A.

Wang, 2012

Judul : Metode HPLC / UV yang sederhana dan cepat untuk simultan

kuantifikasi empat konstituen dalam tablet anti-tuberkulosis 4-FDC
dengan derivatisasi pra-kolom

Abstrak : Metode RP-HPLC yang ditingkatkan dan sensitif untuk penentuan simultan dari
empat unsur anti-tuberkulosis: pyrazinamide (PYR), isoniazid (INH), rifampicin (RIF) dan
ethambutol hydrochloride (EMB · 2HCl) dalam anti-tuberkulosis 4-FDC Tablet (kombinasi dosis
tetap) telah dikembangkan dan divalidasi. Untuk meningkatkan stabilitas solusi yang disiapkan
sebelum analisis dan untuk mendapatkan absorbansi UV EMB, digunakan derivatisasi pra-kolom
dengan fenetil isosianat (PEIC). Derivatisasi parameter dioptimalkan dan hasilnya adalah: suhu,
25 ° C; waktu, 10 menit; dan rasio molar analit terhadap PEIC, 1: 6. Itu turunan secara efisien
dipisahkan menggunakan gradien fase gerak yang terdiri dari buffer asetonitril-fosfat (8 mM, pH
6,8) pada
laju aliran 1,0 ml / menit. Kuantifikasi konstituen dilakukan pada panjang gelombang 210 nm.
Metode ini divalidasi dengan hormat untuk linearitas, selektivitas, presisi, pemulihan,
reproduktifitas, batas deteksi (LOD), batas kuantifikasi (LOQ), dan stabilitas. Itu metode yang
baru diusulkan terbukti lebih sederhana, cepat, dan sensitif dibandingkan dengan metode yang
dilaporkan sebelumnya, dan setelahnya berlaku untuk penghitungan simultan dari empat
konstituen yang disebutkan di atas dalam 4-FDC (kombinasi dosis tetap) formulasi farmasi.

Alat, Bahan dan Metode

Percobaan kromatografi dilakukan dengan sistem HPLC yang terdiri dari dua pompa L-2130
(Hitachi, Jepang), L-2455 Diode Array Detector dipasang pada 210 nm (Hitachi, Jepang),
perangkat pengatur suhu dipertahankan pada 25 ° C. Akuisisi data tercapai dengan perangkat
lunak stasiun kerja D-2000 Elite. Manual injeksi dilakukan dengan 20 μL sample loop. Itu
Pemisahan HPLC dilakukan pada Phenomenex Kolom baja tahan karat Luna 5 μm C18 (250 × 4,6
mm ID) dengan kolom pelindung dengan fase diam yang sama.

Persiapan larutan standar

Larutan stok PYP, INH, RIF dan PEIC dibuat dengan melarutkan bahan acuan atau bahan kimia
yang ditimbang secara akurat dalam asetonitril untuk mendapatkan konsentrasi akhir masing-
masing 1,6 mg / ml, 0,48 mg / ml, 0,48 mg / ml dan 2,0 mg / ml. Larutan stok EMB (1,01 mg / ml)
disiapkan dalam asetonitril yang mengandung 1% TEA (untuk memungkinkan pelarutannya [21].
Standar campuran dibuat dengan mengencerkan lima mililiter dari setiap larutan stok (kecuali
PEIC) dalam labu ukur 50 ml dengan asetonitril hingga konsentrasi akhir 160 μg / ml PYP, 48 μg /
ml RIF, 48 μg / ml INH dan 101 μg / ml EMB (larutan kerja). Semua larutan yang disebutkan di
atas disimpan pada suhu 4 ° C sebelum digunakan.

Derivatisasi 4-FDC
Prosedur derivatisasi adalah sebagai berikut: setiap larutan kerja atau larutan sampel dan 0,37
ml PEIC 2 mg / ml ditambahkan ke dalam tabung reaksi, campuran tersebut dicampur selama 10
menit di tempat tidur ayun pada suhu 25 ° C dan setelah itu pelarut organik diuapkan di bawah
aliran nitrogen. Residu dilarutkan dengan 1 ml larutan pelarut (metanol: buffer fosfat (ν / ν)
75:25) dan 20 μl (disaring melalui 0,45 μm filter Millipore sebelum injeksi) diinjeksikan ke dalam
sistem HPLC.

Kondisi Kromatografi
Eksperimen yang melibatkan optimasi pemisahan adalah dilakukan dalam elusi gradien. Elusi
gradien adalah dilakukan dengan fase gerak asetonitril (A) dan buffer fosfat (B: 8 mM pH 6,8).
Profil gradien adalah (A: B) 10:90 (ν / ν) pada 0 menit, kemudian gradien linier menjadi
60:40 (ν / ν) selama 18 menit dan diizinkan untuk dipertahankan pada 60:40 (ν / ν) selama 6
menit. Komposisi pelarut dikembalikan ke 10:90 (ν / ν) selama 2 menit dan disetimbangkan
selama 2 menit lagi sebelum injeksi berikutnya. Di bawah kromatografi kondisi menggambarkan
waktu retensi untuk penurunan PYP, INH, RIF dan EMB adalah 4,65, 13,14, 18,01 dan 21,66
menit, masing-masing. Untuk menentukan optimal panjang gelombang analisis, spektrum
serapan dipindai dari 190 hingga 400 nm menggunakan sistem HPLC terhubung ke Diode Assay
Detector (Hitachi, Jepang) untuk empat analit setelah derivasi masing-masing. Itu empat
spektrum UV menunjukkan puncak serapan pada 210 nm kesamaan, oleh karena itu panjang
gelombang ini dipilih untuk analisis.

