Dengue IgM

Tes ELISA untuk deteksi antibodi IgM virus dengue pada serum manusia.
 Pendahuluan
Virus Dengue yang Dimaksudkan, anggota Flaviviridae, dilapisi virus RNA untai
tunggal. Keempat serotipe (DEN 1-4) terkait erat, tetapi berbeda secara antigen. Mereka
ditularkan di daerah tropis dan subtropis dalam suatu siklus yang melibatkan manusia dan
nyamuk (Aedes aegypti). Infeksi dengan salah satu serotipe tidak memberikan imunitas
lintas protektif.

Virus Dengue menghasilkan spektrum penyakit yang luas pada manusia, mulai dari
demam Dengue ringan (DF) hingga demam berdarah yang mengancam jiwa (DHF) dan
sindrom syok (DHS). Dengue adalah penyakit virus yang ditularkan oleh nyamuk yang
sangat penting dengan perkiraan 100 juta kasus per tahun.

IgG dan IgM ELISA saat ini merupakan metode yang paling berguna untuk
menyediakan diagnosis serologis tertentu. Antibodi IgM dapat dideteksi 3 hari setelah
timbulnya penyakit, antibodi IgG kira-kira setelah 14 hari. Pada infeksi sekunder,
antibodi IgM dapat muncul dan antibodi IgG terdeteksi pada tingkat yang lebih tinggi.

 PRINSIP –Indirect Antibody EIA -.

The HUMAN DENGUE IgM ELISA dimaksudkan untuk penggunaan profesional.
ELISA digunakan untuk deteksi antibodi IgM Indirect menggunakan antigen spesifik
Dengue (DEN-Ag) yang dilapisi pada sumur mikrotiter. Jika ada Antibodi Dengue IgM
pada spesimen (DEN-IgM-Ab) akan mengikat antigen yang diimobilisasi (langkah 1).
Setelah inkubasi, komponen spesimen yang tidak terikat dihilangkan dengan pencucian.
Buffer pengenceran sampel mengandung anti-human IgG untuk mencegah gangguan dari
rheumatoid faktor (RF) dan persaingan dari IgG spesifik yang ada dalam spesimen.

Untuk langkah inkubasi kedua konjugat anti-igM (anti igM anti-manusia, konjugasi
peroksidase) ditambahkan yang berikatan secara khusus dengan antibodi kelas IgM yang
menghasilkan pembentukan immunocomplex yang khas. Setelah langkah pencucian
kedua untuk menghilangkan konjugat berlebih, TMB / Substrat ditambahkan (Langkah
3). Warna biru berubah menjadi kuning setelah menghentikan reaksi. Intensitas warna
berbanding lurus dengan konsentrasi DEN-IgM-Ab dalam spesimen.

Absorbansi kontrol dan spesimen ditentukan dengan menggunakan pembaca

microplate ELISA atau sistem ELISA otomatis (seperti HUMAN'S HumaReader atau
ELISYS line). Hasil untuk sampel pasien diperoleh dengan perbandingan dengan nilai
cut-off atau dengan ekspresi dalam satuan (U / ml). Tes ini telah dikalibrasi terhadap
standar.

 Reagen dan Isi Strip

MIC 12 Microtiter (dalam 1 pemegang strip)
8-well snap-off strip dilapisi dengan antigen dengue (subtipe 2)
NC 2,5 ml Dengue IgM kontrol Negatif (topi hijau) siap digunakan.
PC 2,5 ml dengue IgM Kontrol Positif (topi merah) siap digunakan.
DIL 100 ml Dilution Buffer (topi putih) siap digunakan, berwarna hijau
Antibodi anti-manusia-lgG
pH 7.2 -/+ 0.2
CON 20 ml Anti-IgM konjugat (topi hitam) siap digunakan, berwarna
merah IgM anti-manusia (kelinci), peroksidase terkonjugasi
WS 20x 50 ml Washing solution (tutup putih)
Berkonsentrasi untuk sekitar 1000 ml
pH 7,2 + 0,2
SUB 15 ml Substrat Reagen (tutup hijau)
3,3, 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB ) siap pakai
20 mmol/l
STOP 15 ml Stop solution (tutup merah)
Sulphuriv acid,siap pakai
2 Pita perekat
Pengawet : Konsentrasi <0,2%
 Catatan Keamanan
Jangan menelan reagen. Hindari kontak dengan mata, kulit dan selaput lendir, Semua
spesimen dan kontrol pasien harus ditangani karena berpotensi menular. Kontrol telah
diperiksa pada tingkat donor untuk antibodi HCV dan HIV-1/2 dan HBSAG dan
ditemukan negatif. Pakailah pakaian pelindung dan sarung tangan sekali pakai sesuai
dengan Good Laboratory Practices.

