TOPIK 1.

PEMBUATAN MEDIA KULTUR JARINGAN TANAMAN

Pendahuluan
Kultur jaringan tanaman adalah suatu teknik yang menumbuhkan sel, organ, dan
jaringan secara aseptik dalam suatu media tanam, untuk dapat tumbuh dan berkembang
membentuk tanaman utuh yang disebut planlet. Media tempat sel, organ, dan jaringan tersebut
tumbuh sangat penting artinya dalam kultur jaringan karena seluruh hara dan zat pengatur
tumbuh yang diperlukan untuk tumbuh dan berkembang diperoleh dari media. Media
menyediakan hara makro, mikro, karbohidrat, vitamin, asam amino tertentu, dan zat pengatur
tumbuh. Dalam kultur jaringan dikenal berbagai komposisi medium yang telah diteliti sesuai
untuk pertumbuhan untuk tanaman tertentu atau untuk tujuan tertentu misalnya untuk
menginduksi pertumbuhan kalus, tunas atau akar atau untuk kultur antera. Contohnya
komposisi medium MS (Murashige dan Skoog) yang telah banyak digunakan untuk
perbanyakan berbagai jenis tanaman baik tanaman berkayu, tanaman herba, dan untuk berbagai
spesies tanaman. Komposisi media VW (Vacin and Went) baik untuk tanaman anggrek, WPM
(Woody Plant Medium) untuk kultur tanaman berkayu dan lain-lainnya.
Dalam medium kultur jaringan sering digunakan senyawa organik sebagai sumber
vitamin, zat pengatur tumbuh, atau asam amino yang berharga murah jika dibandingkan dengan
harga bahan sintetiknya. Contohnya air kelapa, ekstrak buah pisang, tomat dll. Ekstrak dari
buah-buahan ini memiliki kelemahan karena konsentrasi vitamin, mineral dan zat pengatur
tumbuh yang dikandungnya sangat bervariasi tergantung pada dimana tanaman itu tumbuh,
cara budidayanya, varietas tanaman, dan umur buah.
Disamping itu medium kultur jaringan juga sering ditambahkan senyawa lain untuk
tujuan tertentu seperti arang aktif, PVP (Poly Vinyl Pyrolidon) yang digunakan sebagai
pengabsorpsi senyawa phenolik yang dapat bersifat toksik bagi sel tanaman. Senyawa ini
umumnya dihasilkan oleh tanaman berkayu dan dikeluarkan ke medium bila jaringan tersebut
ditumbuhkan. Senyawa pengabsorpsi ini sering kali juga mengabsorpsi zat pengatur tumbuh
yang ada pada media sehingga tidak tersedia bagi jaringan.
Dalam pembuatan media kultur jaringan, bahan-bahan yang diperlakukan sudah dibuat
larutan stoknya untuk memudahkan dalam bekerja. Larutan stok tersebut konsentrasinya sudah
dipekatkan antara 20 sampai 50 kali, sehingga dalam membuat media hanya mengambil
sejumlah volume yang diperlukan. Sebagai sumber karbohidrat digunakan sukrosa (atau gula
pasir), glukosa atau fruktosa sesuai dengan spesies tanaman yang akan ditumbuhkan, namun
umumnya menggunakan sukrosa. Sebagai bahan pemadat digunakan agar-agar sebanyak 7 g/l.
Kemasan media (pH) media umumnya antara 5.6-5.9. Sterilisasi media dilakukan dengan
menggunakan autoclave yaitu suatu alat yang dapat membunuh organisme dalam medium
dengan suhu tinggi yaitu 121 0C, tekanan 17,5 psi (atau sekitar 1.1 atm), selama 20 menit. Pada
praktikum kali ini kita melakukan pembuatan media MS sebanyak 500 ml.

Bahan
Larutan stok seperti tercantum dalam Tabel 1, gula, agar-agar, plastik penutup, aquades,
karet gelang. Alat yang diperlukan adalah labu takar dan botol kultur.
Cara Pembuatan Media
1. Pipet larutan stok seperti tercantum dalam Tabel 1 dan masukkan ke dalam labu takar
2. Larutan gula dengan menambahkan akuades sebanyak 50 ml dan campurkan dengan
larutan stok yang telah dipipet
3. Tambahkan ke dalam larutan tadi aquades sampai mencapai mendekati 500 ml
4. Tera pH media dengan menambahkan HCl 1N atau KOH 1N sampai mencapai 5.9
5. Masukkan media ke dalam panci dan tambahkan agar sebanyak 3.5 g lalu masak hingga
mendidih
6. Masukkan media ke dalam botol kultur sebanyak 25 ml dan tutup botol dengan plastik lalu
diikat dengan karet gelang. Beri kode pada plastik dan kode kelompok dengan huruf yang
kecil. Sterilkan media dengan autoclave selama 20 menit. Media yang telah steril disimpan
di ruang kultur pada suhu 20 0C

Pengamatan
Jumlah media yang terkontaminasi, dan apa organisme kontaminannya.

