Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan

di tempat yang steril, yaitu dilaminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga
steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol
yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang
melakukan kultur jaringan juga harus steril.

STERILISASI DALAM RUANG KULTUR

JARINGAN TANAMAN

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik

yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada
lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat
membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri
(Hadioetomo 1993). Sterilisasi merupakan langkah awal dalam
penanaman daun keladi dan batang jarak pagar pada media MS.
Sterilisasi dilakukan untuk membunuh bakteri dan cendawan yang
melekat pada eksplan maupun pada alat serta bahan yang digunakan
dalam penanaman eksplan.

Salah satu ruang yang harus dijaga kesterilannya adalah ruang transfer
yang digunakan untuk inokulasi, isolasi dan subkultur. Ruangan ini
biasanya tidak terlalu besar agar proses sterilisasinya tidak lama dan
mudah. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan menyemprotkan alkohol
90%, dan sterilisasi lantai dengan kain pel yang dibasahi dengan alkohol
90% atau phenol. Sterilisasi ini mutlak dilakukan menjelang ruang
inokulasi akan digunakan. Lampu ultraviolet dapat digunakan untuk
sterilisasi ruang, dan biasanya selalu dinyalakan apabila ruang inokulasi
tidak digunakan, serta dimatikan saat masuk dalam ruang ini (Edhi
Sandra, 2013).

Dalam kultur jaringan ada beberapa ruangan sbb:

1) Ruang persiapan yang di dalamnya terdapat timbangan analitik,
lemari pendingin, hotplate, mikrowave, oven, pH meter, alat-alat gelas
standar (labu takar, pipet volume, erlenmeyer, gelas piala, batang
pengaduk dari gelas, dan wadah kultur), alat untuk mencuci (washtaple),
lemari untuk alat dan bahan kimia, sentrifuse, fumehood, destilator, dan
kereta dorong;

2) Ruang transfer yang di dalamnya terdapat laminar air flow, dissecting,

mikroskop, alat diseksi, lemari tempat penyimpanan alat-alat steril, dan
timbangan kecil3) Ruang kultur yang dilengkapi dengan rak kultur dan
lampu fluorescent, timer untuk mengatur lama penyinaran, AC untuk
mengontrol temperatur, mikroskop binokuler, dan shaker (Barahima,
2011).
REPORT THIS AD

3) Ruang kultur yang dilengkapi dengan rak kultur dan lampu

fluorescent, timer untuk mengatur lama penyinaran, AC untuk
mengontrol temperatur, mikroskop binokuler, dan shaker (Barahima,
2011).

1. Sterilisasi Ruang:
Sapu bersih lantai dan dinding ruang transfer dengan sapu yang telah
disediakan. Pel lantai dengan larutan desinfektan (alkohol 90%-70%
larutan phenol, dll)
Semprot diding ruang dengan alkohol 95-70% tau cukup dengan lampu
UV(Ultra Violet) bila ada selam satu jam sebelum ruang tersebut di
pergunaan

 Di dalam sterilisisasi ruangan, untuk semua ruangan kultur

jaringan di bersihakan dan di gunakan alkohol 70% dan di semprot
dengan formalin 5% ke seluruh ruangan tersebut.

2. Sterilisasi Peralatan Gelas dan Peralatan Lain.

 Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat
disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130o-
170oC selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus
sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan
terdekomposisi pada suhu 170oC.
Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan
yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. Untuk
peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar,
setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol
96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen.

Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini

harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah
terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan
tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan
cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon,
pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur.
Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC
dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit.

Sterilisasi alat gelas standart

Botol dicuci bersih dengan sabun cair menggunakan spons dan sikat
hingga bersih lalu bilas dengan air bersih
Botol dikering anginkan dengan menggunakan lap bersih, susun rapi
kedalam oven
Lalu masukkan ke dalam autoclave pada suhu 1210C selama 60 menit
pada tekanan 175 psi (pound per square inch)
Untuk botol-botol yang mempunyai tutup autoclaveable,jangan ditutup
terlalu kencang karena selama pemanasan terjadi pemuaian
Alat-alat yang disterilkan sebelum pemanasan adalah
pinset,gunting,kertas saring, petridish,botol kosong,pipet
Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kantong plastik yang
disealer sebelum dimasukkan ke dalam autoclave. Alumunium foil tidak
dianjurkan sebagai pembungkus karena uap air tidak dapat masuk
kedalam pembungkus.
Alat-alat seperti pinset,gunting,gagang scalpel dibungkus dengan plastik
yang telah disealer
Petridish dan tutup botol disterilkan dengan pembungkus plastik yang
sudah disealer,Selanjutnya autoclave dibuka dan peralatan yang telah
disterilisasi diambil Kering anginkan semua peralatan,simpan dengan
rapid an ditempat yang bersih.

3. Sterilisasi Media

Ada dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu
dengan autoclave dan filter membran. Media kultur, air destilasi dan
campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan
menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil atau
plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil
(heat-labile) harus menggunakan filter. Umumnya media diautoclave
pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC. Untuk volume larutan per
wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan adalah 15-20
menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit.
Tekanan jangan melebhi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan
dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat
thermolabile.

4. Sterilisasi Bahan Tanaman

Mendapatkan bahan tanaman yang steril merupakan hal yang sulit.

Meskipun bermacam tindakan pencegahan sudah dilakukan, 95% kultur
akan mengalami kontaminasi apabila eksplan tidak didisinfeksi. Organ
atau jaringan tanaman harus disterilisasi dengan larutan disinfektan,
karena sebagai bahan biologis tidak dapat dilakukan dengan cara
pemanasan yang ekstrim.

Tidak ada metode yang baku untuk sterilisasi eksplan, sehingga waktu
perendaman dalam larutan disinfektan merupakan kisaran karena
tergantung pada jenis bahan dan tanaman yang akan disterilisasi.
Larutan yang digunakan harus yang aman bagi jaringan/eksplan tetapi
bersifat dapat membunuh kontaminan baik bakteri maupun jamur.
Untuk tanaman berkayu, umbi dll. biasanya sebelum disterilisasi dengan
larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu dengan sabun dan dibilas
dengan air mengalir, tetapi tidak untuk tanaman jenis herbaceous.
Semua permukaan eksplan yang disteriliasi harus terendam dalam
sterilan, dan setelahnya harus dibilas dengan akuades steril sekurang-
kurangnya tiga kali.

Sterilisasi Botol kuljar (dari gelas)

Rendam botol kultur ke dalam bak yang berisi air yang telah di beri
ditergen secukupnya agar kotoran mudah menghilan.
bersihkan botol-botol kultur dari semua kotoran (sisa label dan kotoran
lainnya dengan menggosok menggunakan sikat pembersihan botol.
Bilas botol yang teah di cuci dengan air bersih/air mengalir agar sisa
diterge hilang
Taruh botol-botol yang telah di cuci dalam posisi terbalik dalam bak agar
cepat atus, serta botol-botol tersebut di lap dengan kain bersih.
Seterilkan botol-botol kultur dengan cara memanasakan ke dalam oven
pada suhu 160oC selama + 2-3 jam.
Bersihkan tempat penyimpanan botol kultur (dari gelas) dengan
menyemprot alkohol 70% agar tempat tersebut tetap steril.
Setelah botol selesai dari oven tunggu sebentar, agar semua botol kultur
tersebut dingin dan di pindahkan ke tempat yang telah di sediakan pada
poin ke 6 serta dalam penyusuanan di lakukan penumpukan dengan cara
miring.