Topik 3.

STERILISASI ORGAN DAN JARINGAN TANAMAN

Ni Made Armini Wiendi

A. Pendahuluan
Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan yang akan
ditanam pada media kultur jaringan harus bebas dari mikroorganisme lain,
seperti bakteri, cendawan, virus dan mikoplasma. Organisme tersebut bisa yang
ada di permukaan organ dan jaringan, bisa berada di dalam jaringan.
Mikroorganisme yang dapat menjadi sumber kontaminan dapat merupakan
organisme patogenik atau non patogenik. Di dalam media kultur jaringan,
mikroorganisme ini akan berkembang jauh lebih cepat dibandingkan sel dari
jaringan tanaman yang ditumbuhkan, sehingga dapat menyebabkan sel dari
jaringan tanaman akan mati. Kematian dapat disebabkan karena
mikroorganisme mengeluarkan senyawa yang bersifat toksik bagi sel tanaman,
atau karena terjadi persaingan hara dan tempat. Bila menggunakan bagian
tanaman dari lapang atau greenhouse sudah pasti mengandung mikroorganisme
baik yang bersifat patogenik maupun yang non patogenik, sehingga harus
dilakukan sterilisasi yaitu tahap mengeliminasi mikroorganisme yang ada di luar
jaringan tanaman atau yang ada di dalam ruang antar sel. Tahap sterilisasi
bahan tanaman ini merupakan tahapan awal yang penting didalam seluruh
proses kegiatan kultur jaringan tanaman dan dapat menjadi topik penelitian
tersendiri.
Proses sterilisasi jaringan atau organ tanaman akan memiliki tingkat
kesulitan yang berbeda ditentukan oleh asal tanaman induk, jenis organ dan
jaringan yang akan disterilisasi, serta umur jaringan yang akan digunakan.
1. Tanaman induk yang akan digunakan haruslah dari varietas unggul, sehat,
subur, dan pada kondisi pertumbuhan vegetatif yang dominan. Tanaman
tahunan yang berkayu seperti mangga atau rambutan, dapat diambil jaringan
yang masih muda yaitu jaringan meristematik apikal maupun aksilar dari cabang
yang baru bertunas, atau dari buah immature (buah yang masih muda). Cara
untuk mendapatkan jaringan yang meristematik pada tanaman yang sudah tua,

1
dapat dilakukan dengan memangkas tanaman terlebih dahulu dan membiarkan
hingga terbentuk tunas-tunas baru sebagai sumber eksplan.
2. Jaringan atau organ yang akan digunakan akan membedakan metode
sterilisasinya. Organ yang ada di atas permukaan tanah (daun, batang, pucuk,
benih, bunga) akan memiliki kandungan mikroorganisme yang lebih sedikit
dibandingkan organ yang ada di dalam tanah, seperti umbi, akar, rizhome.
Jaringan yang muda akan memiliki sel yang memiliki kemampuan berproliferasi
dan berkembang lebih baik karena memiliki sifat yang meristematic, namun lebih
mudah mengalami kematian saat dilakukan proses sterilisasi. Sel yang
mengalami kematian saat proses sterilisasi akibat terjadi plasmolisis sel atau
degradasi kroloplas yang ditandai oleh perubahan warna dari organ menjadi
putih transparan.
Pada proses sterilisasi bagian tanaman (organ atau jaringan) digunakan
bahan-bahan kimia yang bersifat toksik baik bagi sel tanaman maupun
mikroorganisme yang ada pada bahan tanaman tersebut. Jika konsentrasi
bahan kimia yang digunakan terlampau tinggi maka dapat mematikan baik sel
tanaman maupun mikroorganismenya. Jadi pada tahap ini harus dapat
menghasilkan jaringan tanaman yang aseptik namun sel-selnya tetap hidup.
Beberapa bahan kimia yang dapat digunakan dalam proses sterilisasi bagian
tanaman antara lain: Alkohol 70%, sodium hypochlorite (NaClO) 0.05-2.625 %,
Calsium hypochlorite(Ca(ClO)2, H2O2, HgCl2 0.01 -0.05% (w/v), diterjen,
beberapa fungisida seperti Dithane M-45 (dengan bahan aktif: Mankozeb 80%),
Benlate (bahan aktif: Streptomisin 20%), dan bakterisida seperti agrimicyn,
clorampenicol, dan cefotaxime.
Bahan lain yang juga sering ditambahkan ke dalam larutan sterilan adalah
Tween 20 atau Tween 80 dengan konsentrasi 0.08 -0.12% untuk menurunkan
tegangan permukaan larutan sterilan sehingga kontak dengan eksplan lebih baik.
Senyawa ini ditambahkan bila organ dan jaringan tanaman yang akan
disterilisasi memiliki permukaan yang berbulu atau sering disebut trikomata atau
trichome pada epidermis atas daun maupun pada batang, atau lapisan lilin

2
(yang mengandung asam lemak rantai panjang) yang cukup tebal pada
epidermis daun membentuk lapisan kutikula.
Pada percobaan ini ditujukan untuk melatih mahasiswa melakukan
sterilisasi bagian tanaman dari lapang yang akan digunakan sebagai eksplan.