Semua bahan yang terkontaminasi dengan spesimen atau kontrol pasien harus
dinonaktifkan dengan prosedur yang divalidasi (perawatan otomatis atau bahan kimia)
sesuai dengan peraturan yang berlaku.

 Stabilitas Reagen
Stabil hingga tanggal kedaluwarsa yang dinyatakan pada masing-masing label saat
disimpan pada 2 ... 8 C.

 MIC
1. Disegel dalam tas aluminium dengan desikan
2. Harus pada suhu kamar sebelum membuka
3. Tidak digunakan: kembali dengan desikan ke tas kunci-zip dan jalan di 2 ... 8 ° C
4. Jangan menyentuh tepi atas atau bagian bawah sumur dengan jari

 Persiapan Reagen
1. Bawa reagen ali ke suhu kamar (15 ... 25 ° C) sebelum digunakan.
2. Reagen yang tidak digunakan harus selalu disimpan pada 2..8 ° C.

 Solusi Cuci Kerja WASH

 1. Encerkan WS 20x 1 + 19 dengan air deionisasi segar, mis. 50 ml WS 20x950 ml
1000 ml.
2. Stabilitas: 4 minggu pada 2 ... 8 ° C.

 Spesimen
Serum. Jangan gunakan spesimen yang sangat lipemik atau hemolisis.
Spesimen dapat disimpan selama 7 hari pada 2..8'C atau lebih lama pada -20 "C.
Membekukan dan mencair sekali saja. Spesimen yang dicairkan harus homogen.
Menghilangkan partikel dengan sentrifugasi atau filtrasi.

 Prosedur
Ikuti prosedur persis seperti yang dijelaskan
Catatan Prosedur
 P1: Jangan mencampur tutup botol (risiko kontaminasi). Jangan menggunakan
reagen setelah tanggal kedaluwarsa nya.
 P2: Jangan gunakan reagen yang dapat terkontaminasi atau terlihat atau berbau
berbeda dari biasanya
 P3: Rekam spesimen dan kontrol dengan hati-hati pada lembar spread yang
disertakan dengan kit
 P4: MIC-pilih nomor yang diperlukan dan tempatkan dengan kuat di
pegangannya
 P5: Lakukan duplo untuk kontrol negatif/positif dan spesimen. Kontrol pipet
dan spesimen di bagian bawah microwell
 P6: Selalu tambahkan reagen dalam urutan dan waktu yang sama untuk
meminimalkan perbedaan waktu reaksi antar sumur. Hal ini penting untuk hasil
yang berulang. Pemipetan spesimen tidak boleh berlebih dari 5 menit. Kalau
tidak, pipet kurva kalibrasi pada posisi yang ditunjukkan pada paruh waktu seri.
Jika lebih dari 1 plate digunakan, ulangi kurva respons dosis untuk setiap plate.
 P7: Hindari/singkirkan gelembung udara sebelum inkubasi dan pembacaan
absorbansi inkubasi.
 P8: SUB - diinkubasi pada suasana yang gelap. SUB memulai reaksi kinetik,
diakhiri oleh STOP
 P9: DIL – Kekeruhan setelah penambahan sampel tidak memiliki pengaruh pada
hasil

 Prosedur Cuci
Prosedur mencuci sangat penting. Pencucian yang kurang akan menghasilkan presisi
yang buruk atau absorbansi yang sangat tinggi

