PENGKOLEKSIAN SEL

Oleh :
1. Farros Hafizh Atmaja – 2015041011
2. Ni Gusti Sayu Made Putri G. Widhyawati -2015041013
3. Liandrha Oktaviani S – 2015041015
4. Khairunnisa Lubis - 2015041017

UNIVERSITAS LAMPUNG
2020
 BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Mikroba yang ditemukan di suatu lingkungan ditemukan dalam populasi campuran, sangat jarang sekali yang
ditemukan sebagai satu spesies tunggal. Penelitian mengenai mikroorganisme biasanya memerlukan teknik untuk
memisahkan populasi campuran pada permulaanya, atau biakan campuran, menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda
sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang berasal dari satu sel induk. Hal lain yang perlu
diperhatikan adalah pemeliharaan kemurnian isolat selama penyimpanan, agar produk atau metabolisme suatu
mikroba.
Mikroorganisme sebagai makhluk hidup sama dengan organisme hidup lainnyasangat memerlukan energi dan
bahan-bahan untuk membangun tubuhnya. Bahan-bahantersebut disebut nutrien.Peran utama nutrien adalah sebagai
sumber energi, bahan pembangun sel, dansebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang
menghasilkan energi).Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon,
sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. Selain itu, secara umum nutrient dalam
media pembenihan harus mengandung seluruhelemen yang penting untuk sintesis biologik organisme baru.
Saat ini media agar merupakan media yang sangat umum digunakan dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Media agar ini memungkinkan untuk dilakukannya isolasi bakteri dari suatu sampel, karakterisasi morfologi,sampai
penghitungaan bakteri yang dikenal dengan nama total plate count. Bentuk koloni bakteri dan warna-warninya mudah
sekali dikenali dengan media ini dengan cara mengubah komposisi nutrian atau menambahkan indikator.
Keragaman yang luas dalam hal tipe nutrisi diantara mikroorganisme di imbangi oleh tersedianya berbagai media
yang banyak macamnya untuk kultivasinya. Macam media yang tersedia dapat dikelompokan dengan berbagai cara.
Selain menyediakan nutrient yang sesuai untuk kultivasi mikroorganisme, juga perlu disediakan kondisi fisik yang
memungkinkan pertumbuhan optimum.
Mikroorganisme tidak hanya amat bervariasi dalam persyaratan nutrisnya, tetapi juga menunjukkan respons yang
berbeda-beda terhadap kondisi fisik di dalam lingkungannya. Untuk keberhasilan kultivasi berbagai tipe bakteri,
dibutuhkan satu kombinasi nutrient serta lingkungan fisik yang sesuai. Perkembangan bakteri dipengaruhi bebrapa
faktor, yaitu : suhu, cahaya, pengeringan(kelembaban), keasamam(ph), pengaruh O2 dari udara, dan mikroorganisme
disekitarnya.
Di alam bebas tidak ada bakteri yang hidup sendiri terlepas dari spesies lainya. Di laboratorium, supaya kita hanya
mendapat satu spesies saja dalam sesuatu biakan campuran menjadi biakan murni memerlukan teknik-teknik untuk
mengisolasi. Populasi campuran menjadi. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu populasi jenis
mikroba yang semuanya berasal dari satu induk. Isolasi bakteri artinya memisahkan satu jenis bakteri dari biakan
campuran menjadi biakan murni.
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi keberhasilan produksi barang dan jasa dengan menggunakan
mikroorganisme diataranya adalah mikroorganisme, kondisi lingkungan dan media atau kultur yang dipergunakan .
salah satu hal yang menentukan keberhasilan kultur adalah adanya penyiapan kultur yang baik. Untuk itu perlu
dipelajari tentang penyiapan kultur dan mikroorganismenya.
Di Indonesia yang terletak di daerah tropik merupakan sumber biodiversitas yang luas, termasuk mikrobanya, baik
yang merugikan maupun yang berguna bagi pertanian. Mikroba tersebut, di samping beragam jenisnya juga sangat
mudah mengalami perubahan sifat sehingga menjadi strain baru yang berbeda dengan aslinya. Hal ini menambah
cepat tumbuh dan berkembangnya biodiversitas tersebut. Dalam melakasanakan kegiatan ilmiahnya, para pakar
mikrobiologi dan pakar ilmu yang terkait seperti pakar fitopalogi dan entomologi perlu mempunyai koleksi plasma
nutfa mikroba, baik untuk digunakan sehari_hari, untuk jangka menengah, maupun jangka panjang. Oleh karena itu,
perlu dilakukan pengole
B. Rumusan Masalah
Dari latar belakang yang terurai di atas, penulis merumuskan masalah yaitu :
1. Apa sajakah sumber-sumber mikroorganisme?
2. Bagaimana isolasi dan kultivasi sel murni?
3. Bagaimana preservasi sel murni
4. Bagaimana karakterisasi kultur murni?

C. Tujuan Penelitian
Dari rumusan masalah tersebut, penulis memiliki tujuan penelitian yaitu :
1. Mengetahui sumber-sumber mikroorganisme.
2. Mengetahui bagaimana isolasi dan kultivasi sel murni.
3. Mengetahui preservasi sel murni.
4. Mengetahui karakterisasi kultur murni.

D. Manfaat Penelitian
Dari hasil penelitian, penulis mendapatkan manfaat yaitu :
1. Menambah ilmu tentang sumber-sumber mikroorganisme.
2. Menambah ilmu bagaimana isolasi dan kultivasi sel murni.
3. Menambah ilmu tentang bagaimana preservasi sel murni.
4. Memanbah wawasan tentang bagaimana karakterisasi kultur murni.
 BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sumber Mikroorganisme

Mikroorganisme atau mikrob adalah organisme yang berukuran sangat kecil sehingga untuk mengamatinya

diperlukan alat bantuan. Mikroorganisme disebut juga organisme mikroskopik. Mikroorganisme sering kali bersel tunggal
(uniseluler) maupun bersel banyak (multiseluler). Namun, beberapa protista bersel tunggal masih terlihat oleh mata
telanjang dan ada beberapa spesies multisel tidak terlihat mata telanjang. Virus juga termasuk ke dalam mikroorganisme
meskipun tidak bersifat seluler.
Mikroorganisme biasanya dianggap mencakup semua prokariota, protista, dan alga renik.[3] Fungi, terutama yang
berukuran kecil dan tidak membentuk hifa, dapat pula dianggap sebagai bagiannya, meskipun banyak yang tidak
menyepakatinya. Kebanyakan orang beranggapan bahwa yang dapat dianggap mikroorganisme adalah semua organisme
sangat kecil yang dapat dibiakkan dalam cawan petri atau inkubator di dalam laboratorium dan mampu memperbanyak
diri secara mitosis. Sumber sumber mikroorganisme antar lain lingkungan ekstrim(tempat bersuhu ekstrim, kadar garam
tinggi), kotoran, air limbah, dan bahkan, dalam makanan.

1. Bakteri
Bakteri adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel. Organisme ini milik prokariota dan domain
yang sangat kecil (mikroskopik), dan memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Bakteri biasanya menyebabkan
penyakit pada manusia. Contoh: Salmonella, Eccerecia Coli, Staphylococcus dan Difteri bacilus.\
2. Ragi
Ragi atau Fermen adalah zat yang menyebabkan fermentasi. Ragi biasanya mengandung mikroorganisme yang
memfermentasi dan media kultur untuk mikroorganisme. Medium kultur ini bisa dalam bentuk butiran kecil atau nutrisi
cair. Ragi umumnya digunakan dalam industri makanan untuk membuat makanan dan minuman fermentasi seperti acar,
tempe, tape, roti, dan bir.
3. Jamur
Jamur di sini dimaksudkan adalah jamur dengan kategori jamur. Jamur ini biasanya tidak menyebabkan penyakit, tetapi
menyebabkan kerusakan makanan. Misalnya, jamur yang ditemukan pada permukaan daging, daging dapat dibuang
bagian tanpa harus membuang semua daging.
4. Parasit
Parasit adalah hewan mikroskopis yang dapat mengurangi produktivitas hewan inang. Parasit dapat menginfeksi manusia
dan hewan, seperti menyerang kulit manusia. Parasitoid adalah parasit dari organisme lain yang menggunakan jaringan
untuk kebutuhan gizi mereka sampai orang-orang yang menunggang meninggal karena kehilangan jaringan atau nutrisi
yang dibutuhkan. Parasitoid juga dikenal sebagai necrotroph.
5. Virus
Virus adalah parasit mikroskopik yang menginfeksi sel-sel dalam organisme biologis. Virus adalah parasit obligat, itu
karena virus hanya dapat bereproduksi dengan menyerang material dan memanfaatkan sel-sel hidup karena mereka tidak
memiliki mesin selular untuk bereproduksi sendiri. Biasanya sejumlah kecil asam nukleat (DNA atau RNA, tetapi tidak
kombinasi keduanya) yang dikelilingi oleh beberapa bentuk bahan pelindung yang terdiri dari protein, lipid, glikoprotein,
atau kombinasi dari ketiganya.

2.1.1 Lingkungan ekstrem

Bakteri merupakan kelompok organisme yang sangat beragam, baik dari segi metabolisme maupun morfologi tubuh.
Beberapa kelompok mikroorganisme ini mampu hidup di lingkungan yang tidak memungkinkan organisme lain untuk
hidup. Kondisi lingkungan yang ekstrem ini menuntut adanya toleransi, mekanisme metabolisme, dan daya tahan sel yang
unik. Selain bakteri, mikroorganisme yang termasuk dalam domain archaea juga cenderung memiliki ketahanan sel
terhadap lingkungan ekstrem. Kemampuan mikroorganisme untuk hidup pada kondisi ekstrem dapat membawa nilai dan
aplikasi di berbagai bidang industri, seperti pangan, agrikultur, farmasi dan pengobatan, serta bioteknologi.

