LEMBAR PENGESAHAN

Laporan lengkap praktikum Bioteknologi Dan Biologi Molekuler dengan

judul Ekstraksi DNA yang disusun oleh :

Nama : Ulil Ardi Syahdan

NIM : 15B13055
Kelas / :C
Kelompok :I

Telah selesai diperiksa dengan seksama oleh Asisten dan Asisten Koordinator,
maka dinyatakan diterima.

Makassar, Mei 2016

Koordinator Asisten, Asisten,

Reski Amelia Waji, S.Si., M.Pd A. Bida Purnamasari, S.Si., M.Kes

 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Asam nukleat merupakan elemen penting pada seluruh organisme yang
berperan mengatur seluruh aktivitas hidup. Perkembangan ilmu pengetahuan dan
teknologi juga tidak bisa lepas dari analisis tingkat molekuler yang melibatkan
asam nukleat (DNA). Analisis tingkat molekuler dengan DNA sebagai objeknya
diawali dengan proses ektraksi DNA untuk mendapatkan DNA yang murni
dengan konsentrasi tinggi sehingga dapat digunakan untuk analisis molekuler
selanjutnya, seperti PCR, RLFP, dan RAPD. DNA adalah rantai polinukleotida
yang merupakan tempat ditemukan nya gen itu sendiri. DNA di dalam suatu sel
dapat diekstraksi atau diisolasi. Tujuan isolasi DNA adalah untuk memisahkan
DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, baik
konvensional maupun menggunakan kit. Ekstraksi DNA secara konvensional bisa
dilakukan antara lain dengan metode CTAB/NaCl. Isolasi DNA/RNA merupakan
langkah awal yang harus dikerjakan dalam proses rekayasa genetika sebelum
melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari
jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga
akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri DNA, RNA dan substansi dasar lainnya.
Ekstrak sel kemudian dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung
DNA/RNA total. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein,
serta pemurnian DNA).
Begitu pentingnya pengetahuan tentang ekstraksi/ isolasi DNA, sehingga
menjadi suatu kewajiban bagi mahasiswa jurusan biologi untuk mempelajarinya
Berdasarkan pemaparan diatas, maka pada praktikum kali ini akan dilakukan
ekstraksi DNA pada kultur cair actinomycetes yang berumur 7 hari dengan
metode Joo-Won-Sun 2004.
B. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui cara
melakukan ekstraksi DNA pada mikroba (actinomycetes).

C. Manfaat Praktikum
Setelah melakukan praktikum, mahasiswa dapat terampil dan mengetahui
bagaimana cara melakukan ekstraksi DNA pada mikroba serta dapat
mengaplikasikan teori yang telah didapatkan pada pembelajaran dan dalam
kehidupan sehari-hari.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Pembuktian bahwa DNA merupakan bahan genetik pertama kali