B. Bahan tanaman
Bahan tanaman yang digunakan adalah:
• Umbi (bulb) dari umbi bawang merah dan bawang putih

• Benih berbagai tanaman sayuran, tanaman hias, tanaman kehutanan

seperti Acasia sp dan Sengon yang mengandung embryo zygotik dan
nuselus

C. Bahan untuk sterilisasi tanaman

Benlate atau Dithane M-45 (fungisida), Agrept (bakterisida), Ditergen,
Alkohol 96% dan 70%, Natrium hipoclorit dari Clorox(konsentrasi bahan aktifnya:
5.25%) dengan konsentrasi 0.525% dan 2.625%, air steril. Bahan penunjang
lain adalah kertas tissue.

D. Media Tanam
Media untuk penanaman eksplan hasil sterilisasi adalah media MS0
(media dari komposisi Murashige and Skoog, tanpa zat pengatur tumbuh)

E. Alat Tanam
Alat- alat tanam yang digunakan dalam percobaan ini adalah: petridish,
scalpel, pinset lurus dan bayonet, serta gunting. Alat-alat lain yang diperlukan
adalah :lampu bunsen, dan handsprayer yang telah diisi dengan alkohol 70%.

3
 F. Cara Kerja
Sterilisasi benih
1. Cuci benih dengan air , selanjutnya dicuci dengan larutan ditergen guna
menghilangkan kotoran yang menempel dibagian permukaan jaringan.
Pekerjaan ini dilakukan diluar Laminar Air Flow Cabinet.
2. Bilas benih tadi dengan aquades steril atau air steril, dan selanjutnya
direndam dalam air panas suhu 30oC . Setelah air menjadi dingin lalu
ditambahkan Dithane M-45 dan Agrept dengan konsentrasi masing-masing
4 g/l, direndam semalam. (kurang lebih 12-14 jam).
3. Larutan pestisida dari rendaman tadi dibuang, selanjutnya benih dimasukkan
ke dalam laminar air flow cabinet.
4. Bilas bahan tanaman tadi dengan aquades steril, kemudian direndam dalam
larutan NaClO 1,575% selama 30 menit. Setelah 30 menit larutan NaClO
dibuang.
5. Benih kemudian direndam dalam larutan NaClO 0.525% selama 10 menit.
6. Benih selanjutnya dikeluarkan dari larutan sterilan dan dikeringkan anginkan
dalam petridish, lalu ditanam di media MS0, 10 benih per botol
7. Setiap kultur diberi nama tanaman yang dikulturkan dan tanggal tanam
selanjutnya disimpan di ruang kultur dan diamati. Kondisi ruang simpan
dengan intensitas cahaya 1000 -1300 lux, 16 jam/hari, suhu 23 + 2oC.

Sterilisasi Organ tanaman Umbi bawang putih dan bawang merah)

1. Organ yang akan disterilisasi adalah umbi bawang putih dan bawang merah.
Umbi terlebih dahulu dikupas kulitnya, untuk umbi bawang merah dikupas
kulit dan 2 lapisan umbi terluar.
2. Cuci benih dengan air , selanjutnya dicuci dengan larutan diterjen guna
menghilangkan kotoran yang menempel dibagian permukaan jaringan.
Pekerjaan ini dilakukan diluar laminar.
3. Bilas umbi tadi dengan air atau aquades steril, dan selanjutnya direndam
dalam larutan Dithane M-45 dan Agrept dengan konsentrasi masing-masing
4 g/l, direndam 3 jam

4
4. Larutan pestisida dari rendaman tadi dibuang, selanjutnya umbi dimasukkan
ke dalam laminar air flow cabinet (LAFC) . Sebelum bekerja di dalam LAFC
terlebih dahulu disterilkan dengan menyalakan lampu UV selama 30 menit,
selanjutnya di semprot dengan alkohol 70%.
5. Umbi bawang merah dipotong setengah secara horizontal. Bagian umbi yang
membawa bagian batang (basal plate) yang akan digunakan sebagai
eksplan, sisanya dibuang. Umbi bawang putih juga dipotong setengah,yang
digunakan adalah yang membawa basal plate yang membawa tunas
vegetatif. Kedua bagian umbi ini kemudian direndam dalam larutan NaClO
2.625% selama 20 menit.
6. Selanjutnya dikeluarkan dari larutan sterilan, umbi bawang merah dikupas 1
lapis umbinya, sedangkan umbi bawang putih dibuang daging yang
membungkus tunas vegetatifnya, lalu direndam dalam larutan NaClO 0.525%
selama 10 menit.
7. Setelah itu umbi dikeringkan anginkan dalam petridish, lalu ditanam di media
MS0, 5 eksplan per botol.
8. Setiap kultur diberi nama tanaman yang dikulturkan dan tanggal tanam,
selanjutnya disimpan di ruang kultur dan diamati. Kondisi ruang simpan
dengan intensitas cahaya 1000 -1300 lux, 16 jam/hari, suhu 23 + 2oC.

G. Pengamatan
Pengamatan dilakukan setiap minggu pada peubah:
1. Jumlah eksplan yang aseptik
2. Awal terbentuk kecambah, tunas, atau kalus
3. Jumlah eksplan yang membentuk tunas atau kalus
4. Jumlah tunas yang dihasilkan per eksplan.
5. Jumlah kecambah yang mengalami proliferasi