Gambar Thermus aquatiqus

Sumber : https://id.wikipedia.org/wiki/Habitat_bakteri
Sebagai contoh, Thermus aquatiqus merupakan salah satu jenis bakteri yang hidup pada sumber air panas dengan kisaran
suhu 60-80 oC. Organisme yang mampu hidup di lingkungan dengan suhu tinggi ini termasuk dalam
golongan termofilik. Kemampuan bakteri ini untuk bertahan pada suhu tinggi disebabkan oleh stabilitas enzim, membran
sel, dan makromolekul sel yang telah teradaptasi. Enzim yang dimiliki oleh bakteri kelompok termofilik memiliki
komposisi asam amino yang berbeda dengan bakteri pada umumnya. Di samping itu, protein yang terdapat sel memiliki
ikatan hidrofobik dan ikatan ionik yang sangat kuat. Komposisi membran selnya didominasi oleh asam lemak jenuh
sehingga bersifat lebih stabil dan fungsional pada suhu tinggi. Hal ini disebabkan oleh kuatnya ikatan hidrofobik pada
rantai asam lemak jenuh bila dibandingan dengan asam lemak tak jenuh. Terdapat beberapa jenis enzim yang banyak
digunakan di industry yang diperoleh dari kelompok organisme termofilik, seperti amilase dan lain lain.
Tidak hanya di lingkungan bersuhu tinggi, bakteri juga dapat ditemukan pada lingkungan dengan suhu yang sangat dingin.
Pseudomonas extremaustralis ditemukan pada Antartika dengan suhu di bawah 0 oC. Bakteri ini bersifat motil dan hidup
membentuk struktur biofilm yang membantunya dalam menghadapi kondisi ekstrem.Contoh bakteri lainnya yang dapat
hidup di suhu rendah adalah Carnobacterium. Kelompok bakteri yang mampu hidup di lingkungan bertemperatur rendah
termasuk dalam golongan psikrofilik. Kemampuan bakteri ini untuk bertahan pada kondisi temperatur rendah cukup
bertolak belakang dengan kelompok bakteri termofilik. Enzim yang disintesis memiliki struktur α-heliks yang lebih
banyak bila dibandingkan dengan struktur β-sheet. Struktur α-heliks yang lebih fleksibel menyebabkan enzim tetap dapat
bekerja walaupun pada suhu yang rendah. Di samping itu, enzim bakteri psikrofilik harus lebih bersifat  polar dan hanya
mengandung sedikit asam amino yang bersifat hidrofobik. Selain enzim dan protein yang teradaptasi, membran sitoplasma
kelompok bakteri ini juga telah mengalami penyesuaian dengan mengandung lebih banyak asam amino tidak jenuh.
Di samping pengaruh ekstrem temperatur, bakteri juga dapat hidup pada berbagai lingkungan lain yang hampir tidak
memungkinkan adanya kehidupan (lingkungan steril).[19] Halobacterium salinarum dan Halococcus sp. adalah contoh
dari bakteri yang dapat hidup pada kondisi garam (NaCl) yang sangat tinggi (15-30%). Kelompok bakteri yang hidup
optimal pada kisaran kadar garam tersebut termasuk dalam golongan ekstrem halofil. Tedapat pula beberapa jenis bakteri
yang mampu hidup pada kadar gula tinggi (kelompok osmofil), kadar air rendah (kelompok xerofil), derajat
keasaman pH sangat tinggi, dan rendah.
2.1.2 Kotoran, Air Limbah, Mikroorganisme Murni
Mikroorganisme dapat diperoleh dari berbagai sumber yaitu dari kotoran hewan, septic tank, pengolahan air limbah, air
limbah, mikroorganime murni. Dan berikut merupakan masing-masing penjelasannya :

1. Kotoran hewan
Dalam kotoran hewan seperti sapi, kuda dan lainnya mengandung berbagai jenis mikroorganisme yang dapat
dimanfaatkan dalam pengolahan air limbah. Kotoran hewan yang masih baru disaring, filtratnya diambil dan
mikroorganisme dalam filtrat dapat dikembangkan untuk pengolahan air limbah secara biologi aerob maupun anaerob

2. Septic Tank
Dalam septic tank mengandung berbagai jenis mikroorganisme baik yang bersifat anaerob maupun aerob, mikroorganisme
dalam septic tank dapat dimanfaatkan dalam pengolahan air limbah secara biologi aerob maupun anaerob. Septic tank
dipompa dan disaring, filtrat yang didapat dikembangkan untuk menghasilkan mikroorganisme baik yang aerob maupun
anaerob.

3. Pengolahan Air Limbah

Beberapa industri telah melakukan pengiolahan air limbah secara biologi baik aerob maupun anaerob. Pada pengolahan air
limbah ini akan dihasilkan mikroorganisme yang akan dibuang, mikroorganisme ini dapat dikembangkan untuk
pengolahan air limbah secara biologi di tempat lain pada industri yang sejenis maupun tidak

4. Air Limbah
Air limbah organic pada umumnya dapat emngandung mikroorganisma mikroorganisme yang terkandung dalam air
limbah ini dapat dikembangkan dan diaplikasikan pada pengolahan air limbahnya sendiri.

5. Mikroorganisme Murni
Beberapa industri telah memproduksi berbagai jenis mikroorganisme yang dapat diaplikasikan pada pengolahan air limbah
sehingga tidak perlu lagi mengembangkan mikroorganisme dari sumber lainnya

2.1.3 Olahan Pangan

Mikroorganisme juga dapat ditemukan dalam olahan pangan yaitu bakteri. Dan ini merupakan beberapa bakteri yang
terdapat dalam pangan yang dapat membahayakan kesehatan manusia
 Sumber : https://www.kompas.com/sains/read/2020/04/15/080400923/7-bakteri-pada-makanan-yang-paling-banyak-
sebabkan-penyakit?page=all

1. Escherichia Coli
Bakteri Escherichia coli hidup di organ dalam (jeroan) hewan seperti sapi, kambing, dan domba. Bakteri ini biasanya
terdapat pada daging yang kurang matang, susu murni yang tidak dimasak/ pasteurisasi, serta air yang terkontaminasi.
Baca juga: Musim Hujan, Waspada Flu dan Infeksi Bakteri Mematikan Gejala infeksi E.coli antara lain diare, sakit perut,
dan muntah-muntah yang bisa terjadi sampai 10 hari lamanya.

2. Campylobacter Campylobacter jejuni

Campylobacter campylobacter jejuni adalah bakteri berbentuk spiral yang tumbuh pada sapi dan ayam, menginfeksi
hewan ternak tanpa adanya gejala. Baca juga: Virus Corona Juga Terdapat pada Babi dan Sapi, Ini Penjelasan Ahli
Mayoritas orang yang terinfeksi campylobacter merasakan diare, sakit perut, dan demam sekitar 2-5 hari. Darah kerap
keluar saat diare, disertai pusing dan muntah.

3. Listeria Listeria monocytogenes

Listeria listeria monocytogenes adalah bakteri yang ditemukan pada tanah dan air. Bakteri ini juga terdapat pada makanan
mentah, makanan beku (processed food) dan susu yang tidak dipasteurisasi. Tidak seperti bakteri lainnya, listeria bisa
tumbuh dan berkembang pada temperatur rendah termasuk di dalam lemari pendingin.

4. Vibrio Vibrio parahaemolyticus

Vibrio vibrio parahaemolyticus adalah bakteri yang hidup di air laut, dan biasa ditemukan pada makanan laut (seafood)..

5. Toxoplasma Bakteri toxoplasma

Menginfeksi manusia lewat kotoran kucing, konsumsi daging yang terkontaminasi atau tidak matang, juga konsumsi air
yang terkontaminasi parasit tersebut. Orang yang terinfeksi toxoplasma mengalami gejala seperti flu yaitu sakit kepala,
nyeri badan, dan demam. Namun, parasit ini bisa menyebabkan masalah yang serius bagi otak, mata, dan organ dalam.

6. Salmonella
Salmonella adalah kelompok bakteri yang biasa terdapat pada daging mentah, telur, dan terkadang pada sayur dan buah
yang tidak dicuci.

7. Norovirus
Norovirus adalah jenis virus yang menyebabkan gastroenteritis, penyakit yang disebabkan oleh inflamasi pada perut dan
saluran kencing. Penyakit ini kerap disebut flu perut..

2.1.3.1 Penyakit Yang Disebabkan Mikroorganisme

Ini meurpakan penyakit yang dapat disebabkan oleh sumber sumber mikroorganisme :
1. Diare
Penyakit ini merupakan penyakit yang dapat disebabkan oleh virus maupun bakteri. Jika disebabkan oleh bakteri, penyakit
ini disebabkan oleh beberapa jenis bakteri. Beberapa contoh bakteri yang menyebabkan penyakit ini adalah E.
coli, Campylobacter, Clostridium difficile, Salmonella, atau Shigella ini sering dialami manusia dan menyebabkan
terjadinya infeksi pada sistem pencernaan. Penyakit ini ditandai dengan nyeri perut, feses lebih lunak atau encer, dan BAB
yang lebih sering. Akibatnya Anda kehilangan banyak cairan tubuh dan dehidrasi. Sebagai pertolongan pertama, Anda
bisa menggunakan daun jambu biji atau meminum obat diare. Jika kondisi Anda belum juga membaik pasca minum obat,
segera ke dokter untuk memperoleh penanganan.
2. Kolera
Penyakit ini menyebabkan penderitanya mengalami diare secara tiba-tiba dan sering, dehidrasi, mual dan muntah, serta
kram perut. Penyebabnya karena infeksi bakteri Vibrio cholerae yang memproduksi racun CTX sehingga menyebabkan
tubuh sulit menyerap air dan dikeluarkan dalam bentuk diare. Penularan bakteri ini bisa berasal dari makanan laut dari
perairan yang terkontaminasi dan tidak dimasak hingga matang. Jika mengalami gejala tersebut, segera dapatkan
pertolongan medis.
3. Disentri
Penyakit ini disebabkan oleh bakteri Shigella yang menginfeksi usus sehingga menyebabkan diare yang disertai darah dan
lendir. Disertai pula dengan gejala kram perut, mual, dan muntah. Bakteri Shigella berasal dari makanan atau minuman
yang kurang bersih. Segera dapatkan bantuan medis jika mengalami gejala penyakit ini.
4. Difteri
Penyakit ini disebabkan karena Corynebacterium diphtheria yang terhirup melalui udara dan menyerang selaput lendir
pada tenggorokan, hidung, hingga kulit. Gejalanya pilek yang awalnya cair kemudian jadi kental dan berdarah, terbentuk
lapisan abu-abu menutupi tenggorokan, suara serak, pembengkakan kelenjar limfa, demam dan menggigil. Segera
dapatkan perawatan medis sehingga kecil kemungkinan penyakit menular dan berakibat fatal mengancam jiwa.
5.  Tipes
Penyakit ini ditandai dengan demam tinggi hingga 40 derajat celcius, sakit perut, sembelit, atau diare. Penyebabnya adalah
bakteri Salmonella typhi yang menyerang sistem pencernaan dan berasal dari makanan yang terkontaminasi. Segera
dapatkan penanganan medis jika mengalami gejala penyakit tipes.
6. Tuberkulosis
Penyakit ini disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis yang menyerang paru-paru, atau juga menyerang tulang, otak,
ginjal, dan kulit. Penyakit ini dapat menular melalui percikan air liur dari penderita saat batuk dan terhirup orang lain.
Pengobatannya dengan minum obat anti tuberkulosis (OAT) selama minimal 6 bulan tanpa putus obat.
7. Kusta
Penyakit ini disebabkan oleh infeksi bakteri Mycobacterium leprae pada kulit, sistem saraf, selaput lendir, otot, hingga
mata. Akibatnya penderita akan mati rasa, tidak merasakan sakit, kelumpuhan otot kaki dan tangan, hingga kehilangan
jari-jari tangan. Penularannya melalui cairan hidung penderita ketika batuk atau bersin, serta ditularkan melalui hewan
armadillo dan simpanse.
8. Tetanus
Penyakit ini ditandai dengan gejala kejang, kekakuan otot rahang, kesulitan menelan, hingga rahang terkunci.
Penyebabnya berasal dari paparan spora bakteri Clostridium tetani pada luka kulit (luka bakar, terkena paku berkarat, atau
gigitan hewan). Untuk menghindari paparan bakteri ini, usahakan untuk memperoleh vaksinasi tetanus secara rutin.
9. Pneumonia
Penyakit ini disebabkan karena infeksi bakteri Streptococcus pneumoniae yang menyerang paru-paru dan menyebabkan
terjadinya pembengkakan pada kantung udara paru-paru (alveoli), sehingga berisi cairan nanah yang menyebabkan batuk
berdahak, kesulitan napas, dan demam. Oleh karena itu, penyakit ini juga disebut paru-paru basah. 
10. Meningitis
Penyakit ini bisa disebabkan karena bakteri maupun virus. Terdapat beberapa jenis bakteri yang menyebabkan penyakit
ini. Beberapa contoh bakteri tersebut adalah Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae,
Listeria monocytogenes, dan Staphylococcus aureus yang menyerang selaput pelindung otak dan tulang belakang.
Penyakit ini berpotensi merusak sistem saraf otak hingga berujung kematian.