Tabel 1. Komposisi Media Murashige-Skoog (1962)

Konsentrasi Volume yang Konsentrasi

Stok Bahan larutan Stok dipipet (ml/liter dalam media
(g/L) media) (mg/L)
A NH4NO3 82,5 20 1650
B KNO3 95 20 1900
C KH2PO4 34 170
H3BO3 1,240 6,2
Na2MoO4.2H2O 0,050 5 0,25
CoCl2.H2O 0,005 0,025
Kl 0,166 0,83
D CoCl2.H2O 88 5 440
E MgSO4.7H2O 74 370
MnSO4.4H2O 4,460 22,3
5
ZnSO4.7H2O 1,720 8,6
CuSO4.5H2O 0,005 0,025
F Na2EDTA 3,730 37,3
10
FeSO4.7H2O 2,780 27,8
VIT Thiamine 0,010 0,1
Niacin 0,050 0,5
10
Pyridoxine 0,050 0,5
Glycin 0,200 2
Myo Myo Inositol 10 10 100
Gula Gula Pasir 30 30 000
Skema Pembuatan Media dengan Media Dasar MS (1 liter)

Larutkan 30 gram gula ke dalam 50 ml aquadestilata

Masukkan ke dalam labu takar volume 1 liter

Tambahkan larutan stok A dan B masing-masing 20 ml

Tambahkan larutan stok C, stok D, dan stok E masing-masing 5 ml

Tambahkan larutan stok F, Myo dan Vitamin masing-masing 10 ml

Tambahkan aguadestilata hingga volumenya ± 999 ml

pH media diatur sesuai keperluan dengan menambahkan KOH 1N atau HCl 1 N

Tambahkan 7-8 gram agar-agar

Panaskan media sampai agar-agar larut (sambil diaduk)

Tuangkan media ke dalam botol kultur steril

Autoklaff selama 20 menit pada suku 121 0C dengan tekanan 17,5 psi

Sterilisasi Botol Kultur

Botol kultur setelah dicuci bersih dengan sabun cair, dimasukkan ke dalam autoklaf
dalam posisi terbalik. Jika menggunakan autoklaf listrik otomatis dilakukan selama 1 jam pada
suhu 121 0C tekanan 17,5 psi dengan mengatur timer, suhu, dan tekanan pada alat
Jika menggunakan autoklaf manual dengan pemanasan kompor gas, dipanaskan
terlebih dahulu sampai mendidih, kemudian tombol pengeluaran uap ditutup dan pemanasan
dibiarkan hingga tekanan naik mencapai 17.5 psi dan api kompor dikecilkan untuk
mempertahankan tekanan 17.5 psi selama 60 menit.

Pembuatan Larutan stok Zat Pengatur Tumbuh

Zat pengatur tumbuh ( sering disingkat dengan ZPT) sangat penting di dalam kultur
jaringan tanaman. Jenis ZPT yang paling sering digunakan adalah dari kelompok Auksin (
seperti NAA, IAA, 2,4D, IBA ) dan kelompok sitokinin ( seperti Kinetin, BAP, 2iP dll). ZPT
yang bersifat asam maka harus dilarutkan dengan pelarut basa seperti KOH 1N atau NaOH 1N.
Jika ZPT tersebut bersifat basa maka dilarutkan dengan HCl 1N.
Satuan yang umum digunakan untuk menunjukkan konsentrasi ZPT adalah ppm (part
per million) atau satuan Molar.
Contoh 1: Membuat larutan stok NAA (Naphthalene Acetic Acid) dengan konsentrasi
1000 ppm. Ditimbang 1000 mg NAA atau 1g NAA lalu dilarutkan dengan
KOH 1N sebanyak kurang lebih 5 ml lalu dikocok sampai seluruhnya
 terlarut. Selanjutnya ditambahkan akuades steril sampai volume totalnya
menjadi 1liter.
Contoh 2. Membuat larutan konsentrasi NAA 1mikro molar (1 µM). Bobot molekul
(BM) dari NAA adalah 186.2066 g/mol.
1 Molar =1 000 000 µM
Jadi untuk membuat NAA 1M yang harus ditimbang 186,2066 g
dilarutkan kedalam 1 liter akuades
Jadi untuk membuat 1 µM NAA maka bobot yang harus ditimbang adalah
sebanyak 186,2066/ 1 000 000= 0.0001862066 g atau 186,2066 µg atau
0.1862066 mg dan dilarutkan ke dalam 1 liter akuades.
Contoh 3. Jika akan dibuat 1 liter media dengan konsentrasi 2,5 ppm NAA, dan larutan
stok NAA yang tersedia adalah 1000 ppm. Berapa volume larutan stok
NAA yang harus diambil?
Rumus yang dapat digunakan adalah: C1V1=C2V2
C1 adalah konsentrasi bahan pada larutan stok
V1 adalah volume larutan stok yang harus diambil
C2 adalah konsentrasi bahan pada larutan yang akan dibuat
V2 adalah volume larutan yang akan dibuat

