BAB II

PEMBAHASAN

2.1. Spektrofotometer Sinar Tampak (Visible)

Spektrofotometri visible disebut juga spektrofotometri sinar tampak. Yang
dimaksud sinar tampak adalah sinar yang dapat dilihat oleh mata manusia. Cahaya
yang dapat dilihat oleh mata manusia adalah cahaya dengan panjang gelombang
400-800 nm dan memiliki energi sebesar 299–149 kJ/mol. Elektron pada keadaan
normal atau berada pada kulit atom dengan energi terendah disebut keadaan dasar
(ground-state). Energi yang dimiliki sinar tampak mampu membuat elektron
tereksitasi dari keadaan dasar menuju kulit atom yang memiliki energi lebih tinggi
atau menuju keadaan tereksitasi. Cahaya yang diserap oleh suatu zat berbeda
dengan cahaya yang ditangkap oleh mata manusia (Triyati, 1985).
Cahaya yang tampak atau cahaya yang dilihat dalam kehidupan sehari-hari
disebut warna komplementer. Misalnya suatu zat akan berwarna orange bila
menyerap warna biru dari spektrum sinar tampak dan suatu zat akan berwarna
hitam bila menyerap semua warna yang terdapat pada spektrum sinar tampak.
Pada spektrofotometer sinar tampak, sumber cahaya biasanya menggunakan
lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram. Wolfram merupakan salah
satu unsur kimia, dalam tabel periodik unsur wolfram termasuk golongan unsur
transisi tepatnya golongan VIB atau golongan 6 dengan simbol W dan nomor
atom 74. Wolfram digunakan sebagai lampu pada spektrofotometri tidak terlepas
dari sifatnya yang memiliki titik didih yang sangat tinggi yakni 5930 °C.
Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah
panjang gelombang dimana suatu zat memberikan penyerapan paling tinggi yang
disebut λmaks. Hal ini disebabkan jika pengukuran dilakukan pada panjang
gelombang yang sama, maka data yang diperoleh makin akurat atau kesalahan
yang muncul makin kecil. Berdasarkan hukum Beer absorbansi akan berbanding
lurus dengan konsentrasi, karena b atau l harganya 1 cm dapat diabaikan dan ε
merupakan suatu tetapan. Artinya konsentrasi makin tinggi maka absorbansi yang
dihasilkan makin tinggi, begitupun sebaliknya konsentrasi makin rendah
absorbansi yang dihasilkan makin rendah. Hubungan antara absorbansi terhadap
konsentrasi akan linear (A≈C) apabila nilai absorbansi larutan antara 0,2-0,8 (0,2
≤ A ≥ 0,8) atau sering disebut sebagai daerah berlaku hukum Lambert-Beer. Jika
absorbansi yang diperoleh lebih besar maka hubungan absorbansi tidak linear lagi.
Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar tampak
adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut harus tampak berwarna, sehingga
analisis yang didasarkan pada pembentukan larutan berwarna disebut juga metode
kolorimetri. Jika tidak berwarna maka larutan tersebut harus dijadikan berwarna
dengan cara memberi reagen tertentu yang spesifik. Dikatakan spesifik karena
hanya bereaksi dengan spesi yang akan dianalisis. Reagen ini disebut reagen
pembentuk warna (chromogenik reagent). Berikut adalah sifat-sifat yang harus
dimiliki oleh reagen pembentuk warna:
1. Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam
waktu beberapa jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan
bila disimpan. Oleh sebab itu harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang
baru harus dibuat saat setiap kali analisis.
2. Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat.
3. Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara
stoikiometrik.
4. Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan
pengukuran.
5. Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa,
sehingga warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi
komponen tersebut saja.
6. Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain
dalam larutan yang dapat mengubah zat pereaksi atau komponen
komponen yang dianalisa menjadi suatu bentuk atau kompleks yang tidak
berwarna, sehingga pembentukan warna yang dikehandaki tidak
sempurna.
7. Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna
yang dikehendaki dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang
dipakai.