2.2 Isolasi Dan Kultivasi Sel Murni

Mikroorganisme sebagai makhluk hidup sama dengan organisme hidup lainnya sangat memerlukan energi dan
bahan-bahan untuk membangun tubuhnya, seperti dalam sintesis protoplasma dan bagian-bagian sel lainnya. Bahan-bahan
tersebut disebut nutrien. Untuk memanfaatkan bahan-bahan tersebut, maka sel melakukan suatu kegiatan-kegiatan,
sehingga menyebabkan perubahan kimia di dalam selnya. Semua reaksi yang teratah yang berlangsung di dalam sel ini
disebut metabolisme. Metabolisme yang melibatkan berbagai macam reaksi di dalam sel tersebut, hanya dapat
berlangsung atas bantuan dari suatu senyawa organik yang disebut juga biokatalisator yang dinamakan enzim (Djide,
2006).

Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi
bioenergetik (reaksi yang menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan terdiri dari air, sumber
energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. “Selain itu, secara
umum nutrient dalam media pembenihan harus mengandung seluruh elemen yang penting untuk sintesis biologik
oranisme baru (Jawetz, 2001).
Saat ini media agar merupakan media yang sangat umum digunakan dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Media
agar ini memungkinkan untuk dilakukannya isolasi bakteri dari suatu sampel, karakterisasi morfologi, sampai
penghitungaan bakteri yang dikenal dengan nama total plate count. Bentuk koloni bakteri dan warna-warninya mudah
sekali dikenali dengan media ini dengan cara mengubah komposisi nutrien atau menambahkan indikator (Achmad, 2007).
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat hara (nutrien) yang berguna untuk membiakkan
mikroba. Dengan menggunakan bermacam-macam media dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat fisiologis
dan perhitungan sejumlah mikroba. Supaya mikroba dapat tumbuh baik dalam suatu media, maka medium tersebut harus
memenuhi syarat-syarat, antara lain : harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba, harus
mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan tumbuh,
tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum
digunakan, agar mikroba yang ditumbuhkan dapat tumbuh dengan baik    (Sutedjo, 1990).

Suatu medium yang mengandung substansi kompleks seperti ekstrak daging sapi, ekstrak khamir, tripton, dan
darah disebut sebagai medium buatan atau medium kompleks (artificial or complex medium). Sebagai lawannya, kita acu
medium yang rumus kimia masing-masing ramuannya dapat dituliskan sebagai medium sintesis (synthtetical medium)
atau medium yang ditentukan (difined medium). Medium sintesis mungkin sangat rumit dan sangat berbeda sesuai dengan
organisme tertentu yang hendak ditumbuhkan. Untuk sebagian besar, medium sintesis hanya digunakan untuk
menumbuhkan mikroorganisme di laboratorium penelitian (Volk & Wheeler, 1993).

Agar-agar, gelatin atau gel silika merupakan bahan untuk membuat medium menjadi padat. Namun, yang paling
umum digunakan adalah agar-agar. Meskipun bahan utama agar-agar adalah gelatin, yaitu suatu kompleks karbohidrat
yang diekstraksi dari alga marin genus gelidium, namun sebagian mikroorganisme tidak dapat menggunakannya sebagai
makanan sehingga agar-agar dapat berlaku hanya sebagai pemadat (Hadioetomo, 1993).

Untuk perhitungan mikroorganisme mungkin yang paling sering digunakan adalah prosedur penumbuhan dalam
agar. Secara sederhana suatu contoh suspensi sel atau bahan pangan homogenat diinokulasi ke dalam atau ke atas media
nutrien agar dan setelah diinkubasi, jumlah koloni yang terbentuk dihitung. Karena satu koloni menunjukkan jumlah sel
dalam larutan asalnya (Buckle, 1985).

Perhitungan secara penumbuhan dalam cawan petri dapat dilakukan dengan menggunakan tiga metode yaitu :
dalam metode penuangan, 1,0 ml contoh dipindahkan ke dasar cawan dan dituangkan diatasnya 15-20 ml media agar yang
telah didinginkan sampai 45o – 50oC dan dicampur serata mungkin. Setelah inkubasi, koloni baik yang tumbuh di dalam
agar atau dipermukaannya dihitung. Prosedur ini termasuk yang paling peka, sampai sejumlah 20 sel/ml dapat dihitung.
Metode ini tidak dapat diterapkan dalam studi lapangan karena dibutuhkan alat-alat untuk mencairkan dan mendinginkan
media agar. Berikutnya metode penyebaran pada permukaan cawan dilakukan dengan menggunakan 0,1 ml larutan contoh
disebaratakan di permukaan media agar yang tersedia dengan tongkat gelas yang melengkung (bent glass rod) yang telah
disterilkan. Setelah inkubasi, koloni yang tumbuh di permukaan dari media dihitung. Karena penggunaan volume larutan
yang sedikit yaitu 0,1 ml, maka kepekaannya sekitar 300 sel/ml. Oleh karena media agar dalam cawan telah disiapkan
lebih dahulu, maka metode ini dapat diterapkan dalam studi lapangan. Dan terakhir adalah metode penetesan pada cawan,
media yang dipersiapkan terlebih dahulu dibagi-bagi menjadi 3 atau 4 sektor dan setetes larutan contoh (0,02 ml)
dipindahkan ke masing-masing sektor. Setelah tetesan tersebut dibiarkan kering, cawan petri kemudian diinkubasi. Suatu
pipet penetes yang telah dikalibrasi dipergunakan untuk mengukur dan memindahkan tetesan. Pengenceran contoh diatur
sedemikian rupa sehingga diperoleh antara 5 sampai 20 koloni terbentuk dari setiap tetesan pada permukaan media agar.
Satu keuntungan metode ini adalah bahwa perhitungan dapat dilakukan 3-4 kali ulangan sekaligus dalam satu cawan,
sehingga dapat menghemat bahan-bahan untuk uji mikrobiologi. Contoh bahan yang mengandung sekecil 250 sel setiap
ml masih dapat dihitung dan teknik ini dapat diterapkan dalam percobaan-percobaan lapangan (Buckle, 1985).

Keragaman yang luas dalam hal tipe nutrisi diantara mikroorganisme diimbangi oleh tersedianya berbagai media
yang banyak macamnya untuk kultivasinya. Macam media yang tersedia dapat dikelompokkan dengan berbagai cara.
Selain menyediakan nutrien yang sesuai untuk kultivasi mikroorganisme, juga perlu disediakan kondisi fisik yang
memungkinkan pertumbuhan optimum. Mikroorganisme tidak hanya amat bervariasi dalam persyaratan nutrisinya, tetapi
juga menunjukkan respons yang berbeda-beda terhadap kondisi fisik di dalam lingkungannya. Untuk keberhasilan
kultivasi berbagai tipe bakteri, dibutuhkan satu kombinasi nutrien serta lingkungan fisik yang sesuai. Perkembangbiakkan
bakteri dipengaruhi beberapa faktor, yaitu ;
a. Suhu
b. Cahaya
c. Pengeringan (kelembaban)
d. Keasaman (pH)
e. Pengaruh O2 dari udara
f. Pengaruh tekanan osmotic
g. Pengaruh mikroorganisme disekitarnya
h. Pengaruh zat kimia

Pada mikroorganisme, pertumbuhan individu (sel) dapat berubah langsung menjadi pertumbuhan populasi. Sehingga batas
antara pertumbuhan sel sebagai individu serta satu kesatuan populasi yang kemudian terjadi kadang-kadang karena terlalu
cepat perubahannya, sulit untuk diamati dan dibedakan. Pada pertumbuhan populasi bakteri misalnya, merupakan
penggambaran jumlah sel atau massa sel yang terjadi pada saat tertentu. Kadang-kadang didapatkan bahwa konsentrasi sel
sesuai dengan jumlah sel perunit volume, sedang kerapatan sel adalah jumlah materi perunit volume.Penambahan dan
pertumbuhan jumlah sel mikroorganisme pada umumnya dapat digambarkan dalam bentuk kurva pertumbuhan. Fase
Pertumbuhan Mikroorganisme :

Secara umum fase-fase pertumbuhan mikroorganisme adalah sebagai berikut:

1. Fase lag (Masa persiapan, Adaptasi, Adaptation phase)
Pada fase ini laju pertumbuhan belum memperlihatkan pertumbuhan ekponensial, tetapi dalam tahap masa persiapan. Hal
ini tergantung dari kondisi permulaan, apabila mikroorganisme yang ditanami pada substrat atau medium yang sesuai,
maka pertumbuhan akan terjadi. Namun sebaliknya apabila diinokulasikan mikroorganisme yang sudah tua meskipun
makanannya cocok, maka pertumbuhannya mikroorganisme ini membutuhkan masa persiapan atau fase lag. Waktu yang
diperlukan pada fase ini digunakan untuk mensintesa enzim. Sehingga mencapai konsentrasi yang cukup untuk
melaksanakan pertumbuhan ekponensial. Fase ini berlangsung beberapa jam hingga beberapa hari, tergantung dari jenis
mikroorganisme serta lingkungan yang hidup. Selama fase ini perubahan bentuk dan pertumbuhan jumlah individu tidak
secara nyata terlihat. Karena fase ini dapat juga dinamakan sebagai fase adaptasi (penyesuaian) ataupun fase-pengaturan
jasad untuk suatu aktivitas didalam lingkungan yang mungkin baru.

2. Fase tumbuh dipercepat (Logaritme, Eksponensial, Logaritma phase)

Pada setiap akhir persiapan sel mikroorganisme akan membelah diri.masa ini disebut masa pertumbuhan, yang setiap
selnya tidak sama dalam waktu masa persiapan.Sehingga secara berangsur-angsur kenaikan jumlah populasi sel
mikroorganisme ini mencapai masa akhir fase pertumbuhan mikroorganisme.Setelah setiap individu menyesuaikan diri
dengan lingkungan baru selama fase lag, maka mulailah mengadakan perubahan bentuk dan meningkatkan jumlah
individu sel sehingga kurva meningkat dengan tajam (menanjak). Peningkatan ini harus diimbangi dengan banyak faktor,
antara lain:
- Faktor biologis, yaitu bentuk dan sifat jasad terhadap lingkungan yang ada, serta assosiasi kehidupan di antara jasad
yang ada kalau jumlah jenis lebih dari sebuah.
- Faktor non-biologis, antara lain kandungan sumber nutrien di dalam media, temperatur, kadar oksigen, cahaya, dan
lain sebagainya.Kalau faktor-faktor di atas optimal, maka peningkatan kurva akan nampak tajam seperti gambar. Pada
fase ini pertumbuhan secara teratur telah tercapai. Maka pertumbuhan secara ekponensial akan tercapai. Pada fase ini
menunjukkan kemampuan mikroorganisme berkembang biak secara maksimal.
Setiap sel mempunyai kemampuan hidup dan berkembang biak secara tepat. Fase pengurangan pertumbuhan akan terlihat
berupa keadaan puncak dari fase logaritmik sebelum mencapai fase stasioner, dimana penambahan jumlah individu mulai
berkurang atau menurun yang di sebabkan oleh banyak faktor, antara lain berkurangnya sumber nutrien di dalam media
tercapainya jumlah kejenuhan pertumbuhan jasad. Fase tumbuh reda akan terlihat dimana fase logaritma mencapai
puncaknya, maka zat-zat makanan yang diproduksi oleh setiap sel mikroorganisme akan mengakibatkan pertumbuhan
mikroorganisme, sehingga pada masa pertumbuhan ini reda atau dikatakan sebagai fase tumbuh reda.