W1: Lepaskan Strip Perekat, aspirasi isi menjadi larutan natrium hipoklorit 5% dan
tambahkan (WASH) ke setiap sumur, aspirasi setelah 30 detik waktu rendam dan ulangi
pencucian dua kali
 W2: Dalam kasus dari pencuci otomatis isi dan prima dengan WASH Selanjutnya cuci
strip 3 kali. Pastikan mesin cuci mengisi semua sumur sepenuhnya dan menyedot secara
efisien setelah 30 detik (sisa cairan: <15 pl)
W3: Setelah mencuci, hilangkan sisa cairan dengan mengetukkan plate ke arah bawah
pada kertas tisu

 Cara Memipet
Reagen dan spesimen harus pada suhu kamar sebelum digunakan
Persiapan Sampel: Encerkan serum pasien 1 + 100 dengan DIL mis. 10 ul serum +1 ml DIL
aduk hingga rata (lihat P9). Kontrol siap digunakan
STEP 1 Well (µl)
A1 B1/C1 D1/E1 F1…
blank NC PC Sample
NC dalam rangkap. 100
PC dalam rangkap. 100
Sampel encer 100
Tutup MIC dengan strip perekat
Inkubasi 60 menit pada suhu 37oC
Cuci 3 kali seperti yang dijelaskan (lihat W1- W3)
WASH 300 300 300 300
STEP 2
CON 100 100 100
Tutup MIC dengan strip perekat
Inkubasi 30 menit pada suhu 37oC
Cuci 3 kali seperti yang dijelaskan (lihat W1- W3)
WASH 300 300 300 300
STEP 3
SUB 100 100 100 100
o
Inkubasi 15 menit pada suhu 17-25 C (lihat P8)
STOP 100 100 100 100
Homogenkan pdengan hati-hati
Kosongkan pembaca pelat mikrotiter ELISA (HumaReader) menggunakan media kosong di
sumur A1
Ukur absorbansi pada 450 nm sesegera mungkin atau dalam 30 menit, setelah penghentian
reaksi, dengan menggunakan panjang gelombang referensi 630-690 nm (jika tersedia).
 Kalkulasi Control values and cut off
Nilai absorbansi rata-rata NC dalam sumur B1 dan C1 (MNC) dihitung
berdasarkan :
A 450 ( B 1 ) + A 450(C 1)
MNC=
2
Cut – off value (COV) = MNC + 0,35
Uji coba dapat dianggap sah asalkan kriteria berikut dipenuhi:
1. Kosongkan media dalam sumur A1 <0,100
2. MNC ≤ 0,300
3. PC: A450 ≥ Cov

 Interpretasi Hasil.
Sampel dianggap POSITIF jika nilai absorbansi lebih tinggi dari 10% dari cut-off.
Sampel dengan nilai absorbansi diatas 10% atau di bawah cut-off tidak boleh dianggap
sebagai positif atau negatif (Grey Zone).

Sampel dianggap NEGATIF jika nilai absorbansi lebih rendah dari 10% di bawah cut-
off.

A450 (patient) ≥ COV + 10% Anti-DEN-IgM-Ab-positif

A450 (patient) ˂ COV – 10% Anti-DEN-IgM-Ab-negatif
 Anti-DEN IgM antibody unit
Patient absorbance value× 10
U /ml=
COV
Cut-off : 10 U/ml
Grey zone : 9-11 U/ml
Negatif : <9 U/ml
Positif : ≥11 U/ml

 Catatan Keamanan
BERHENTI Peringatan! Pernyataan Bahaya
 H315 Menyebabkan iritasi kulit.
 319 Menyebabkan gangguan mata berat. Pernyataan kehati-hatian
 P280 Pakailah sarung tangan pelindung / pakaian pelindung / pelindung mata.
perlindungan / wajah
 P305 + P351 + P338 JIKA TERKENA MATA: Bilas secara hati-hati dengan air
selama beberapa menit. Lepaskan lensa kontak, jika ada dan mudah dilakukan.
Lanjutkan membilas.
 P321 Perawatan khusus.
 P332 + P313 Jika terjadi iritasi kulit: Dapatkan saran / perhatian medis.
 P337 + P313 Jika iritasi mata berlanjut: Dapatkan saran / perhatian medis.