

4 E3 160,98 2,582

6 E4 171,71 2,754

8 E5 172,71 2,770

3. Determinar (nmol) de producto formado a partir de los valores de

absorbancia. La absorción del producto, p-nitrofenol, está directamente
relacionado con la cantidad actual de nitrofenol en la cubeta. En otras
palabras, la solución más amarilla, la que más p-nitrofenol tiene y mayor
será su valor de absorbacia a 410 nm. Trazando los valores de
absorbancia de los estándares con cantidades conocidas de p-nitrofenol
(llamada curva estándar), puede determinar la cantidad de p-nitrofenol
que está presente en la enzima muestras de ensayo.

Gráfica 1.
 Gráfica 2.

·ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS.

1. Tasa inicial de formación de producto

Al comienzo de la reacción, hay un montón de sustrato para la enzima. Sin

embargo, como la reacción progresa, hay menos sustrato disponible, porque
se está convirtiendo en producto. Si el gráfico la cantidad de producto
formado en cada momento, los datos pueden ser utilizados para calcular el
tipo inicial del producto que se forma en la presencia o ausencia de la
enzima.

En la gráfica 3, la cantidad de producto, p-nitrofenol, se traza a través del

tiempo para determinar la cantidad inicial de producto formado. La unidad
de velocidad es nmol / min.

Gráfica 3.

La gráfica 3. Ejemplo de una curva para una reacción enzimática. La

cantidad de producto elaborado en función del tiempo para determinar la
velocidad inicial de reacción.

Hay una región donde la cantidad de producto formado aumenta de forma

lineal. Esto se llama la velocidad inicial de reacción. En el gráfico anterior,
esta región es lineal entre 0 y 4 minutos.

Tasa inicial de formación de producto = pendiente de la recta y = cambio

en y / cambio en x

Tasa inicial de formación de producto= (171,71-0)/ (4-0)= 42,93

nmol/min

PRÁCTICA 2

·ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO A DIFERENTES

TEMPERATURAS.
1. Deberíamos tener 5 cubetas del estándar S1-S5 (patrones colorimétricos
realizados en la actividad 1). Comparamos los ensayos anteriores con los
patrones y relacionamos cuales son semejantes.

2. Hacemos una tabla con las temperaturas, el estándar que más se le

parece, y la concentración del patrón.

Temperatura Patrón similar Concentración del

patrón

0º C S5 100

22º C S5* 100

37º C S5* 100

*Se apreció un color más oscuro que S5

·ANÁLISIS CUALITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO A DIFERENTES TEMPERATURAS.

1. Hacemos un blanco en el espectrofotómetro con el estándar S1 a 410nm

y medimos la absorbancia de las 3 muestras.

2. Hacemos una tabla con los resultados.

Temperatura Absorbancia a 410 Concentración del

nm. producto formado

0ºC 1.162 71.71

22ºC 2.372 147.16

37º C 2.382 147.78

·ANÁLISIS DEL RESULTADO.

1. Calculamos la velocidad de reacción a cada una de las diferentes

temperaturas. Como sólo se puede medir una cantidad de patrón a los dos
minutos, asumimos que la cantidad de patrón es de 0 nM.

·CÁLCULOS.

PRODUCCIÓN INICIAL A 0º C = (71.71 – 0 nmol) / (2 – 0 min) =

35.85nmol/min

PRODUCCIÓN INICIAL A 22º C = (147.16 – 0 nmol) / (2 – 0 min) =

73.58nmol/min
PRODUCCIÓN INICIAL A 37º C = (147.78 – 0 nmol) / (2 – 0 min) =
73.89nmol/min

Representamos gráficamente la velocidad de reacción enzimática.

·ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

En la gráfica se refleja como las temperaturas más altas actúan como

catalizador para que la velocidad de reacción sea mayor.

