1, September 2009
ABSTRACT
83 ISSN : 1978-628X
Vol. 3, No. 1, September 2009 J. Ris. Kim.
keragaman bakteri melalui analisis gen 16S- NaCl, dan 0,5 g tripton ditimbang. Semua
rRNA dapat mengatasi kesulitan untuk bahan dilarutkan dalam akuades hinggá
kultivasi bakteri. Gen 16S-rRNA sesuai untuk volumenya tepat 1000 mL. Selanjutnya media
identifikasi bakteri karena gen ini terdapat tersebut disterilisasi dengan autoklaf
pada semua organisme. Gen penyandi 16S- pada121°C, 1 atm selama 15 menit.
rRNA mempunyai daerah berbeda yang terdiri
atas sekuen gen yang konservatif dan berguna Isolasi Bakteri
untuk mengkonstruksi pohon filogenik yang
lebih diskriminatif. Sekuen gen penyandi 16S- Sampel air kawah ditampung dalam jerigen
rRNA dari berbagai organisme yang sudah steril, kemudian dikulturkan ke dalam media
dapat dikulturkan maupun yang tidak dapat Thermus dan LB dan diinkubasi selama 2 hari
dikulturkan telah dibuat dalam bentuk pada suhu 55°C.
database. Terdapat lebih dari 4000 sekuen
yang terdapat pada database 16S-rRNA dan Isolasi DNA Kromosom
mencakup sekitar 1800 spesies yang
jumlahnya terus bertambah[5]. Kultur bakteri yang telah tumbuh disegarkan
dalam media Thermus dan LB, lalu diinkubasi
Dalam penelitian ini telah dilakukan isolasi selama 1 hari. Pelet (sel) diperoleh dengan cara
DNA dari komunitas bakteri termofilik dengan disentrifugasi pada 2000 g selama 20 menit.
metoda kultivasi, kemudian mengamplifikasi Pelet sel yang diperolah diresuspensi dalam
gen 16S-rRNA dari DNA kromosom yang buffer Tris HCl, pH 8,0 yang mengandung
diperoleh. Amplikon yang diperoleh dapat EDTA, kemudian suspensi sel dibekukan pada
dianalisis lebih lanjut untuk mengidentifikasi -20°C. Larutan lisozim (10 mg/mL 0,25 M Tris
bakteri yang berhasil diisolasi. Identifikasi ini HCl, pH 8,0) kemudian ditambahkan ke dalam
menjadi sangat penting mengingat besarnya sel yang telah beku dan dicairkan dalam water
potensi yang dimiliki oleh bakteri termofilik bath pada suhu ruang. Sel yang telah cair,
terutama enzim-enzim termostabil yang dibiarkan dalam es selama 45 menit.
dimilikinya. Selanjutnya ditambahkan buffer STEP (0,5%
SDS, 50 mM Tris HCl, pH 7,5; 0,4 M EDTA)
Tujuan penelitian ini untuk mengisolasi dan dan diaduk serta dipanaskan pada suhu 50°C
mengamplifikasi gen 16S-rRNA isolat bakteri selama 60 menit. Kemudian buffer tris fenol
yang ada di sumber air panas, kawasan wisata ditambahkan ke dalam suspensi sel, lalu
Gunung Pancar Bogor. Keragaman genetik dikocok dengan perlahan selama 5 menit.
bakteri termofilik dari sumber isolasi dapat Suspensi tersebut kemudian disentrifugasi pada
diketahui melalui amplifikasi gen penyandi 1000 g selama 15 menit. Supernatan yang
16S-rRNA, kemudian dilanjutkan dengan diperoleh dipindahkan ke dalam tabung
melakukan analisis tehadap amplikon. Bakteri eppendorf baru. Supernatan tersebut
termofilik hasil penelitian ini diharapkan mengandung DNA kromosom dan disimpan
memiliki stabilitas serta aktifitas tinggi pada suhu -20°C untuk keperluan analisis.
sehingga potensial untuk digunakan pada
industri-industri berbasis enzim. Elektroforesis Gel Agarosa
ISSN : 1978-628X 84
J. Ris. Kim. Vol. 3, No. 1, September 2009
tertinggi, suhu annealing berikutnya turun dua dengan pH 7. Pada Kawah Hitam terdapat
derajat secara bertahap. Tahap denaturasi awal tujuh mata air dengan warna airnya bening.
pada suhu 94°C selama 5 menit dilanjutkan Suhu air pada Kawah Putih 57°C dan memiliki
dengan satu siklus PCR dengan suhu pH 7. Keadaan Kawah Putih mirip dengan
denaturasi 94°C selama 45 detik, suhu keadaan Kawah Hitam, bedanya Kawah Putih
annealing 53°C selama 45 detik dan dilingkupi oleh pelindung. Suhu air pada
pemanjangan pada 72°C selama 3 menit, Kawah Asin adalah 25°C dengan pH 6.