2.2. Analisa Spektrofotometer UV

Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara
radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang
sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri ultraviolet,
cahaya tampak, infra merah dan serapan atom. Jangkauan panjang gelombang
untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm, daerah cahaya tampak 380-780 nm,
daerah infra merah dekat 780-3000 nm, dan daerah infra merah 2,5-40 mm atau
4000-250 cm-1 ( Ditjen POM, 1995).
Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik
aromatik, molekul yang mengandung elektron-p terkonyugasi dan atau atom yang
mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari
tingkat energi elektron dasar ke tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi.
Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit
yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
Gugus fungsi seperti –OH, -NH2 dan –Cl yang mempunyai elektron-
elektron valensi bukan ikatan disebut auksokhrom yang tidak menyerap radiasi
pada panjang gelombang lebih besar dari 200 nm, tetapi menyerap kuat pada
daerah ultraviolet jauh. Bila suatu auksokhrom terikat pada suatu khromofor,
maka pita serapan khromofor bergeser ke panjang gelombang yang lebih panjang
(efek batokhrom) dengan intensitas yang lebih kuat. Efek hipsokhrom adalah
suatu pergeseran pita serapan ke panjang gelombang lebih pendek, yang sering
kali terjadi bila muatan positif dimasukkan ke dalam molekul dan bila pelarut
berubah dari non polar ke pelarut polar (Dachriyanus, 2004).
Secara eksperimental, sangat mudah untuk mengukur banyaknya radiasi
yang diserap oleh suatu molekul sebagai fungsi frekuensi radiasi. Suatu grafik
yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi (atau
panjang gelombang) sinar merupakan spectrum absorpsi. Transisi yang
dibolehkan (allowed transition) untuk suatu molekul dengan struktur kimia yang
berbeda adalah tidak sama ssehingga spectra absorpsinya juga berbeda. Dengan
demikian, spectra dapat digunkan sebagai bahan informasi yang bermanfaat untuk
analisis kualitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada panjang gelombang
tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi, sehingga
spectra absorpsi juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Gandjar dan
Rohman, 2007). Hal–hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektofotometri
ultraviolet adalah sebagai berikut:
1) Pemilihan panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah
panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk
memperoleh panjang gelombang serapan maksimum, dilakukan
dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang
gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.
2) Pembuatan Kurva Kalibrasi
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan
berbagai konsentrasi. Masing – masing absorbansi larutan dengan
berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan
hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi. Bila hukum
Lambert-Beer terpenuhi maka kurva kalibrasi berupa garis lurus.
3) Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara
0,2 sampai 0,6. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa pada
kisaran nilai absorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang terjadi
adalah paling minimal (Gandjar dan Rohman, 2007).
Kegunaan spektrofotometri ultraviolet dalam analisis kualitatif sangat
terbatas, karena rentang daerah radiasi yang relatif sempit hanya dapat
mengakomodasi sedikit sekali puncak absorpsi maksimum dan minimum, karena
itu identifikasi senyawa yang tidak diketahui, tidak memungkinkan.
Penggunaannya terbatas pada konfirmasi identitas dengan menggunakan
parameter panjang gelombang puncak absorpsi maksimum, lmax, nilai
absorptivitas, a, nilai absorptivitas molar, e, atau nilai ekstingsi, A 1%, 1 cm, yang
spesifik untuk suatu senyawa yang dilarutkan dalam suatu pelarut dan pH tertentu.
 Penggunaan utama spektrofotometri ultraviolet adalah dalam analisis
kuantitatif. Apabila dalam alur spektrofotometer terdapat senyawa yang
mengabsorpsi radiasi, akan terjadi pengurangan kekuatan radiasi yang mencapai
detektor. Parameter kekuatan energi radiasi khas yang diabsorpsi oleh molekul
adalah absorban (A) yang dalam batas konsentrasi rendah nilainya sebanding
dengan banyaknya molekul yang mengabsorpsi radiasi dan merupakan dasar
analisis kuantitatif. Penentuan kadar senyawa organik yang mempunyai gugus
khromofor dan mengabsorpsi radiasi ultraviolet-sinar tampak, penggunaannya
cukup luas. Konsentrasi kerja larutan analit umumnya 10 sampai 20 mg/ml, tetapi
untuk senyawa yang nilai absorptivitasnya besar dapat diukur pada konsentrasi
yang lebih rendah. Senyawa yang tidak mengabsorpsi radiasi ultraviolet-sinar
tampak dapat juga ditentukan dengan spektrofotometri ultraviolet-sinar tampak,
apabila ada reaksi kimia yang dapat mengubahnya menjadi khromofor atau dapat
disambungkan dengan suatu pereaksi khromofor (Satiadarma, 2004).