3. Fase Stasioner
Pengurangan sumber nutrien serta faktor –faktor yang terkandung di dalam jasadnya sendiri, maka sampailah puncak
aktivitas pertumbuhan kepada titik yang tidak bisa dilampaui lagi, sehingga selama fase ini, gambaran grafik seakan
mendatar. Populasi jasad hidup di dalam keadaan yang maksimal stasioner yang konstan.

4. Fase Kematian
Fase ini diawali setelah jumlah mikroorganisme yang di hasilkan mencapai jumlah yang konstan, sehingga jumlah akhir
mikroorganisme tetap maksimum pada masa tertentu. Setelah masa dilampaui, maka secara perlahan-lahan jumlah sel
yang mati melebihi jumlah sel yang hidup. Fase ini disebut fase kematian dipercepat. Fase kematian dipercepat mengalami
penurunan jumlah sel, karena jumlah sel mikroorganisme mati. Namun penurunan jumlah sel tidak mencapai nol, sebab
sebagian kecil sel yang mampu beradaptasi dan tetap hidup dalam beberapa saat waktu tertentu. Pada fase ini merupakan
akhir dari suatu kurva dimana jumlah individu secara tajam akan menurun sehingga grafik tampaknya akan kembali ke
titik awal lagi. Gambaran pertumbuhan mikroorganisme seringkali tidak sesuai seperti yang sudah diterangkan kalau
faktor-faktor lingkungan yang menyertainya tidak memenuhi persyaratan.

2.2.1 Isolasi Sel Murni

Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan
sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Ada beberapa cara yang dapat dilakukan yaitu dengan cara goresan
(streak plate), cara tuang (pour plate), cara sebar (spread plate), dan mikromanipulator ( Buckle,1998).
Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan
organisme inangnya. Sumber bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai contoh fage
koli yang dijumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan
sentifugasi atau filtrasi bahan sumbernya dan penambahan klorofom (Adams,2000).

2.2.1.1 Pengembangan dalam cawan petri

Ada beberapa metode dalam pengembangan cawan petri yaitu ada Metode Cawan Gores (Streak Plate), Metode Cawan
Sebar (Spread Plate), Metode Teknik Delusi (Pengenceran). Dan berikut merupakan penjelasannya :

1. Metode Cawan Gores (Streak Plate)

Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah
proses isolasi. Cara ini dilakukan dengan membagi 3-4 cawan petri. Ose steril yang telah disiapkan diletakkan pada
sumber isolat , kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan petri berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4
kali membentuk garis horisontal disatu cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen. Setelah kering, ose tersebut
digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan ke dua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi
cawan tergores.
 Gambar Cawan Gores
Sumber : https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn
%3AANd9GcSygqR6omVPKCgFDcE2rPALgSXGCW8WgwEpfg&usqp=CAU

2. Metode Cawan Sebar (Spread Plate)

Teknik spread plate (cawan sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar
dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau menghapuskannya di atas media agar yang telah memadat, sedangkan
pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belom memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme
yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan agar.

3. Teknik Dilusi (Pengenceran)

Tujuan dari teknik ini adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah
penanganannya. Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam aquades steril. Teknik dilusi sangat penting
dalam analisa mikrobiologi karena hampir semua metode penelitian dan perhitungan jumlah sel mikroba menggunakan
teknik ini, seperti TPC (Total Plate Counter). Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik
penanaman bakteri (inokulasi), yaitu:
1. Menyiapkan ruangan
2. Pemindahan dengan pipet
3. Pemindahan dengan kawat inokulasi

Terbagi menjadi 2 metode yaitu cair dan padat :

1. Metode dilusi cair / broth dilution tes (serial dilution)

Metode ini mengukur MIC dan MBC (minimum inhibitory concentration atau kadar bunuh minimum,KBM). Cara yang
dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan
mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji
ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen
antimikroba, dan diunkubasi selama 18-24 jam . media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai
KBM.
 Sumber : https://aguskrisnoblog.wordpress.com/2011/01/14/pemanfaatan-mikroorganisme-sebagai-indikator-uji/

2.2.1.2 Tahap Sebelum Melakukan Teknik Penanaman Bakteri (Inokulasi)

Tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanamaan bakteri (inokulasi) yaitu ada menyiapkan ruangan,
pemindahan dengan pipet, dan pemindahan dengan kawat inokulasi sebagai berikut penjelasannya:

1. Menyiapkan Ruangan
Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan
atau percobaaan .dalam labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah
kotak kaca (encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar
ultraviolet (Pelczar, 1986).

2. Pemindahan Dengan Dengan Pipet

Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil
1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni (Pelczar, 1986).

3. Pemindahan Dengan Kawat Inokulasi

Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel .ujungnya boleh lurus juga boleh berupa kolongan yang
diametrnya 1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakteri kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya
tungkai cukup dilewatkan nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelczar, 1986).

2.2.1.3 Teknik Inokulasi

Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni mikroorganisme yaitu : Metode gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-
ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang
terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup
inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh
menjadi koloni (Winarni, 1997).

2.2.2 Kultivasi Sel Murni

2.2.2.1 Tujuan Kultivasi Mikroba
Mikroba merupakan organisme yang menarik untuk diteliti kehidupannya karena materi genetiknya yang cukup sederhana
dan peranannya yang besar dalam kehidupan manusia. Oleh karena itu, diciptakanlah suatu  metode kultivasi atau metode
pembiakan mikroba secara in vitro di laboratorium. Hal ini bertujuan untuk mengetahui atau mempelajari  pertumbuhan,
morfologi, dan sifat fisiologis mikroba. Beberapa indikasi kultivasi atau pembiakan pada laboratorium mikrobiologi
meliputi:

a. Pengasingan (isolasi) mikroba pada biakan bakteri

b. Menunjukkan sifat khas mikroba.
c. Untuk menentukan jenis mikroba yang diisolasi dengan cara-cara tertentu.
d. Mendapatkan bahan biakan yang cukup untuk membuat antigen dan percobaan serologi lainnya.
e. Menentukan kepekaan mikroba, khususnya yang bersifat patogenik terhadap antibiotik.
f. Menghitung jumlah mikroba.
g. Mempertahankan biakan mikroba, khususnya biakan murni.
Metode kultivasi merupakan metode untuk melipatgandakan jumlah mikroba dengan membiarkan mereka berkembang
biak dalam media biakan yang telah disiapkan di bawah kondisi laboratorium terkendali. Kultur mikroba digunakan untuk
menentukan jenis organisme dengan kelimpahan dalam sampel yang diuji, atau keduanya. Ini adalah salah satu metode
mikrobiologi yang digunakan sebagai metode diagnosis untuk menentukan penyebab penyakit infeksi dengan membiarkan
agen infeksi berkembang biak dalam media yang telah disiapkan, seperti yang tertuang dalam Postulat Koch.

2.2.2.2 Lingkungan Fisik Yang Mempengaruhi Kultivasi Mikroba

Untuk berhasilnya kultivasi mikroba diperlukan suatu kombinasi nutrisi serta lingkungan fisik yang sesuai. Menurut Hogg
(2013), ada beberapa lingkungan fisik yang perlu diperhatikan dalam menumbuhkan mikroba yaitu
temperatur, konsentrasi oksigen, pH, dan tekanan osmosis. Nutrisi dan ketentuan yang tersedia di laboratorium biasanya
merupakan cerminan dari yang ditemukan di habitat alami mikroba.

(1) Pengaruh temperatur terhadap pertumbuhan mikroba

Semua proses pertumbuhan tergantung pada reaksi kimiawi dan laju reaksi ini dipengaruhi oleh temperatur. Oleh karena
itu, pola pertumbuhan mikroba sangat dipengaruhi oleh temperatur. Temperatur juga mempengaruhi laju pertumbuhan dan
penambahan sel. Keragaman temperatur juga dapat mengubah proses-proses metabolik serta morfologi sel. Pengaruh
temperatur berhubungan dengan aktivitas enzim. Menurut Cowan (2012), kisaran suhu untuk pertumbuhan mikroba dibagi
menjadi suhu minimum, suhu optimum, dan suhu maksimum. Suhu minimum adalah suhu
terendah yang memungkinkan pertumbuhan mikroba dan metabolismenya, jika di bawah suhu ini pertumbuhan akan
terhambat. Suhu maksimum adalah suhu tertinggi di mana pertumbuhan dan metabolisme dapat dilanjutkan. Jika suhu
naik sedikit di atas maksimum, pertumbuhan akan berhenti, tapi jika terus meningkat melampaui titik itu, enzim dan asam
nukleat akhirnya akan denaturasi dan sel akan mati. Inilah sebabnya mengapa panas bekerja dengan baik sebagai
agen dalam kontrol mikroba. Suhu optimal merupakan suhu terbaik untuk pertumbuhan mikroorganisme.Berdasarkan
suhu pertumbuhannya menurut Cowan (2012), sifat mikroba dapat dikelompokkan menjadi 3 yaitu bersifat psikrofilik,
mesofilik, dan termofilik.
1.Psikrofilik adalah kelompok mikroorganisme yang dapattumbuh pada suhu 0-30derajatC dengan suhu optimumnya
sekitar 15derajatC.
2.Mesofilik adalah mikroorganisme yang tumbuh diatara suhu. Meskipun spesies individu dapat tumbuh pada suhu
ekstrem 10derajatC atau 50derajatC, suhu optimal antara kisaran dari 20derajatC hingga 40derajat C. organisme dalam
kelompok ini biasanya menghuni hewan dan tanaman serta tanah dan air di subtropics dan daerah tropis. Kebanyakan
pathogen pada manusia memiliki suhu optimal 30derajatC dan 40derajatC(suhu tubuh manusia adalah 37derajatC)
3.Termofilik adalah mikroba yang tumbuh optimal pada suhu lebih besar dari 45derajatC. Contohnya seperti mikroba
yang hidup di tanah dan air yang terkait dengan gunung berapi. Termofilik bervariasi dalam persyaratan panas, secara
umum kisaran pertumbuhan 45derajatC hingga 80derajatC. Sebagian besar bentuk sel eukariotik tidak dapat bertahan
diatas 60derajatC, tetapi bakteri termofilik ekstrim, tumbuh antara 80derajatC dan 121derajatC (saat ini dianggap batas
suhu yang ditetapkan oleh enzim dan struktur sel)

(2) Pengaruh konsentrasi oksigen

Mikroba memperlihatkan keragaman yang luas dalam hal respon terhadap oksigen bebas dan atas dasar ini maka mikroba
dibagi menjadi empat yaitu aerobic (memerlukan oksigen), anaerobik (tumbuh tanpa oksigen molekuler), anaerobik
fakultatif (tumbuh pada keadaan aerobik dan anaerobik), dan mikroaerofilik (tumbuh bila terdapat sedikit oksigen
atmosferik). Beberapa mikroba bersifat anaerobik obligat, bila terkena oksigen akan mati, oleh karena itu  untuk
menumbuhkan mikroba anaerobik diperlukan teknik khusus agar tercapai keadaan anaerob. Keperluan penumbuhan jasad
anaerob obligat dapat dipenuhi dengan menggunakan alat yang disebut anaerobic jar (Talaro,2012).