Practica 3

Determinación de p-nitrofenol producido en tres deferentes valoraciones de

pH basado en las normas de p-nitrofenol.

pH Patrón más parecido Concentración de

p-notrofenol

5.0 S5 100

6.3 S5* 100

8.6 S5* 100

*Más oscuro.

·ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO

FORMADO EN DIFERENTES NIVELES DE PH.

pH Absorbancia (410 nm) Concentración de

p-nitrofenol

5.0 1.947 120.66

6.3 1.884 116.73
 8.6 1.459 90.23

·Representación gráfica del efecto del pH a la concentración.

pH Velocidad de reacción
5.0 60.33
6.3 56.32
8.6 45.12

PRÁCTICA 4:

·ANÁLISIS CUALITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO

A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ENZIMA.

1. Deberíamos tener 5 cubetas del estándar S1-S5 (patrones colorimétricos

realizados en la actividad 1). Comparamos los ensayos anteriores con los
patrones y relacionamos cuales son semejantes.

TABLA1. PATRONES DE P-NITROFENOL.

ESTÁNDAR CANTIDAD DE p- ABSORBANCIA A 410

nitrifenol nm

S1 0 0,000

S2 12.5 0,188

S3 25 0,391

S4 50 0,789

S5 100 1,615

2. Hacer un blanco en el espectrofotómetro con el S1 a 410nm y mide la

absorbancia de las seis cubetas obtenidas, y anotar la absorbancia.

Cubeta Absorbancia concentración p- Tiempo (min)

nitrofenol

H1 0,529 32,9827642 1

H2 1,282 79,931765 2

H3 1,642 102,377502 8
L1 0,434 27,0595835 1

L2 0,422 26,3113922 2

L3 0,763 47,5724935 8

3. Calcular la cantidad de p-nitrofenol.

Tasa inicial es 166,9675 nmol/min para concentración alta

Tasa inicial para concentración baja 0,9931 nmol/min

Gráfica.
 120

100
Cantidad p-nitrophenol

80

Serie1
60
Serie2

40

20

0
0 2 4 6 8 10
tiempo (min)

Serie 1: High; Serie 2: Low

PRÁCTICA 5

·ANÁLISIS CUALITATIVO DE LA CANTIDAD DE PRODUCTO FORMADO

A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ENZIMA.

1. Deberíamos tener 5 cubetas del estándar S1-S5 (patrones colorimétricos

realizados en la actividad 1). Comparamos los ensayos anteriores con los
patrones y relacionamos cuales son semejantes.

2. Hacer un blanco en el espectrofotómetro con el S1 a 410nm y mide la

absorbancia de las seis cubetas obtenidas, y anotar la absorbancia

Cubeta Concentración de p- Absorbancia Tiempo(min)

nitrofenol

H1 167,781887 2,691 1

H2 174,827355 2,804 2

H3 177,383675 2,845 8

L1 110,545257 1,773 1

L2 110,794654 1,777 2
 L3 116,406088 1,867 8

Gráfica.

180

170

160
Cantidad p-nitrophenol

150

Serie1
140
Serie2

130 hot

120

110

100
0 2 4 6 8 10
tiempo (min)

*serie 1: high; serie 2: low

PRÁCTICA 6

·DETERMINACIÓN DE P-NITROFENOL PRODUCIDO POR UN

EXTRACTO DE HONGO

Cubeta Absorbancia Concentración de

p-nitrofenol
producido.
1 0.385 23.27
2 0.463 28.13
3 0.577 35.24
4 0.700 42.91
5 0.755 46.34
6 0.000 0.00

Tiempo Concentración de
P-nitrofenol producido.
0 0
1 23,27
 2 28,13
4 35,24
6 42,91
8 46,34

Gráfica.

En la grafica se observa como aumenta la concentración de p-nitrofenol con

el aumento del tiempo de reacción.

Calcula la concentración inicial de la velocidad de reacción del extracto de hongo.

Velocidad inicial de reacción: (23.27-0) nmol/ (2-0) min=11.635 nmol/min