2.3. Bagian – Bagian Spektrofotometer UV-Vis dan Fungsinya

Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopi
memakai sumber radiasi elektromagnetik ultra violet dekat (190-380 nm) dan
sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer (Mulja
dan Suharman, 1995). Analisis kimia bertujuan untuk mengetahui komposisi
suatu zat atau campuran zat yang merupakan informasi kualitatif mengenai ada
atau tidak adanya suatu unsur atau komponen dalam contoh. Selain itu juga untuk
mengukur jumlah atau banyaknya unsur yang diteliti atau dengan perkataan lain
adalah untuk mengetahui data kuantitatif, juga dapat dipakai untuk menentukan
struktur suatu zat. Alat instrumen biasanya dipergunakan untuk menentukan suatu
zat berkadar rendah, biasanya dalam satuan ppm (part per million) atau ppb (part
per billion). Gambar dari spektrofotometri UV-Vis adalah sebagai berikut:

Bagian-bagian dari spektrofotometri UV-Vis adalah sebagai berikut:

1) Sumber cahaya
Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki panacaran
radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber  cahaya pada
spektrofotometer UV-Vis ada dua macam, yaitu Lampu Tungsten
(Wolfram), lampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada
daerah tampak. Bentuk lampu ini mirip dengna bola lampu pijar
biasa. Memiliki panjang gelombang antara 350-2200 nm. Spektrum
radiasianya berupa garis lengkung. Umumnya memiliki waktu
1000jam pemakaian. Lalu ada Lampu Deuterium, lampu ini dipakai
pada panjang gelombang 190-380 nm. Spektrum energy radiasinya
lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel yang terletak pada
daerah uv. Memiliki waktu 500 jam pemakaian.

2) Monokromator
Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis
menjadi cahaya tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang
gelombang tertentu. Bagian-bagian monokromator, yaitu:
a) Prisma
Prisma akan mendispersikan radiasi elektromagnetik
sebesar mungkin supaya di dapatkan resolusi yang baik dari
radiasi polikromatis.
b) Grating (kisi difraksi)
Kisi difraksi memberi keuntungan lebih bagi proses
spektroskopi. Dispersi sinar akan disebarkan merata,
dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi akan lebih
baik. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh
jangkauan spektrum.
c) Celah optis
Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar
monokromatis yang diharapkan dari sumber radiasi.
Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi
akan dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh
panjang gelombang yang diharapkan.
d) Filter
Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga
cahaya yang diteruskan merupakan cahaya berwarna yang
sesuai dengan panjang gelombang yang dipilih.

3) Kompartemen sampel
Kompartemen ini digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet.
kuvet merupakan wadah yang digunakan untuk menaruh sampel
yang akan dianalisis. Pada spektrofotometer double beam, terdapat
 dua tempat kuvet. Satu kuvet digunakan sebagai tempat untuk
menaruh sampel, sementara kuvet lain digunakan untuk menaruh
blanko. Sementara pada spektrofotometer single beam, hanya
terdapat satu kuvet.

4) Detektor
Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar
kemudian diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam
rekorder dan ditampilkan dalam bentuk angka-angka pada reader
(komputer).

5) Visual display
Merupakan system baca yang memperagakan besarnya isyarat
listrik, menyatakan dalam bentuk % Transmitan maupun Absorbansi.

