Anda di halaman 1dari 33

HEMATOLOGI I

Teknik Pembuatan Hapusan Darah Tepi dengan Pewarnaan


Polikromatik dan Evaluasi Hapusan Darah Tepi

Ahmad Ripani, S.Si, M.Pd.


Politeknik Unggulan Kalimantan Jurusan Analis Kesehatan
SEDIAAN APUS DARAH TEPI (SADT)
• Sediaan Apus Darah Tepi biasa juga untuk
istilah Hitung jenis leukosit (Differential
Counting/Diff. Count), Blood Smear, Thin
Layer Blood.
• SADT dibuat dengan menghapus darah pada
objek gelas menggunakan kaca penghapus.
• Sediaan darah direkatkan dan diwarnai
kemudian diperiksa di mikroskop
Kegunaan apusan darah tepi

• Hitung jenis lekosit (manual)


• Pemeriksaan morfologi darah tepi
• Pemeriksaan malaria
• Cek jumlah trombosit
Hitung Jenis Sel Lekosit

HJL
Differential
counting

Hemogram
Diff count

ISTILAH LAIN YG MASIH SERING DIPAKAI


PRINSIP SPESIMEN
• Setetes darah dibentangkan • Darah vena dengan
berupa dibuat hapusan darah antikoagulan EDTA
diatas objek glass lalu diwarnai • Darah Kapiler
secara polikromatik dan
diperiksa dibawah mikroskop
dengan pembesaran objektif
100 X,dihitung dalam 100 %
leukosit dan digolongkan
menurut jenisnya
SKIN PUNCTURE VENI PUNCTURE

Ujung Jari Ujung Tumit Vena


BAHAN dan ALAT PEMBUATAN
SEDIAAN APUS DARAH TEPI

ALAT : REAGENSIA :

1. Obyek glass yang bersih 1. Cat Romanowsky


2. Spreader / penggeser Wright
3. Pipet darah & pengaduk Leishman
4. Bak pengecatan May Grunwald
5. Bak pengeringan Giemsa
6. Timer/pencatat waktu 2. Buffer distilled water pH 7,2
7. Gelas ukur untuk melarutkan cat
8. Hair Dryer 3. Methanol (90%) untuk fiksasi
SYARAT KACA SEDIAAN
OBJEK GELAS GELAS PENGHAPUS
• Bersih, kering dan bebas dari • Rata, baru dan sudut-sudutnya
lemak. hilang
• Sebaiknya menggunakan yang • Dapat digosok untuk
baru untuk hasil yang optimal. menghilangkan sudutnya
• Gunakan jenis cleared edges • Dapat juga menggunakan cover
bukan jenis frosted glass. glass ukuran 22 x 22 mm atau 24
• Dapat dihilangkan lemak dengan x 24 mm.
alkohol dan dikeringkan.
CARA PEMBUATAN SEDIAAN APUS
Alat yang diperlukan:
1. Kaca obyek yang bersih
2. Kaca pemulas
Cara membuat:
a. Pilih sebuah kaca obyek
dengan tepi yang rata.
b. Buatlah tanda diagonal pada
dua sudut tepi kaca obyek.
Potonglah kedua sudut tersebut
(kaca ini akan dipakai sebagai
pemulas)
TAHAPAN PEMBUATAN HAPUSAN DARAH

Tetesan darah  tarik pakai kaca


penghapus  menyebar darah  dorong
maju  Keringkan
▪ Letakkan setetes darah (2
atau 3 mm) dengan
menyentuhkannya pada kaca
obyek sekitar 1 cm dari tepi

▪ Pegang kaca obyek dengan


ibu jari & telunjuk tangan
kiri. Dengan tangan kanan,
letakkan tepi dari kaca
pemulas di depan tetesan
darah dengan sudut 30 – 45
derajat
▪ Geserlah kaca pemulas ke
belakang sampai menyentuh
tetesan darah
Biarkan darah menyebar
sepanjang tepi kaca pemulas.