Analisis formulasi farmasi 4-FDC

Sepuluh tablet ditimbang untuk menentukan rata-ratanya berat tablet dan diarde secara
homogen hingga halus bubuk. Bubuk sesuai dengan 80 mg PYP, 24 mg INH, 24 mg RIF dan 50 mg
EMB ditimbang dan ditempatkan dalam labu ukur 50 ml dan diencerkan volume dengan
asetonitril (mengandung 1% TEA). Itu sampel di ultrasonikasi untuk larut dan kemudian disaring
melalui filter Millipore 0,45 μm untuk mendapatkan kejernihan solusi. Filtrat diencerkan dengan
asetonitril sebanyak 10 kali untuk derivatisasi berikutnya. Setelah derivatisasi, derivatif
ditentukan dengan menggunakan solusi standar sebagai referensi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Parameter validasi untuk metode yang dioptimalkan

Setelah pengembangan dan pengoptimalan file metodologi, beberapa parameter validasi,
seperti
linearitas, selektivitas, presisi, pemulihan, reproduktifitas, batas deteksi (LOD), batas kuantifikasi
(LOQ) dan stabilitas ditentukan. Pelarut tanpa gradien aktif diturunkan sebagai dijelaskan
sebelumnya. Tidak ada gangguan yang diamati. Kurva kalibrasi eksternal disiapkan untuk empat
orang konstituen dari pengenceran larutan kerja (n = 3). Rentang konsentrasinya adalah: PYP
dari 16,0–160 μg / ml, INH dari 4,8–48,0 μg / ml, RIF dari 4,8–48,0 μg / ml dan EMB dari 10,1–
101,0 μg / ml. Linier analisis regresi diperoleh dengan memplot luas puncak empat analit versus
konsentrasi menunjukkan sangat baik koefisien korelasi (koefisien korelasi lebih besar
dari 0,9998), dan data linieritas dilaporkan Tabel 1. Untuk solusi standar, inter- dan intra-day
RSD% untuk respon PYP, INH, RIF dan EMB berkisar antara 0,57% –1,86% dan 0,17% –0,98%
menunjukkan bahwa metode menyajikan presisi dan akurasi yang dapat diterima. Itu hasil RSD%
untuk reproduktifitas analisis berkisar dari 0,83% -0,95%, menunjukkan metode ini memiliki
kemampuan reproduksi yang baik. LOQ untuk PYR, INH, RIF dan EMB ditemukan menjadi 0,40,
0,24, 0,60, dan 0,30 μg / ml, bandingkan dengan 4,79, 2,50, 2,09, 9,65 μg / ml dilaporkan oleh
Faria AF [15], nilai-nilai ini dianggap cocok untuk formulasi farmasi. Pemulihan dulu dievaluasi
untuk sampel 4-FDC dalam tiga tingkat, secara keseluruhan hasil pemulihan rata-rata berada
dalam kisaran 99,16% –100,61%, dan metode ini dianggap akurat. Stabilitas uji PEIC-deriviated-
4FDC di bawah serangkaian penyimpanan waktu (dalam kasus cahaya) dioperasikan dengan
variasi area puncak berkisar antara 0,36% –1,01%, menunjukkan ketinggian stabilitas setidaknya
selama 24 jam di bawah suhu kamar. Ini Hasil menunjukkan bahwa tidak ada masalah yang
terkait dengan stabilitas diharapkan selama analisis rutin 4-FDC.

Analisis formulasi farmasi

Kuantifikasi dilakukan dengan cara prosedur standar eksternal. Tiga kelompok etambutol
hidroklorida, pirazinamid, rifampisin dan isoniazid tablet dianalisis dengan metode yang
dijelaskan seperti yang ditunjukkan di bagian 2.5. Untuk 4-FDC, kuantifikasi dengan eksternal
kalibrasi dilakukan dalam rangkap tiga, dan diperoleh hasil ditemukan sesuai dengan konten
yang diklaim untuk setiap analit (Tabel 2).

Kesimpulan
Ini adalah pertama kalinya menjelaskan metode kromatografi cair kinerja tinggi untuk simultan
penentuan PYP, INH, RIF, EMB · 2HCl setelah derivatisasi prakolom dengan fenetil isosianat
(PEIC). Respon UV dari EMB dihasilkan dan semuanya empat bahan dipisahkan dengan baik
dengan sensitivitas tinggi untuk kuantifikasi. Metode yang diusulkan menunjukkan rendah batas
deteksi (PYR, INH, RIF, EMB: 0,40, 0,24, 0,60, 0,30 μg / ml, masing-masing), pengulangan yang
baik (RSD%, 0,95) dan linearitas sangat baik （ r, 0,9998). Itu interaksi antara RIF dan INH
ditunda di kasus derivasi INH dengan PEIC, sehingga analit menunjukkan stabilitas tinggi selama
setidaknya 24 jam di bawah suhu kamar. Jelas, tawaran metode saat ini banyak keuntungan
menarik, sederhana dan cepat; peralatan analisis yang digunakan di sini cukup mendasar dan
sedang bagian integral dari hampir semua laboratorium analitik. Sebagai Hasilnya, metode ini
bisa digunakan secara simultan
deteksi dan kuantifikasi antituberkulosis 4-FDC konstituen dalam formulasi farmasi.