2.4. Kelebihan dan Kekurangan Spektrofotometer UV-Vis dengan

Fotometer Filter
Fotometri adalah suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran
besaran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna dengan
menggunakan detektor fotosel, dimana besaran ini merupakan fungsi dari
kandungan komponen tertentu yang melakukan penyerapan. Pada kolorimeter
visual kita melihat intensitas warna dengan mata telanjang. Alat filter fotometri
dapat digunakan bila cahaya yang diserap dapat dideteksi pada daerah dan larutan
yang digunakan dengan larutan yang akan dianalisa harus berbeda. Pemilihan
filter yang tepat untuk analisa tertentu adalah hal terpenting karena kepekaan
pengukuran secara langsung bergantung pada filter yang digunakan.
Adapun kelebihan dari spektrofotometer UV-Vis dengan fotometer filter
antara lain:
1) Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi
2) Caranya sederhana
3) Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil
Sedangkan kekurangan spektrofotometer UV-Vis dengan fotometer filter
adalah sebagai berikut:
1) Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat
pengganggu dan kebersihan dari kuvet
2) Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang
>185 nm
3) Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron
valensi dengan energy eksitasi rendah
4) Sinar yang dipakai harus monokromatis
2.5. Prinsip Dasar Analisa Spektrofotometer UV-Vis
Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis adalah interaksi yang terjadi antara
energi yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang
berupa molekul. Besar energi yang diserap tertentu dan menyebabkan elektron
tereksitasi dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi yang memiliki energi lebih
tinggi. Suatu sumber cahaya yang dipancarkan melalui monokromator (B).
Monokromator menguraikan sinar yang masuk dari sumber cahaya tersebut
menjadi pita-pita panjang gelombang yang diinginkan untuk pengukuran suatu zat
tertentu.
Dari monokromator tadi cahaya/energi radiasi diteruskan dan diserap oleh
suatu larutan yang akan diperiksa di dalam kuvet. Kemudian jumlah cahaya yang
diserap oleh larutan akan menghasilkan signal elektrik pada detektor, yang mana
signal elektrik ini sebanding dengan cahaya yang diserap oleh larutan tersebut.
Besarnya signal elektrik yang dialirkan ke pencatat dapat dilihat sebagai angka.
Metode Spektrofotometri Ultra-violet dan Sinar Tampak berdasarkan pada hukum
LAMBERT-BEER. Hukum tersebut menyatakan bahwa jumlah radiasi cahaya
Tampak, Ultra-violet dan cahaya-cahaya lain yang diserap atau ditransmisikan
oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal
larutan.
Bila absorbansi A dialurkan terhadap konsentrasi c untuk contoh yang
tebalnya b cm, maka akan menghasilkan suatu garis lurus dengan lereng AB
dalam daerah dimana hukum LAMBERT-BEER berlaku (Pecsok et al., 1976;
Skoog & West 1971). Garis lurus yang dihasilkan ini tidak selalu diperoleh
melalui titik awal (titik nol). Hal ini disebabkan oleh faktor-faktor fisika dan
kimia. Faktor fisika disebabkan oleh keadaan alatnya sendiri, misalnya sumber
cahaya yang dipakai, lebar celah, kepekaan rekorder dan sebagainya, tetapi
kesalahan ini relatif kecil karena alat yang dipakai sebelum dikeluarkan telah diuji
ketelitiannya. Faktor kimia disebabkan oleh perbedaan pH larutan, konsentrasi,
suhu dan terjadinya reaksi kimia dalam larutan, misalnya: oksidasi, disosiasi,
polime-risasi dan pembentukan kompleks.

DAPUS
Dachriyanus. 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi.
Cetakan I. Padang: Andalas University Press.

Dirjen POM. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta: Depkes RI.

Gandjar I.G dan Rohman A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka
Pelajar.

Mulja M dan Suharman. 1995. Analisis Instrumen, Cetakan 1. Surabaya:

Airlangga University Press.
Pecsok R.L., Shileds L.D., Cairns T., and Mcwilliam I.G. 1976. Modern Methods
of Chemical Analysis. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons, Inc.

Triyati E. 1985. Spektrofotometer Ultra-Violet Dan Sinar Tampak Serta

Aplikasinya Dalam Oseanologi. Jurnal Oseana, 10(1): 39-47.