(3) Pengaruh Ph
Bagi kebanyakan mikroba pH minimum dan maksimum antara 4 sampai 9. Pertumbuhan mikroba sangat dipengaruhi oleh
pH, karena nilai pH sangat menentukan aktifitas enzim. pH berpengaruh terhadap sel dengan memengaruhi
metabolismenya. pH optimum pertumbuhan bagi kebanyakan bakteri terletak antara 6,5 dan 7,5 . Namun, beberapa
spesies dapat tumbuh dalam keadaan sangat asam, atau sangat alkalin. Menurut Talaro (2012), berdasarkan pH-nya
mikroba dapat dikelompokkan menjadi tiga, yaitu:
1. Mikroba asidofil adalah kelompok mikroba yang dapat hidup pada pH 2-5.
2. Mikroba neutrofil adalah kelompok mikroba yang dapat hidup pada pH 5,5-8.
3. Mikroba alkalifil adalah kelompok mikroba yang dapat hidup pada pH 8,4-9,5.
Bila bakteri dikultivasi di dalam suatu medium yang mula-mula disesuaikan pH-nya, misalnya 7, maka pH ini akan
berubah sebagai akibat adanya senyawa-senyawa asam atau basa yang dihasilkan selama pertumbuhannya. Pergeseran pH
ini dapat sedemikian besar sehingga menghambat pertumbuhan mikroba dalam kultur tersebut. Pergeseran pH dapat
dicegah dengan menggunakan larutan penyangga atau bufer dalam medium. Buffer merupakan senyawa yang dapat
menahan perubahan pH misalnya, KH 2PO4 dan CaCO3 . Beberapa bahan nutrien medium, seperti pepton, juga mempunyai
kapasitas penyangga. Perlu atau tidaknya suatu medium diberi larutan penyangga bergantung kepada penggunaannya dan
dibatasi oleh kapasitas menyangga yang dimiliki senyawa-senyawa yang digunakan (Madigan,2012).

(4) Pengaruh tekanan osmosis

Berdasarkan tekanan osmosis maka larutan tempat petumbuhan mikroba dapat digolongkan atas larutan hipotonis,
isotonis, dan larutan hipertonis. Mikroba biasanya hidup di lingkungan yang bersifat agak hipotonis sehingga air akan
mengalir dari lingkungannya ke dalam sel sehingga sel menjadi mengambang kaku. Adanya dinding sel dapat mencegah
pecahnya sel mikroba. Suatu tekanan osmosis akan sangat mempengaruhi bakteri jika tekanan osmosis lingkungan lebih
besar (hipertonis) sel akan mengalami plasmolisis.  Sebaliknya tekanan osmosis lingkungan yang hipotonis akan
menyebabkan sel membengkak dan juga dapat mengakibatkan rusaknya sel.  Oleh karena itu dalam mempertahankan
hidupnya, sel bakteri harus berada pada tingkat tekanan osmosis yang sesuai. Walaupun sel bakteri memiliki daya
adaptasi, perbedaan tekanan osmosis dengan lingkungannya tidak boleh terlalu besar. Berdasarkan tekanan osmose yang
diperlukan menurut Madigan (2012), mikroba dapat dikelompokkan menjadi tiga yaitu sebagai berikut:
1.Mikroba osmofil adalah mikroba yang tumbuh pada kadar gula yang tinggi.
2.Mikroba halofil adalah mikroba yang dapat tumbuh pada kadar garam halogen yang tinggi.
3.Mikroba halodurik adalah mikroba yang dapat bertahan, tetapi tidak tumbuh pada kadar garam yang tinggi.

2.2.2.3 Metode Kultivasi Mikroba

Di habitat alaminya, mikroorganisme biasanya tumbuh dalam populasi yang kompleks dan terdiri dari beberapa spesies.
Hal ini menyebabkan penelitian mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat menjadi sulit untuk dilakukan. Oleh
karena itu, diperlukan suatu teknik untuk memisahkan populasi yang kompleks ini menjadi spesies yang berbeda-beda
sebagai biakan murni. Biakan murni adalah suatu populasi sel yang ditumbuhkan dari satu sel induk. Proses isolasi dan
upaya mempertahankan keadaan murni memerlukan teknik aseptik . Oleh karena itu, sebelum mengkultur suatu mikroba
harus dilakukan suatu proses sterilisasi.

1. Sterilisasi
Menurut Madigan (2012), Sterilisasi yang umum dilakukan dalam bidang mikrobiologi adalah sterilisasi secara
fisik,secara kimia, dan juga secara mekanik penjelasannya sebagai berikut:
a. Sterilisasi secara fisik
Sterilisasi secara fisik dilakukan dengan menggunakan uap air panas dan tekanan tinggi, misalnya dengan penggunaan
autoklaf pada temperatur 121 0C dan tekanan 1.5 atm selama 15 hingga 20 menit.
b. Sterilisasi secara kimia
Larutan kimia yang banyak digunakan dalam proses sterilisasi adalah larutan CuSO 4, AgNO3, HgCl2, ZnO, dan
alkohol (kadar 50-75 %) karena dapat menyebabkan koagulasi protein mikroba. Selain itu, basa kuat dan asam kuat
juga dapat digunakan karena mampu menghidrolisis mikroba. Sterilisasi pada substrat dapat dilakukan dengan
menggunakan larutan garam seperti NaCl (9%), KCl ( 11%), KNO 3 (10%),  KMnO4 (10%), dan HCl (1,1%). Khor dan
senyawa khlorin digunakan sebagai desinfektan, terutama pada tempat penyimpanan air. Larutan formaldehyda
dengan kadar 4 – 20% juga dapat digunakan dalam sterilisasi secara kimia.
c. Sterilisasi secara mekanik
Sterilisasi secara mekanik dilakukan dengan menggunakan filter. Jenis filter yang digunakan tergantung dari tujuan
penyaringan dan bahan yang akan disaring. Sterilisasi secara mekanik umumnya dilakukan pada bahan yang tidak
tahan pada pemanasan ataupun tekanan yang tinggi.

2. Teknik Kultivasi Mikroba

Setelah semua bahan dan alat yang akan digunakan dalam proses kultivasi disterilkan, maka dimulailah proses isolasi
untuk mendapatkan biakan murni. Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum. Di bawah ini ada beberapa
teknik inokulasi yang umum dilakukan di laboratorium mikrobiologi.
a. Teknik Penyebaran (The Spread-Plate Technique)
Teknik penyebaran yang lebih sering disebut dengan Spread-Plate adalah teknik langsung dan mudah untuk
mendapatkan suatu biakan murni. Di bawah ini adalah gambar saat menginokulasi mikroba dengan menggunakan
teknik Spread-Plate.

Gambar 1. Teknik Spread-Plate

Sumber : http://kuliahbiologimurni.blogspot.com/2015/10/kultivasi-mikroorganisme.html
 Campuran dari beberapa spesies bakteri disebarkan di permukaan medium agar, sehingga setiap sel akan tumbuh
menjadi koloni yang terpisah sempurna dan dapat dilihat secara makroskopis berupa kumpulan mikroba di atas
medium padat. Setiap koloni yang terbentuk merupakan biakan murni.

b. Teknik Goresan (The Streak-Plate Technique)

Biakan murni juga dapat diperoleh dengan teknik goresan (Streak-Plate Technique). Inokulum digoreskan di atas
medium dengan memakai ose menurut pola tertentu, yaitu goresan T, goresan kuadran, goresan radian, dan goresan
sinambung. Setelah inkubasi, sel-sel mikroba memperbanyak diri dan dalam waktu 18-24 jam akan terbentuk suatu
massa sel yang disebut koloni. Koloni yang terbentuk ini adalah biakan murni. Di bawah ini adalah hasil kultivasi
berupa biakan murni yang diperoleh dengan teknik goresan.

Gambar 2. Biakan murni yang terbentuk dengan menggunakan teknik goresan

Sumber : http://kuliahbiologimurni.blogspot.com/2015/10/kultivasi-mikroorganisme.html

c. Teknik lempeng tuang (Pour Plate Technique)

Teknik pour-plate (lempeng tuang) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar
dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada
uji TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada
media agar. Kultivasi mikroba dengan teknik ini dimulai dengan mengencerkan kultur bakteri yang telah ada dengan
aquades. Selanjutnya, diaduk hingga rata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa
kali. Larutan dilusi tadi sebanyak + 1 ml dituang ke dalam cawan petri. Cawan petri diputar secara perlahan-lahan di
atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. Terakhir, inkubasi kultur ini
pada kondisi yang sesuai. Tahapan di atas diilustrasikan pada gambar di bawah ini:

Gambar 3. Teknik Pour-Plate

Sumber : http://kuliahbiologimurni.blogspot.com/2015/10/kultivasi-mikroorganisme.html

Biakan murni yang dihasilkan, jika disimpan dalam jangka waktu yang lama akan mudah sekali mengalami mutasi. Ini
berarti, biakan murni yang disimpan terlalu lama bukan lagi biakan murni yang semula. Oleh karena itu, ada beberapa
hal yang harus dilakukan untuk mencegah atau setidaknya mengurangi kemungkinan terjadinya mutasi, yaitu:
1. Secara periodik, biakan harus dipindahkan ke medium baru, sebaiknya pemindahan dilakukan pada fase log.
2. Biakan harus disimpan pada suhu rendah dan terhindar dari radiasi.Mikroba diliofilisasikan, yaitu dimasukkan
dalam ampul berisis susu kering bercampur CO 2 kemudian disimpan pada tempat bersuhu rendah.

2.2.2.4 Karakteristik Biakan Mikroba

Karakteristik pertumbuhan mikroba dalam medium pertumbuhan menunjukkan morfologi, mekanisme pembelahan, dan
aktivitas metabolismenya. Pertumbuhan antara medium cair dan medium padat memberikan bentuk dan karakteristik yang
berbeda.
Pada biakan di medium cair, karakteristik yang ditimbulkan oleh pertumbuhan mikroba, yaitu:
1. Terbentuk endapan yang menunjukkan sel mikroba membentuk agregat sehingga berat dan mengendap,
misalnya Staphylococcus aureus.
2. Terbentuk pelikel yang disebabkan karena mikroba memiliki pili atau glikokaliks yang menyebabkan sel yang satu
melekat dengan yang  lain, misalnya Mycobacterium phlei.
3. Terlihat keruh yang menunjukkan bahwa mikroba yang tumbuh tersebar merata dan biasanya mikrobanya bersifat
motil.

Pada biakan di medium padat, karakteristik yang ditimbulkan oleh pertumbuhan mikroba adalah dengan terbentuknya
suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk itu merupakan ciri
khas bagi suatu spesies tertentu. Pengamatan mikroba dapat dilakukan secara individual, satu persatu, maupun secara
kelompok dalam bentuk koloni, dan sifat-sifatnya dapat diketahui melalui koloni yang tumbuh di medium permukaannya.
Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media,
diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan permukaan koloni.

Koloni yang tumbuh terpisah ditumbuhkan kembali untuk mendapatkan isolat murni. Isolasi murni dilakukan dengan
mengoleskan ose steril pada koloni dalam kultur campuran yang benar-benar terpisah satu sama lain. Olesan tersebut
digores pada media padat agar miring dalam tabung reaksi. Koloni yang tumbuh dalam media ini merupakan isolat murni,
yang hanya berasal dari satu jenis bakteri saja. Koloni yang tumbuh dapat dikarakterisasi berdasarkan tipe
pertumbuhannya pada media agar miring.