dilakukan oleh Frederick Griffith pada tahun 1928 yaitu dengan eksperimen
transformasi pada bakteri Streptococcus pneumoniae. Bukti bahwa DNA
merupakan bahan yang menyebabkan terjadinya proses transformasi pada S.
pneumoniae ditunjukkan oleh eksperimen yang dialkukan oleh Oswald Avery,
Colin MacLeod, dan Mackyn McCarty pada tahun 1944. Mereka melakukan
ekstraksi terhadap sel virulen dan kemudian menghilangkan proteinnya. Ketika
ekstrak sel tersebut diperlakukan dengan enzim deoksiribonukleat yang
menghancurkan DNA, ternyata kemampuan menyebabkan proses transformasi
menjadi hilang (Yuwono, 2008).
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan
pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan
bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari
materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi
kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan
(Suryo, 2010).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan
pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin
dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki
struktur cincin ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin
(T) yang memiliki struktur cincin tunggal. Ketika guanin berikatan dengan sitosin,
maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika adenin berikatan
dengan timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen
pembangun (building block). DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat
dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Faatih, 2009).
Ekstraksi DNA merupakan prosedur rutin dalam analisis molekuler.
Masalah-masalah dalam ekstraksi DNA masih merupakan hal penting yang perlu
diatasi. Jumlah dan kualitas DNA hasil ekstraksi bervariasi tergantung dari spesies
tanaman sehingga mempengaruhi analisis lebih lanjut seperti hibridisasi DNA,
pemotongan DNA dengan enzim restriksi maupun analisis dengan polymerase
chain reaction (PCR) (Pharmawati, 2009).
Proses pengeluaran DNA dari nucleus, mitokondria maupun organel lain
dengan cara diekstraksi atau dilisiskan biasanya dilakukan dengan homogenasi
dengan penambahan dufer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegan DNA rusak.
Pada kondisi sampel tertentu, untuk membantu lisis dari membran
sel/nucleus/organel atau juga dinding sel, maka sampel daun dimasukkan dudu ke
nitrogen cair dan langsung digerus sebelum ditambahkan buffer ekstraksi.
Senyawa yang biasa digunakan untuk memaksimalkan hasil isolate DNA yang
murni ditambahkan yaitu fenol, kloroform, dan isoamil alkohol (Fatchiyah dkk,
2011).
Banyak strategi yang digunakan untuk ekstraksi DNA dari sel bakteri,
seperti enzimatik, kimiawi atau termal lisis, dan gangguan mekanik pada dinding
sel. Variasi dalam efisiensi lisis dan fundamental DNA dapat mempengaruhi
keberhasilan analisis DNA dengan metode seperti PCR. Setiap pendekatan
kerusakan sel memiliki kelebihan dan kekurangan tertentu. Metode kimia
menggunakan deterjen untuk melarutkan membran sel seperti SDS, Triton X-100,
dan CTAB (Ahmed dkk, 2014).
Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, baik
konvensional maupun menggunakan kit. Ekstraksi DNA secara konvensional bisa
dilakukan antara lain dengan metode CTAB/NaCl, metode SDS, dan metode fenol
kloroform. Seiring perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, ektraksi DNA
dapat dilakukan menggunakan kit dari berbagai merk (Fitriya dkk, 2015).
 Ketersediaan DNA genomik (gDNA) dari mikroorganisme diperlukan
untuk kloning gen dan memilih konstruksi rekombinan, dan untuk taksonomi dan
diagnostik. Metode sebelumnya untuk gDNA ekstraksi dari bakteri atau jamur
memerlukan waktu lama untuk menyelesaikan. Metode ini termasuk
menggunakan SDS / CTAB / proteinase K, SDS lisis, lisozim / SDS, lisozim /
SDS / proteinase K, bead-vortexing / SDS, dan lisis mekanik menggunakan
kecepatan tinggi pada disrupsi sel. Meskipun metode ini cocok untuk ekstraksi
DNA pada bakteri atau jamur, namun masih memiliki kelemahan termasuk
manipulasi yang lama, seperti perubahan 4-6 microcentrifuge, inkubasi, curah
hujan, elusi atau mencuci dan langkah pengeringan atau bahkan peralatan khusus
(Cheng dan Jiang, 2006).
Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan
menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu
sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel)
keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian perlakuan
sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Isolasi DNA yang dilakukan dalam
penelitian ini menurut standar prosedur yang sudah biasa dilaksanakan.
Homogenisasi sel dengan prosedur ini akan menghasilkan DNA utuh karena
proses ini menyebabkan disrupsi sel dan tercucinya komponen-komponen sel lain
selain DNA. Penambahan kloroform setelah sentrifugasi memisahkan larutan
menjadi fase cair dan padat dimana fase cair merupakan DNA dan fase padat
adalah campuran protein dan DNA (Faatih, 2009).
 BAB III
METODE PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

Hari / tanggal : Rabu / 04 Mei 2016
Waktu : Pukul 08.00 sampai selesai.
Tempat : Laboratorium Biologi Lantai II Barat Jurusan Biologi
FMIPA UNM

B. Alat dan Bahan

1. Alat
Adapun alat yang digunakan, yaitu:
a. Sentrifuge
b. Tube
c. Mortar
d. Mikropipet + tips (semua ukuran)
e. Stopwatch
2. Bahan
Adapun bahan yang digunakan, yaitu:
a. Kultur cair actyno
b. Pasir steril
c. TE buffer
d. SDS 10%
e. Proteinase K
f. NaCl 5 M
g. Kloroform dingin
h. Propanol
i. Etanol 70% dingin
j. Tissue
C. Prosedur kerja
1. Memasukkan 1 ml kultur cair actyno umur 7 hari pada tube steril.
2. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit.
3. Membuang supernatan, memasukkan peletnya ke dalam mortar steril dan
menambahkan pasir steril secukupnya kemudian digerus.
4. Menambahkan 2 ml TE buffer, kemudian digerus.
5. Memasukkan 1 ml ke dalam tube steril, lalu disentrifuge dengan kecepatan
5000 rpm selama 10 menit.
6. Mengambil 400 µl supernatan, menambahkan 50 ml SDS 10% dan
proteinase K 20 ml.
7. Menginkubasi dan menginversi selama 10 menit.
8. Menambahkan 167 µl NaCl 5 M.
9. Menambahkan 400 µl kloroform dingin.
10. Menginkubasi pada suhu ruangan selama 30 menit (menginversi tiap 10
menit).
11. Sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit.
12. Memindahkan ke tube baru sebanyak 200 µl, menambahkan 150 propanol/
2 propanol sebanyak 200 µl.
13. Menghomogenkan dengan cara menginversi sebanyak 50x.
14. Sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit.
15. Mengambil pelet, membuang supernatan.
16. Menambahkan 100 µl etanol 70% dingin.
17. Spin 1000 rpm selama 2 menit, membuang etanol.
18. Mengeringanginkan peletnya, menambahkan 20-50 µl TE (resuspensi)
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan
Hasil ekstraksi DNA pada actinomycetes