Doronglah kaca pemulas ke


ujung kaca obyek dengan
gerakan halus sampai seluruh
darah menyebar menjadi
apusan yang cukup tipis.
Darah dari pasien anemia
seharusnya diapus dengan
lebih cepat
TEBAL TIPIS SEDIAAN
• Besarnya tetesan darah.
• Cepatnya kita menggeserkan gelas penghapus.
• Sudut antara gelas penghapus dan gelas objek.
• Gerakan pelan, sudut lebih besar dari 300
didapatkan lapisan darah tipis
• Gerakan cepat, sudut lebih kecil dari 300
didapatkan lapisan darah tebal.
• Kaca penghapus cover gelas menghasilkan
hapusan lebih tipis daripada objek gelas.
PENILAIAN KUALITAS PREPARAT YANG DIBUAT
• Lebar x panjang kira-kira 2,5 x 3 cm
• Ada bagian yang tebal dan tipis.
• Terlalu tebal sel-sel eritrosit menutupi satu
sama lain sehingga mempersulit penilaian.
• Terlalu tipis sel-sel akan kehilangan bentuk
bikonkafitasnya terutama daerah tepi.
• Ekor tidak seperti bendera robek
• Preparat tidak berlubang
• Preparat tidak terputus-putus.
METILEN BLUE (MB) BERSIFAT BASA :
MEWARNAI ELEMEN BERSIFAT ASAM, SEPERTI BASOFIL
ASAM AMINO DAN PROTEIN DAN KOMPONEN
LAIN. NETROFIL

EOSIN BERSIFAT ASAM: MEWARNAI ELEMEN


BERSIFAT BASA SEPERTI KOMPONEN EOSINOFIL
SITOPLASMA DAN HEMOGLOBIN

AZUR METILEN: ZAT WARNA BIRU LANGIT


YANG DITAMBAHKAN PADA GIEMSA, DAHULU
PARASIT
DIDUGA ZAT WARNA METILEN BLUE
TEROKSIDASI
TEKNIK PEWARNAAN POLIKROMATIK
• Mencampur beberapa zat warna. (Eosin Y
- Metilen Blue - Azure Metilen = Azure B)
• Dikenalkan oleh Romanovsky
• Modifikasi : Wrights, Giemsa, Kiewiet de
Jong, Leishman, May-Grünwald.
• Pulas Tanding: May-Grünwald-Giemsa
(MGG), Wright-Giemsa (WG)
TEKNIK PEWARNAAN WRIGHT
• Hapusan yang sudah kering difiksasi dengan meneteskan Wright’s Stain
pada lapisan darah, sehingga ini tertutup seluruhnya, waktu fiksasi 2
menit.
• Pengecatan dilanjutkan dengan menambahkan (meneteskan larutan
buffer yang sama banyaknya / satu setengah kali banyaknya) pada
Wright’s tadi. Segera dicampur dengan jalan meniup – niup beberapa
kali.
• Diamkan 20 menit untuk memberi kesempatan kepada sel –sel tercat
dengan baik.
• Hapusan dicuci dengan aquadest / air biasa dan keringkan
TEKNIK PEWARNAAN GIEMSA
• Preparat yang sudah kering difiksasi dengan metanol selama 2
menit.
• Kelebihan metanol di buang
• Tuang larutan giemsa yang telah diencerkan (1 tetes : 14 tetes)
dan diamkan selama 15 – 20 menit .
• Cuci dengan aquadest atau air biasa dan keringkan.
TEKNIK PEWARNAAN KIEWIET DE JONG

– Sediaan yang sudah kering difiksasi dengan meneteskan


larutan Kiewiet de Jong pada pada sediaan secara merata.
– Diamkan selama 30 – 60 detik agar sediaan terfiksasi.
– Tambahkan sama banyaknya buffer Phosphat pH 7.0 pada
sediaan tadi dan segera langsung ditiup-tiup untuk tujuan
mencampur.
– Diamkan selama 10 – 15 menit agar sediaan terwarnai.
– Cuci dengan aquadest dan keringkan.
PEWARNAAN
KIEWIET DE JONG
TERPISAH