2.3 Preservasi Sel Murni

Preservasi adalah kegiatan untuk melestarikan sesuatu untuk tujuan tertentu. Kegiatan preservasi bisa diartikan
merawat (maintain), dan membangun ulang (rebuild). Sehingga Preservasi bisa diartikan adalah melestarikan suatu objek,
baik dengan merawat (jika objek tersebut masih utuh sesuai aslinya) maupun membangun ulang objek tersebut (jika objek
tersebut sudah rusak hilang sama sekali). Tujuan mempreservasi adalah untuk menjadikan suatu objek, biasanya yang
mempunyai nilai historis yang tinggi agar tetap seperti adanya dengan maksud untuk dijadikan sebagai pelajaran, acuan,
maupun bahan kajian yang bernilai historis. Preservasi mikroba hasil koleksi dilakukan untuk penyimpanan jangka pendek
dan
Para ilmuwan perlu memiliki metode pembuatan dan penyimpanan koleksi (preservasi) yang sesuai untuk menjaya
agar biakan mikroba tetap hidup, ciri-ciri genetiknya tetap stabil dan tidak berubah, serta hema biaya dan tenaga. Metode
yang dipilih Sangat tergantung pada sifat mikroba dan tujuan preservasi Sifat mikroba tercermin dalam:
a) Ciri-ciri morfologi : mikroba yang beragam (virus, bakteri, jamur, nematoda, algae, khamir, dan protozoa)
b) Ciri-ciri fisiologi dan biokimia mikroba
c) Kemampuan mikroba bertahun hidup baik dalam lingkungan alaminya maupun lingkungan buatan

Tujuan koleksi dan preservasi meliputi tujuan jangka pendek dan jangka panjang. Preservasi jangka pendek dilakukan
untuk keperluan rutin penelitian yang disesuaikan dengan kegiatan program atau proyek tertentu. Preservasi jangka
panjang dilakukan dalam kaitannya dengan koleksi dan konservasi plasma nutfah mikroba, sehingga apabila suatu saat
diperlukan, dapat diperoleh kembali atau dalam keadaan tersedia. Dalam kaitannya dengan pemanfaatan koleksi mikroba,
tujuan koleksi dan preservasi mikroba dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu untuk keperluan pribadi atau lembaga non-
komersial dan lembaga atau swasta komersial.
Keberhasilan pembuatan koleksi plasma nutfah mikroba tergantung pada tiga faktor, yaitu:
a) Penguasaan teknologi,
b) Ketersediaan fasilitas preservasi,
c) Ketersediaan tenaga terampil, tekun, dan rutin

Penentuan teknik penyimpanan atau pengawetan mikroba memerlukan penelitian yang rumit, jangka waktu lama, dan
pemantauan serta dana yang besar. Hal ini berkaitan dengan tujuan utama preservasi, yaitu:
a) mereduksi atau mengurangi laju metabolisme dari mikroorganisme hingga sekecil mungkin dengan tetap
mempertahankan viabilitas (daya hidupnya)
b) Memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan (recovery) dan kehidupan (survival) yang
tinggi dengan perubahan ciri-ciri yang minimum

Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan secara berkala jangka pendek misalnya sebulan
sekali dari media lama ke media baru. Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak. Beberapa teknik
penyimpanan sederhana yang efektif untuk penyimpanan isolat jangka pendek atau menengah, dan biasanya tidak sesuai
untuk penyimpanan jangka panjang. Di antara teknik tersebut ialah penyimpanan dalam minyak mineral, parafin cair,
tanah steril, air steril, manik-manik porselin. Lempengan gelatin, dan P2O5 dalam keadaan vakum. Walaupun tidak
digunakan secara luas, teknik tersebut hanya memerlukan peralatan yang sederhana dan mudah diperoleh, sehingga dapat
bermanfaat bagi lembaga yang belum memiliki peralatan canggih.

Metode penyimpanan jangka panjang yang paling efektif dan banyak dilakukan ialah metode liofilisasi atau kering beku
(liophyization atau freeze drying) dan kriopreservasi (cryoservation cryogenic preservation) (Clark, 1976, Ashwol- Smith
dan Farrant, 1980). Kedua teknik tersebut dilaporkan paling berhasil untuk penyimpanan jangka panjang berbagai
mikroba. Kendala utamanya adalah tidak semua laboratorium mempunyai peralatan tersebut.

Tahapan dalam pembuatan koleksi dan preservasi plasma nutfah mikroba pada dasarnya sama, yaitu meliputi koleksi
contoh mikroba, isolasi (pemurnian), dan karakterisasi isolat, preservasi, pemeliharaan dan pembuatan bank data.
2.3.1 Teknik Penyimpanan Dan Pemeliharaan

Gambar Teknik Penyimpanan Mikroorganisme

Sumber: dokumen.tips

2.3.1.1 Peremajaan Berkala

Peremajaan dengan cara memindahkan atau memperbaru biakan mikroba dari biakan lama ke medium tumbuh yang baru
secara berkala, misalnya sebulan atau dua bulan sekali. Teknik ini merupakan cara paling tradisional yang digunakan
peneliti untuk memelihara koleksi isolat mikroba di laboratorium. Cara ini juga digunakan untuk penyimpanan dan
pemeliharaan isolat mikroba yang belum diketahui cara penyimpanan jangka panjangnya. Peremajaan berkala tidak
dianjurkan untuk penyimpanan jangka panjang.Teknik ini mempunyai berbagai kendala, antaranya:
a) Kemungkinan terjadi perubahan genetik melalui seleksi varian
b) Peluang terjadinya kontaminasi,
c) Terjadi kekeliruan pemberian label

Kendala tersebut memberi peluang yang lebih besar terjadinya kehilangan isolate dibandingkan dengan teknik lain.
Meskipun demikian, banyak bakteri dan jamur yang dapat bertahan hidup dalam tabung agar miring yang tertutup rapat
hingga sepuluh tahun atau lebih baik di dalam suhu ruang maupun di kulkas.
2.3.1.2 Penyimpanan dalam Akuades Steril

Gambar Aquades
Sumber: tokoalatperaga.co.id

Beberapa jenis bakteri, terutama yang berbentuk batang dan bereaksi Gram negatif seperti Pseudomonas dapat disimpan
cukup lama dalam akuades steril pada suhu ruang atau suhu 10-150c. Tidak semua bakteri dapat disimpan dengan baik
menggunakan cara ini, misalnya pada anggota genus Pseudomonas, Agrobacterium, dan Curtobacterium. Pada kondisi
penyimpanan ini bakteri yang disimpan masih berpeluang tumbuh dengan lambat, sehingga tidak dupat dijamin stabilitas
genetiknya untuk jangka panjang. Penyimpanan dengan cara ini juga memungkinkan terjadinya kontaminasi. Oleh karena
itu, cara ini lebih dianjurkan sebagai alternatif penyimpanan jangka sedang atau sebagai pendamping penyimpanan jangka
panjang.

Tahap penyimpanan mikroba dalam aquades steril adalah sebagai berikut:

a) Akuades steril disiapkan dalam botol dengan tutup berdrat ukuran 25 ml, 5-10 ml/botol
b) Mikroba yang akan disimpan ditumbuhkan dalam bentuk biakan murni pada medium agar miring yang sesuai.
c) Biakan bakteri berumur 24-48 jam disimpan dengan beberapa cara seperti:
1. Menambahkan 3.-5 ml aquades steril ke dalam bikan miring, mengocok tabung hingga diperoleh suspense pekat
bakteri (108-109 sel/ml), dan memindahkan I ml suspensi ke dalam tiap botol yang berisi air steril.
2. Memindahkan satu ose biakan miring bakteri ke dalam tabung reaksi herisi 3-5 ml akuades steril, tabung dikocok
hingga suspensi merata, dan memindahkan I mi suspense ke dalam tiap botol yang berisi air steril.
 3. Memindahkan satu ose biakan miring bakteri langsung ke dalam tiap botol yang berisi air steril dan mengocok
hingga merata
d) Botol ditutup rapat dan disimpan pada suhu ruang atau suhu 10-15°C.
e) Ujii viabilitas mikroba dan pemeliharaan stok isolat dilakukan secara rutin
f) Penumbuhan kembali biakan dilakukan dengan mengambil botol dari tempat penyimpanan, mengocok, dan
mengambil satu ose suspense dan menumbuhkan pada medium cair atau langsung pada medium agar yang sesuai

2.3.1.3 Penyimpanan dalam Minyak Mineral

Gambar Minyak mineral

Sumber: id.wikipedia.org

Salah satu cara sederhana untuk memelihara biakan bakteri, khamir dan jamur adalah dengan cara menyimpan dalam
tabung agar miring dan menutup dengan minyak mineral atau parafin cair. Dasar teknik penyimpanan ini adalah
mempertahankan viabilitas mikroba dengan mencegah pengeringan medium, sehingga waktu peremajaan dapat
diperpanjang hingga beberapa tahun. Beberapa jenis jamur dapat bertahan hidup sampai 20 tahun. Daya tahan hidup
mikroba lebih baik apabila biakan disimpan pada suhu kulkas (4C).

Mikroba yang akan dipelihara ditumbuhkan pada tabung berisi medium agar miring atau medium cair (broth) yang sesuai,
kemudian permukaan biakan ditutup dengan minyak mineral steril setinggi 10-20 mm dari permukaan atas medium.
Teknik ini sederhana, tetapi kurang praktis untuk di transportasi. Disamping itu, keberadaan minyak mineral
mengakibatkan peremajaan menjadi kotor.

Cara penyimpanan dalam minyak mineral menurut Elliot (1975) adalah sebagai berikut:
a) Penyediaan tabung reaksi dengan tutup berdrat atau botol McCartney berisi medium agar miring yang sesuai untuk
mikroba yang akan dipelihara.
b) Penyediaan minyak mineral atau parafin cair steril, autoklaf pada suhu 121°C selama 60 menit
c) Menumbuhkan mikroba yang akan disimpan dalam tabung agar miring selama 24-48 jam dan memeriksa kemurnian
biakan untuk menghindari kontaminasi.
d) Setelah mikroba tumbuh buik, parafin cair steril dimasukkan ke dalam botol secukupnya, sehingga permukaan parafin
atas berada 10-20 mm di atas permukaan medium agar.
e) Botol biakan yang telah diberi parafin cair disimpan pada suhu ruang atau di kulkas.
f) Uji viabilitas mikroba dan pemeliharaan isolat dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap tahun
g) Penumbuhan kembali (recovery) mikroba (bakteri. Khamir) dilakukan dengan cara mengambil secara aseptik sebagian
bakar dari tabung, memindahkan dan mensuspensikan pada medium cair. Minyak mineral mengapung di permukaan
suspensi dan sebagian suspensi digoreskan pada medium agar yang sesuai. Biakan jamur digoreskan langsung pada
medium agar

2.2.1.4 Penyimpanan dalam Tanah Steril

Banyak bakteri dan jamur yang dapat bertahan hidup dengan baik pada tanah kering yang disimpan pada suhu ruang untuk
waktu yang lama, hingga 20 tahun atau lebih. Teknik penyimpanan mikroba pada tanah kering terutama berguna untuk
fungi, Streptomyces spp., dan bakteri yang membentuk spora seperti Bacillus spp. Dan Clostridium spp. Rhizobium spp.
Juga dapat disimpan dengan baik dengan cara ini.

Teknik ini mempunyai beberapa keuntungan, yaitu biaya murah, penyimpanan pada suhu ruang, dan stabilitas genetik
mikroba dapat dipertahankan. Cara penyimpanan dalam tanah steril adalah sebagai berikut:
a) Diambil tanah yang agak liat dikeringkan dan diayak untuk memisahkan membuang sisa-sisa tanaman.
b) Tanah yang sudah kering dan diayak dimasukkan ke dalam tabung atau botol dengan tutup berdrat ukuran 25 ml
hingga 1 cm dari permukaan tutup
c) Tabung atau botol yang berisi tanah diberi akuades steril hingga kebasahan 50% kapasitas lapang, kemudian
diautoklaf nada suhu 121” tiga kali berturut-turut selama tiga hari masing-masing selama satu jam.
d) Bilamana diperlukan, sterilitas tanah diuji dengan menumbuhkan contoh tanah pada medium agar.
e) Selanjutnya, botol di oven kering pada suhu 105°C selama satu jam dan setelah dingin disimpan di dalam desikator
hingga digunakan.
f) Suspensi mikroba yang akan disimpan (sel, spora atau konidia, miselia) dibuat dalam larutan steril pepton 2% dalam
akuades.
g) Suspensi mikroba (0,1 ml) diambil dengan pipet steril dan dimusukkan ke dalam tiap botol yang telah disiapkan.
h) Botol dikembalikan ke desikator untuk disimpan dalamnya atau setelah kering diambil dan disimpan di ruangan .
i) Mikroba yang disimpan diuji viabilitasnya setiap tahun dengan menumbuhkan pada medium agar.