1000 ppm x V1 = 1 l x 2,5 ppm

V1= 1 liter x 2,5 ppm/1000 ppm
V1= 2,5 liter / 1000
= 0.0025 liter atau 2,5 ml NAA
Jadi volume NAA yang harus diambil dari larutan stok adalah sebanyak
2,5 ml dan dilarutkan ke media sehingga menjadi 1 liter media
Tabel 2. Komposisi beberapa media dasar untuk keperluan Kultur Jaringan Tanaman
Vacin & Knudson Knudson Schenk &
MS Knop Nitsch&Nitsch B5 N6 White
Bahan Kimia Went C C MM Hildebrant
(mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)
(mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)
(NH4)2SO4 - - - 134 463 - 500 500 500 -
NH4NO3 1650 - 720 - - - - - 500 -
NH4H2PO4 - - - - - - - - - 300
NaNO3 - - - - - - - - - -
KNO3 1900 250 950 2500 2830 80 525 2500
Ca(NO3)2 - - - - - - - 1000 241,3 -
Ca(NO3)2.4H2O - 1000 - - - 300 - - - -
CaCl2.2H2O 440 - 166 150 166 - - - - 200
Ca3(PO4)2 - - - - - 200 - - -
MgSO4.7H2O 370 250 185 250 185 720 - 250 - 400
MgSO4 - - - - - - - - 122,15 -
Na2SO4 - - - - - 200 250 - - -
KH2PO4 170 250 68 400 - - 250 250 -
NaH2PO4.H2O - - - 150 - 16,5 250 - - -
KCL - - - - - 65 - - 250 -
FeSO4.7H2O 27,8 - 27,8 27,8 - - - 27,8 25 15
Na2EDTA 37,3 - 37,3 37,3 - - - 37,8 - 20
Fe3tartrat - - - - - - 28 - - -
FeCl3.6H2O - - - - - - - - - -
Fe2(SO4)3 - - - - - - - - - -
MnSO4.4H2O 22,3 - - - - - 7,5 - - 10
MnSO4.H2O - - 10,0 10,0 - - - - 5,68
ZnSO4.7H2O 8,6 - 2,0 2,0 - - - - - 1
H3BO3 6,2 - 10,0 3,0 - - - - - 5
Kl 0,83 - - 0,75 - - - - - 1
Na2MoO4.2H2O 0,25 - 0,25 0,25 - - - - - 0,1
CuSO4.5H2O 0,025 - 0,025 0,025 - - - - - 0,2
 Vacin & Knudson Knudson Schenk &
MS Knop Nitsch&Nitsch B5 N6 White
Bahan Kimia Went C C MM Hildebrant
(mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)
(mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)
CoCl2.6H2O 0,025 - - 0,025 - - - - - 0,1
NiCl2.6H2O - - - - - - - - - -
AlCl3 - - - - - - - - - -
Biotin - - 0,05 - - - - - - -
Myo Inositol 100 - 100 100 - - - - - 1000
Niacin 0,5 - 5,0 1,0 0,5 0,5 - - - 5
Pyridoxine 0,5 - 0,5 1,0 0,5 0,1 - - - 0,5
Thiamine 0,1 - 0,5 10,0 1,0 0,1 - - - 5
Glycin 2,0 - 2,0 - 2,0 3,0 - - - -
Folid acid - - 0,5 - - - - - - -
Ca D-
- - - - - 1,0 - - - -
pantothenat
Air kelapa - - - - - - 100 100 -
Gula Pasir 30 gram - 20 gram 20 gram 50 gram 20 gram 20 gram 20 gram - 25 gram
Keterangan : Knudson C MM = Knudson C Morel Modification