Kelas C

B. Pembahasan
Berdasarkan hasil praktikum tidak diperolehnya pelet pada tahapan ke-14
di langka kerja menyebabkan praktikum ini tidak dapat dilanjutkan ke tahapan
selanjutnya. Hasil ekstraksi DNA yang diperoleh tidak memiliki pelet, melainkan
hanya berupa supernatan. Hal ini ddapat disimpulkan bahwa pada praktikum
tersebut praktikan tidak mendapatkan DNA murni.
Ada banyak faktor yang menyebabkan gagal nya praktikum tersebut
diantaranya: 1) Proses pengerjaan yang tidak berada pada kondisi akseptik,
sehingga dimungkinkan terjadinya kontaminan DNA lain. 2) Adanya proses
pengerjaan yang tidak sesuai dengan langkah kerja yang seharusnya. Misalnya
pada tahapan ke-6 pasca penambahan 50 ml SDS 10% dan proteinase K 20 ml
seharusnya tube diingkubasi selama 2 jam pada suhu 65 0C, namun pada proses
nya hanya diingkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan. 3) Tahapan lain yang
tidak sesuai adalah seharusnya setelah di inversi sebanyak 50x seharusnya di
overnight -200C (-800C ± 1 jam), namun tahap ini tidak dilakukan sama sekali
langsung ke tahap berikutnya yaitu disentrifuge sehingga peluang gagalnya
praktikum ini semakin besar.
Prosedur yang tidak sesuai dengan langkah kerja yang seharusnya
disebabkan adanya keterbatasan waktu praktikum di laboratorium. Oleh sebab itu,
pada praktikum kali ini hanya lebih ditekankan bagaimana mengenal alat-alat dan
bahan untuk ekstraksi DNA serta bagaimana prinsip kerjanya.
Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel
(lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA. Melalui proses tersebut DNA dipisahkan dari komponen seluler
lain seperti protein, RNA (Riboksi nukleat acid), dan lemak. Banyak metode yang
digunakan untuk mengisolasi DNA, tergantung specimen yang akan dideteksi.
Metode tersebut pada dasarnya memiliki prinsip yang sama, namun ada beberapa
hal tertentu yang biasanya digunakan modifikasi untuk dapat menghancurkan
inhibitor yang ada di dalam masing-masing sumber specimen (Langga dkk, 2012).
 BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan maka dapat disimpulkan
bahwa prinsip kerja dari ekstraksi DNA terdiri atas preparasi sel/jaringan, lisis
membran sel/organella (nukleus), denaturasi senyawa organik, presipitasi DNA,
dan pencucian/washing. Namun, pada praktikum kali ini tidak diperoleh DNA
murni karena dalam pelaksanaannya ada beberapa prosedur kerja yang tidak
dilakukan. Jadi yang diperoleh hanya berupa supernatan, tidak ada pelet.

B. Saran
1. Diharapkan kepada praktikan agar lebih bersih atau dalam keadaan steril
ketika melakukan praktikum.
2. Diharapkan kepada asisten sebaiknya lebih memberikan pengarahan dan
penjelasan agar praktikum dapat berjalan lancar.
3. Sebaiknya kepada laboran bahan dan alat untuk praktikum sebaiknya
ditambah jumlahnya agar tiap kelompok bisa melaksanakan praktikum tanpa
harus bergantian.
 DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, Omar dkk. 2014. Comparison of three DNA extraction methods for
polymerase chain reaction (PCR) analysis of bacterial genomic DNA.
African Journal of Microbiology Research Vol. 8 (6), pp. 598-602.

Cheng, H. Rong & Jiang, Ning. 2006. Extremely rapid extraction of DNA from
bacteria and yeasts. Biotechnology Letters (2006) 28: 55–59.

Faatih, Mukhlissul. 2009. Isolasi Dan Digesti Dna Kromosom. Jurnal Penelitian
Sains & Teknologi, Vol. 10, No. 1, 2009: 61 - 67.

Fatchiyah, dkk. 2011. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.

Fitriya, R Tyas dkk. 2015. Keefektifan Metode Isolasi DNA Kit dan CTAB/NaCl
yang Dimodifikasi pada Staphylococcus aureus dan Shigella dysentriae.
LenteraBio Vol. 4 No. 1, Januari 2015: 87–92.

Langga, I. Fajarwati. 2012. Optimalisasi Suhu Dan Lama Inkubasi Dalam

Ekstraksi Dna Tanaman Bitti (Vitex Cofassus Reinw) Serta Analisis
Keragaman Genetik Dengan Teknik RAPD-PCR. J. Sains & Teknologi,
Desember 2012, Vol.12 No.3 : 265 – 276.

Pharmawati, Made. 2009. Optimalisasi Ekstraksi Dna Dan Pcr-Rapd Pada

Grevillea spp. (Proteaceae). Jurnal Biologi XIII (1) : 12 -16.

Suryo. 2010. Genetika Manusia. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.

Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.