Penumbuhan kembali bakteri dilakukan dengan cara mengambil secara aseptik sebagian contoh tanah dari botol
penyimpanan, memindahkan ke medium cuir diikuti dengan menggoreskan suspensi medium cair pada medium agar yang
sesuai atau langsung dengan menumbuhkan contoh tanah pada medium agar.

2.3.1.5 Penyimpanan dengan Manik-Manik Porselin

Gambar Manik-Manik Porselin

Sumber: Abuihalib.wordpress.com

Cara sederhana lain untuk pemeliharaan berbagai jenis mikroba adalah mengeringkan suspensi sel pada manik-manik
Porselin (porcelain heads) atau gelas (glass beads) menggunakan gel silika sebagai pengering. Selapis gel silika diletakkan
di alas botol dengan tutup berdrat, kemudian di atasnya ditutup dengan lapisan kapas atau slag wool dan di atasnya
diletakkan manik-manik porselin atau kaca yang diimpregnasi dan telah dicelupkan dalam suspense mikroba yang akan
disimpan. Kelembaban yang ada pada manik-manik diserap oleh gel silika yang ada di bawahnya. Kelebihan gel silika
juga berfungsi menjaga kekeringan udara di dalam botol.

Prosedur penyimpanan dan pemeliharaan dengan manik-manik porselin adalah sebagai berikut:
a. Gel silika berwarna biru bila kering dan ungu bila lembab) sebanyak 3-4 g dimasukkan ke dalam botol tutup berdrat
ukuran 25 ml.
b. Di atas gel silika dilapisi kapas atau slag wool setebal 1 em agar tidak bergerak tetapi tetap berpori.
c. Di atas lapisan kapas diletakkan 20-50 manik-manik porselin atau gelas yang diimpregnasi
d. Botol dibuka tutupnya dan disterilkan dengan oven kering suhu 160”C selama 1-2 jam. Tutup botol karena d. Berlapis
karet disterilkan dengan autoklaf, suhu 121 C selama 15 menit kemudian di oven kering dengan suhu 100 C selama 1
jam, dan setelah dingin ditutupkan ke botolnya secara aseptik.
e. Mikroba yang akan disimpan dibiakkan 24-48 jam dalam tabung reaksi yang berisi 1 ml medium cair yang sesuai.
f. Manik-manik porselin dituangkan ke dalam tabung reaksi yang berisi biakan mikroba dan kelebihan suspensi bakteri
dibuang.
g. Manik-manik yang basah oleh suspensi bakteri dikembalikan ke dalam botol silika di dalam botol akan berubah warna
menjadi merah jambu, sedangkan sisanya tetap berwarna biru Apabila seluruh gel silika berubah warna menjadi merah
jambu, hendaknya botol tidak digunakan.
h. Botol yang berisi mikroba disimpan pada suhu ruang atau di kulkas.
i. Uji viabilitas bakteri dilakukan secara periodik dan rutin paling tidak setiap tahun.
j. Penumbuhan kembali bakteri dilakukan dengan cara mengambil secara aseptik satu manik-manik botol penyimpanan,
memindahkannya ke medium cair atau dengan menggoreskan suspensi medium cair pada medium agar yang sesuai
dan diinkubasikan pada suhu optimal.

Menurut Leben dan Sleesman (1982) penyimpanan dengan manik manik porselin dapat diganti dengan butiran gel silika.

2.3.1.6 Penyimpanan Menggunakan Lempengan Gelatin

 Gambar Gelatin bubuk
Sumber: mamanatural.com

Teknik penyimpanan ini sederhana, tetapi sangat efektif untuk penyimpanan bakteri. Mula-mula teknik ini dilaporkan oleh
Stamp pada tahun 1947 . Untuk penyimpanan jangka panjang bakteri. Tetapi saat ini sangat sedikit data lentang
keefektifan penyimpanan dan daya tuhan hidup bakteri dalam penyimpanan, sehingga teknik ini perlu diuji lebih lanjut.
Tahapan teknik penyimpanan dengan lempengan gelatin adalah sebagai berikut:
a) Sepuluh mililiter lilin (paraffin wax) disterilkan dulum cawan petri dan dibiarkan memadat. Sebagai pengganti lilin
dapat juga digunakan kertas lilin atau cairan silicon yang ditempatkan pada alas cawan petri.
b) Biakan bakteri umur 24-48 jam disediakan dan dibuat suspense pekat bakteri (118-109 sel/ml) dalam medium gelatin
nutrient 10% yang mengandung 0.25% asam askorbat.
c) Suspensi bakteri dalam medium gelatin nutrien diteteskan secara aseptik menggunakan pipet Pasteur steril pada
permukaan lilin atau kertas lilin di dalam cawan petri. Setiap petri dapat ditetesi beberapa tetes suspensi.
d) Cawan petri yang telah diberi tetesan suspensi bakteri dimasukkan ke dalam desikator vakum yang berisi P O dan
dievakuasi hingga tetesan menjadi kering dan berupa lempengan gelatin.
e) Lempengan gelatin diambil secara aseptik menggunakan pinset dan dipindahkan ke dalam botol steril dengan tutup
berdrat 5-10 lempengan/botol. Botol-botol yang berisi lempengan gelatin disimpan dalam wadah yang berisi P2O5
pada suhu 4°C.
f) Uji viabilitas bakteri dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap tahun.
g) Penumbuhan kembali bakteri dilakul dengan cara mengambil secara aseptik satu lempengan gelatin dari botol
penyimpanan, memindahkannya ke medium cair, kemudian menggoreskan suspensi medium cair pada medium agar
yang sesuai, serta menginkubasikan pada suhu optimal untuk pertumbuhan mikroba.

2.3.1.7 Penyimpanan Menggunakan Potongan Kertas Filter

Gambar Kertas filter

Sumber: tokopedia.com

Teknik penyimpanan ini mirip teknik penyimpanan dengan lempengan gelatin. Sebagai pengganti lempengan gelatin
digunakan bundaran potongan kertas filter steril. Teknik ini juga sederhana dan mudah, tetapi sangat efektif untuk
penyimpanan bakteri. Namun demikian, data tentang keefektifan penyimpanan dan daya tahan hidup bakteri dalam
penyimpanan masih sedikit, sehingga perlu diteliti lebih lanjut.
Tahapan teknik penyimpanan bakteri menggunakan potongan kertas filter menurut Sty (1983) adalah sebagai berikut:
a) Mikroba yang akan disimpan dibiakkan pada medium yang sesuai.
b) Suspensi pekat bakteri (108-109 sel/ml) dibuat dalam larutan pepton 1"6, susu skim 1%, atau Na-glutamat 1%.
c) Bundaran kertas steril dibuat dengan alat pelubang kertas, dimasukkan ke dalam botol kecil ukuran 10 ml dengan
tutup berdrat, 25-50 bundaran kertas filter/botol. Botol disterilkan dengan oven 105°C selama 1 jam
d) Beberapa tetes suspensi mikroba dimasukkan secara aseptic ke dalam botol yang berisi kertas filter hingga menjadi
jenuh air.
e) Isi botol dikeringvakumkan menggunakan alat vacuum freeze dryer, kemudian ditutup rapat dan disimpan pada suhu
ruang atau di kulkas.
f) Uji viabilitas bakteri dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap tahun.
g) Penumbuhan kembali bakteri dilakukan dengan cara mengambil secara aseptik satu bundaran kertas filter dari botol
penyimpanan, memindahkannya ke medium cair, menggoreskan suspensi medium cair pada medium agar yang sesuai,
serta menginkubasikan pada suhu optimal untuk pertumbuhan mikroba.

2.3.1.8 Penyimpanan in Vacuo dalam Gas Fosfor Pentaoksida

Gambar In Vacuo
Sumber: umich.edu

Teknik penyimpanan ini disebut juga teknik Sordelli, karena mula-mula ditemukan oleh Sordelli. Biakan mikroba
disimpan dalam serum kuda yang ditempatkan dalam tabung gelas kecil atau ampul. Tabung ini ditempatkan di dalam
tabung lain yang lebih besar berisi sedikit fosfor pentaoksida (P205) dan disimpan pada suhu ruang atau di kulkas. Teknik
ini sesuai untuk penyimpanan jangka panjang bakteri, khamir, dan jamur. Mikroba tersebut dapat bertahan hidup dengan
baik selama 5-28 tahun, tergantung pada strain mikroba yang disimpan.
Tahap penyimpanan in vacuo dalam senyawa P2O5 menurut Sordelli adalah sebagai berikut:
a) Mikroba yang akan disimpan dibiakkan pada medium agar miring yang sesuai.
b) Suspensi pekat mikroba disediakan dari biakan mikroba menggunakan cairan steril serum kuda dalam tabung steril.
c) Suspensi biakan (0,1-0,5 ml) dimasukkan ke dalam ampul atau botol kecil steril dan ditutup rapat.
d) Ampul atau botol yang berisi suspensi mikroba dimasukkan ke dalam botol yang lebih besar yang sebelumnya telah
diisi P2O5 secukupnya.
e) Bagian luar tabung besar dipersempit dengan pemanasan api las, kemudian dipasang pada pompa vakum. Dievakuasi,
dan ditutup dengan pemanasan api las.
f) Tabung yang berisi mikroba disimpan pada suhu ruang atau di kulkas.
g) Uji viabilitas bakteri dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap tahun.
h) Penumbuhan kembali mikroba dilakukan dengan cara memotong tabung gelas dengan pemotong kaca dan
i) Mengambil tabung kecil yang ada di dalamnya. Tabung dibuka dan isinya disuspensikan dengan menambahkan
akuades steril atau medium cair, kemudian menggo-reskan suspensi medium cair pada medium agar yang sesuai.

2.3.1.9 Penyimpanan dengan Teknik Kering Beku

Teknik kering beku atau teknik liofilisasi merupakan teknik penyimpanan yang paling popular dan banyak digunakan
untuk penyimpanan jangka panjang mikroba. Teknik ini cocok untuk menyimpan berbagai jenis mikroorganisme termasuk
virus, bakteri, khamir, jamur berspor dan jamur yang tidak bersporn, bahkan algae dan protozoa. Bagi lembaga koleksi
dan pemasok biakan mikroba, teknik ini juga sangat sesuai, karena ampul dalam jumlah besar dapat diproduksi dan
dengan mudah disebarluaskan. Banyak biakan mikroba yang disimpan dengan cara dapat bertahan hidup hingga puluhan
tahun, tetapi beberapa mikroba memerlukan media pengawet tertentu yang sesuai.

Teknik kering beku merupakan teknik yang paling rumit apabila dibandingkan dengan beberapa teknik penyimpanan lain,
karena teknik ini memerlukan keterampilan teknis dan modal dasar yang relative tinggi untuk membeli peralatan
pengering beku (freeze dryer). Namun, apabila peralatan tersedia, maka teknik ini menjadi sederhana dan sangat
memuaskan. Sesungguhnya alat pengering beku tidak selalu merupakan alat yang canggih dan mahal, karena peralatan
yang sederhana dapat dirakit sendiri dengan mengkombinasikan pompa vakum dan kompresor pendingin.