Fiksasi  Eosin  Methylene Blue  Aquadest  Keringkan


PEWARNAAN PULAS TANDING
• Sediaan hapus darah yang kering difiksasi dengan
meneteskan zat Wright dan dibiarkan selama 1-2 menit
untuk merekatkan sediaan.
• Ditambahkan sama banyak jumlahnya Giemsa yang telah
diencerkan dengan Buffer fosfat pH 7,2 dan dicampur
dengan cara ditiup-tiup.
• Biarkan sediaan diwarnai selama 15 menit.
• Dihanyutkan zat warna dengan air dan dicuci hingga bersih
dan dikeringkan
Pewarnaan Sedian Apus Darah

• Pewarnaan Romanowsky menggunakan 2 zat warna :


Azus B (Trimetiltionin) yang bersifat basa.
Eosin Y (tectrabromfluresein) yang bersifat
• Prinsip : zat warna azur B akan mewarnai komponen sel besifat
asam, seperti ; kromatin, DNA, and RNA, sedangkan eosin Y akan
mewarnai komponen sel yang bersifat basa seperti ; granula eosinofil
dan hemoglobin. Ikatan kedua zat warna tersebut akan beragregasi
sehingga menimbulkan kontras dengan hasil inti berwarna ungu dan
sitoplasma berwarna biru.
PEMBAGIAN AREA HAPUSAN

kepala ekor
Tidak
Layak
diperiksa
ideal
Kurang baik

Ideal
Hati-hati !
3. pH buffer
•tinggi PMN gelap,
High pH Normal pH
granulasi toksik
•rendah PMN pucat,
granula eosinofil
benderang
Bright vermillion

Low pH
Good & Bad Smear
A: Optimal blood film: Thin,
A
medium length, good lateral B C D E

edges.
B: Suboptimal: Too broad, edges
cannot be examined properly.
C: Suboptimal: Too broad, too
long (tail cannot be examined).
Free margins
D: Suboptimal: "Thumb print",
curved zone of morphology.
E: Unacceptable: "Thumb print",
thick, no zone of morphology
Pembacaan
Zone of Observation
•SDM terpisah-baik (well-
spaced)
•Atau hampir bersentuhan

False hyperchromic

Menciut & agrgasi


PEMBACAAN
3 ZONA
HAPUSAN
SEBARAN
SEL DARAH

Ideal Ekor Kepala


No. Perbedaan Wright Giemsa
1. Warna Eritrosit Merah jambu Merah kelabu/merah abu-abu
2. Granula Basofil Berwarna gelap dan jelas Akan Larut dan tidak terlihat
3. Granula Eosinofil Orange/jingga Jingga kecoklatan
4. Keperluan Sangat cocok untuk mempelajari sel-sel Sangat cocok untuk mempelajari sediaan
muda darah dan sumsum tulang karena parasit darah karena struktur parasit jelas.
struktur inti dan sitoplasma lebih jelas
terlihat
5. Ketahanan Tidak tahan lama iklim tropik dan akan Cukup tahan dalam iklim tropik dan
memucat dalam beberapa tahun pemucatan lebih lambat
6. Teknik Fiksasi Terpisah Tidak terpisah
7. Pengenceran dan Tidak fleksibel dan waktunya tidak dapat Fleksibel dan waktu dapat diatur lama
waktu diatur pewarnaan sesuai pengenceran
8. Cara Pelaksanaan Cocok Pewarnaan individu Pewarnaan invidu dan massal
9. Pewarnaan massal Tidak memungkinkan, karena jumlah Memungkinkan karena dapat dilakukan
perbandingan zat warna dan buffer pengenceran yang lebih encer sehingga
kurang tepat dan sulit. waktu pewarnaan lebih lama
9. Komposisi Eosin Y, Azur B atau Metilen blue. Eosin, Metilen blue dan Azur metilen.
Metanol konsentrasi tinggi Metanol lebih rendah
10. Buffer fosfat pH 6.4 pH 6.4 dan pH 7.0 (parasit)
SELESAI

Anda mungkin juga menyukai