Saat ini berbagai model alat pengering beku dijumpai di pasaran yang harganya terjangkau oleh suatu lembaga penelitian.
Proses kering beku merupakan kombinasi dua teknik penyimpanan jangka panjang yang paling baik, yaitu pembekuan dan
pengeringan Garis besar tahapan proses ini meliputi pembuangan uap air dengan cara sublimasi vakum dari status beku.
Sebelum proses pengeringan, teknik ini menggunakan salah satu cara pembekuan sel.
http:/biogen.litbang.pertanian.go.id/terbitanvipdfagrobio 4 1 24-32.pdf

Pada tahap pembekuan (prefreezing), suspensi sel mikroba dapat dibekukan dengan menambuhkan campuran pendingin
seperti es kering (dry ice) dalam etanol. Alternatif lain adalah pembekuan dengan cara pembekuan sentrifugal, dimana
suspensi sel dibekukan dengan cara pendinginan dan penguapan pada kondisi vakum, sementara pulnya diputar dengan
kecepatan rendah untuk menghindari timbulnya buih. Selanjutnya suspensi beku mikroba di dalam ampul dikeringkan
dalam kondisi vakum. Cara ini menghilangkan kendala yang terjadi pada pengeringan biakan dari kondisi cair Selanjutnya
ampul kering beku dapat disimpan pada suhu ruang di tempat gelap kemampuan bertahan hidup jangka panjang mikroba
dapat ditingkatkan dengan penyimpanan di kulkas.

Hal yang perlu diperhatikan adalah cairan pengawet (preservatif) yang akan digunakan untuk pembuatan suspensi sel
untuk mencegah kerusakan sel hidup pada tahap pembekuan dan pengeringan. Fungsi preservatif adalah menstabilkan
protein, mencegah kerusakan akibat pembekuan, dan melindungi dari kekeringan yang berlebihan. Pemilihan preservative
tergantung pada mikroba yang akan disimpan. Senyawa preservative harus dapat memelihara mikroba dalam kondisi
hidup dan emberi peluang untuk dapat ditumbuhkan kembali dengan baik dari kondisi kering. Salah satu preservative
terbaik dan telah digunakan untuk penyimpanan jangka panjang mikroba adalah mist desiccants (Sly. 1983) yang
merupakan cairan dengan komposisi pepton difco 12 g dan glukosa 30 g dalam 100 ml akuades

Beberapa cairan preservatif lain yang sering digunakan ialah larutan pepton 1%, larutan susu skim 1%, larutan
Naglulumut 1%, dan larutan campuran senyum kuda dengan pepton 10% (Sly. 1983). Uraian yang lebih lengkap
mengenai jenis senyawa pengawet diuraikan secara rinci oleh Greaver (Sly, 1983), Lapage etal, (1970), serta Redway dan
Lapuge (1974)

Tahap penyimpanan kering beku adalah sebagai berikut:

a) Ampul kosong ukuran 1,0 ml diberi label di dalamnya dengan menuliskan nomor kode strain mikroba pada sepotong
kertas filter 3 mm x 20 mm menggunakan pensil, ditutup dengan kapas dun di luar ampul diberi label nomor kode
strain menggunakan spidol permanen. Ampul disterilkan dengan oven kering bersuhu 160°C selama satu jam
b) Strain mikroba yang akan disimpan dibiukkan pada medium yang sesuai hingga pertumbuhan optimum ( log phase).
Umumnya 24-48 jam pada suhu ruang,
c) Penyediaan larutan preservative yang sesuai untuk mikroba yang akun diawetkan.
d) Suspensi pekat strain mikroba 108-109 sel atau konidia/ml dibuat dalam cairan preservatif
e) Ampul yang telah disterilkan diisi dengan 0,1-0,3 ml suspense mikroba secara atau pipet mikro
f) Suspensi mikroba dalam ampul dibekukan pada suhu -20 sampai -30°C atau menggunakan dry ice
g) Ampul yang telah dibekukan dengan cepat dilakukan proses kering beku dengan menempelkan beku. Prosedur kering
beku dilakukan sesuai dengan petunjuk pada masing-masing alat.
h) Setelah selesai proses kering beku, ampul dipotong menggunakan api las.
i) Ampul yang sudah dipotong diatur rapi pada kotak penyimpan ampul.
j) Sebagian ampul diambil sebagai contoh untuk menguji viabilitas mikroba setelah proses kering beku.
k) Pengujian juga dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap tahun.
l) Penumbuhan kembali mikroba:
1. Ampul dikeluarkan dari tempat penyimpanan dan direndam pail suhu 37°C atau dibiarkan beberapa saat pada
suhu ruang untuk mencairkan isi ampul (thawing).
2. Secara aseptik leher ampul dipotong dengan pemotong kaca dan dipatahkan
3. Beberapa tetes medium cair dimasukkan ke dalam ampul, dibiarkan beberapa saat dan agak dikocok agar biakan
cepat larut.
4. Sebagian suspensi diambil dan ditumbuhkan pada cawan medium agar yang sesuai.
5. Koloni mikroba ditumbuhkan pada medium agar miring

2.3.1.10 Penyimpanan dengan Teknik Pengeringan Cairan

Beberapa strain bakteri yang peka terhadap proses kering beku dapat disimpan dengan cara pengeringan suspensi ( liquid
drying) mikroba. Teknik ini dikembangkan oleh Annear pada tahun 19541956 dan 1962 (Sly. 1983) dan berhasil
digunakan untuk menyimpan bakteri, khamir. Jamur, dan virus. Teknik ini dimodifikasi oleh Banno dan Sakane (1979).
Keefektifan teknik ini untuk penyimpanan khamir dibuktikan oleh Banno.

Tahapan teknik pengeringan cairan adalah sebagai berikut:

a) Ampul steril bertutup kapas dan diberi tabel kertas filter di dalamnya disediakan seperti untuk penyimpanan dengan
teknik kering beku.
b) Suspensi pekat biakan mikroba (108-109 sel/ml) dibuat dalam cairan pengawet seperti larutan mist dessicant, pepton
1%, susu skim 1% atau Na-glutamat 1%.
c) Pada tiap ampul dimasukkan 0.1-0.3 ml suspensi mikroba, tutup kapas dipasang dan digunting, kemudian dimasukkan
ke dalam ampul hingga leher ampul atau tepat di atas label
d) Ampul dipasang pada alat pengering beku dan dilakukan proses kering beku. Bilamana perlu bawah ampul dicelupkan
dalam air (waterbath) 25°C.
e) Sebelum ampul dipotong dianjurkan untuk memasukkan gas nitrogen murni ke dalamnya.
f) Uji viabilitas bakteri dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap tahun.

2.3.2 Beberapa Catatan Penting Dalam Penyimpanan Mikroba

Gambar Mikroba
Sumber: usaha321.net

a) Tiap isolatbakan paling sedikit dibuat lima duplikat, tetapi semakin banyak viabilitas dapat dilakukan lebih leluasa
b) Pemberian label yang jelas, tidak mudah hilang, untuk memudahkan pelacakan data
c) Pengecekan rutin tidak hanya untuk menguji viabilitas, tetapi juga stabilitas genetik, terutama virulensinya.
d) Pembuatan database dari koleksi isolat mutlak diperlukan

2.4 Karakterisasi Kultur Murni

Kultur mikrobiologi, adalah suatu metoda memperbanyak mikroba pada media kultur dengan perbaikan di
laboratorium yang terkendali. Microbial cultures atau kultur mikrobiologi digunakan untuk menentukan jenis dari
organisme tersebut,keberlimpahannya, atau keduanya. Ini adalah meode didiagnostik utama dari mikrobiologi dan
digunakan sebagaialat untuk menentukan penyebab dari penyakit infeksi dengan membiarkannya berkembangbiak di
medium tertentu. Sebagi contoh, kultur tenggorokkan mengambil contoh bud yang panjang dan membiakkannya pada
cawan petri dengan agar, sehingga dapat diketahui mikroba yang berbahay, misalnya Streptococcus pyogenes, yang
menyebabkan penyakit strep throat. Selanjutnya, tema kultur lebih umum digunakan secara tak resmi untuk
“perkembangbiakan secara selektif (selectively growing)” mikroba tertentu di laboratorium.
Kultur mikrobiologi adalah metode dasar yang banyak digunakan sebagi alat riset pada biologi molecular.
Seringkali berguna untuk mengisolasi kultur murni dari mikroba. Kultur murni (atau axenic) adalah populasi dari sel-sel
atau organisme multisel yang tumbuh tampa kehadiran yang lainnya, dengan kata lain mikroba tersebut hanya berasal dari
satu induk. Sehingga yang ada hanya sekumpulan mikroba dengan spesies yang sama. Kulur murni dapat dimulai dari satu
sel atau satu organisme, jadi akan terjadi genetic clones dari yang lainnya.
Untuk kegunaan kultur mikrobiologi digunakan agar yang berasal dari rumput laut. Yang telah murah adalah gum,
dan bias digunakan untuk mengisolasi dan memelihara thermophiles
 BAB III KESIMPULAN

Mikroorganisme sebagai makhluk hidup sama dengan organisme hidup lainnya sangat memerlukan energi dan
bahan-bahan untuk membangun tubuhnya. Bahan-bahan tersebut disebut nutrien. Peran utama nutrient adalah sebagai
sumber energi, bahan pembangun sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang menghasilkan
energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor
elektron, sumber mineral, Faktor pertumbuhan, dan nitrogen. selain itu, secara umum nutrient dalam media pembenihan
harus mengandung seluruh elemen yang penting untuk sintesis biologik organisme baru.Sumber sumber mikroorganisme
antar lain lingkungan ekstrim(tempat bersuhu ekstrim, kadar garam tinggi), kotoran, air limbah, dan bahkan, dalam
makanan.

Isolasi kultur merupakan kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari campuran biakan mikroba di alam sel
individu terpisah. Sebelum mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan diisolasi dan habitatnya menentukan
sampel apa yang akan diambil dari alam dan media apa yang akan digunakan. sampel biasanya segera dipakai atau
disimpan pada suhu dingin (kulkas)
Teknik Isolasi Kultur Murni :
1. Penggoresan (Streak-Plate) & Penyebaran (Spread-Plate)
2. Penuangan (Pour-plate)
3. Kultur yang Diperkaya
4. Pengenceran Berseri (Serial-Dilution)
5. Isolasi !el 6unggal

Kultur murni(axenic) adalah populasi dari sel-sel atau organisme multisel yang tumbuh tampa kehadiran yang lainnya,
dengan kata lain mikroba tersebut hanya berasal dari satu induk. Sehingga yang ada hanya sekumpulan mikroba dengan
spesies yang sama. Kultur murni dapat dimulai dari satu sel atau satu organisme, jadi akan terjadi genetic clones dari yang
lainnya.
 DAFTAR PUSTAKA

https://aguskrisnoblog.wordpress.com/2011/01/14/teknik-membuat-biakan-murni/

http://kuliahbiologimurni.blogspot.com/2015/10/kultivasi-mikroorganisme.html

https://www.scribd.com/document/327534857/Makalah-Mikrobiologi-Pengkoleksian-Sel

https://www.kompas.com/sains/read/2020/04/15/080400923/7-bakteri-pada-makanan-yang-paling-banyak-sebabkan-
penyakit?page=all

https://id.wikipedia.org/wiki/Habitat_bakteri
https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn
%3AANd9GcSygqR6omVPKCgFDcE2rPALgSXGCW8WgwEpfg&usqp=CAU
https://aguskrisnoblog.wordpress.com/2011/01/14/pemanfaatan-mikroorganisme-sebagai-indikator-uji/