kombinasi suhu PCR berikutnya sama, yang
berbeda hanya suhu annealing-nya yaitu 50°C, DNA Kromosom Hasil Isolasi
47°C dan 45°C. Suhu annealing terakhir
diulang sebanyak 20 siklus. Selanjutnya adalah Isolasi DNA merupakan tahap awal untuk
tahap akhir pemanjangan pada 72°C selama 7 melakukan proses PCR. DNA kromosom
menit dan diinkubasi pada 4°C hingga proses diisolasi dari bakteri yang dikultivasi pada
berikutnya. media Thermus dan LB. Hasil isolasi diperoleh
delapan DNA kromosom yaitu DNA
kromosom yang dikultivasi pada media
HASIL DAN PEMBAHASAN Thermus dan LB yang masing-masing berasal
dari kawah hitam, kawah merah, kawah putih,
Suhu dan pH Lingkungan pada Kawah dan kawah asin. Untuk mengetahui DNA
Merah, Hitam, Asin, dan Putih kromosom tersebut dilakukan elektroforesis
agarose. Hasil elektroforesis menunjukkan
Pengambilan sampel dilakukan di kawasan bahwa semua sampel DNA kromosom telah
wisata air panas Gunung Pancar yang terletak berhasil diisolasi hal ini ditunjukkan dengan
di daerah Sentul, Bogor. Sampel diambil dari 4 adanya pita-pita yang muncul pada gel agarose
lokasi, yaitu Kawah Merah, Kawah Hitam, (Gambar 1).
Kawah Putih dan Kawah Asin. Pengambilan
sampel dilakukan pada bagian tengah dan di Pengukuran secara kuantitatif terhadap DNA
bawah permukaan kawah. Hal tersebut tidak dilakukan pada percobaan ini, karena
bertujuan untuk mendapatkan bakteri dengan DNA yang dipakai sebagai template pada
suhu tinggi yang maksimal. proses PCR tidak memerlukan DNA dengan
tingkat kemurnian yang tinggi[6]. Pengukuran
Hasil pengamatan terhadap sampel air yang konsentrasi DNA yang diperoleh dilihat
terdapat pada kawah gunung Pancar memiliki dibawah sinar UV, kemudian konsentrasi DNA
suhu yang bervariasi (Tabel 1). Suhu air pada diperhitungkan dengan cara membandingkan
Kawah Merah 75-80°C dan memiliki pH 7. ketebalan pita DNA dengan marker yang telah
Warna kawahnya merah, dan kedalamannya diketahui konsentrasinya. Untuk mendapatkan
lebih dari lima meter. Kawah Merah memiliki konsentrasi DNA yang lebih pekat maka DNA
mata air, warna airnya kecoklatan dan kromosom yang sudah diekstraksi kemudian
kedalamannya mencapai satu meter. dipekatkan kembali dengan cara pengendapan
Sedangkan suhu air pada Kawah Hitam 55°C menggunakan etanol.
85 ISSN : 1978-628X
Vol. 3, No. 1, September 2009 J. Ris. Kim.
1 2 3 4 5 6 7 8
Gambar 1. Elektroforegram DNA kromosom. (1) Kawah Hitam Thermus; (2) Kawah Hitam LB; (3) Kawah
Merah Thermus; (4) Kawah Merah LB; (5) Kawah Putih LB; (6) Kawah Putih Thermus; (7) Kawah Asin LB;
dan (8) Kawah Asin Thermus
Amplikon Gen 16S-rRNA Hasil yang diperoleh dari percobaan yang telah
dilakukan menunjukkan bahwa proses
Proses amplifikasi gen 16S-rRNA pada DNA touchdown PCR dengan kombinasi suhu I
kromosom dari isolat bakteri dilakukan dengan belum menghasilkan amplikon. Hal ini
menggunakan primer Bac F1 dan Uni B1 disebabkan karena faktor suhu annealing serta
dengan metode touchdown, yaitu metode PCR jumlah siklus pada tiap-tiap tahap belum
dengan modifikasi suhu dalam setiap siklusnya optimum. Suhu annealing yang tinggi cukup
untuk mencegah annealing primer pada daerah hanya untuk satu siklus dan diharapkan
yang nonspesifik. Suhu annealing pada diperoleh amplikon yang spesifik, dan siklus
template DNA menentukan kespesifikan terbanyak dilakukan pada suhu terendah untuk
amplikon, namun juga menyulitkan primer memudahkan annealing primer pada template.
untuk menempel. Oleh karena itu dilakukan proses amplifikasi
dengan menggunaan kombinasi suhu II dengan
Dalam penelitian ini touchdown PCR perubahan pada suhu annealing dan jumlah
dilakukan dalam beberapa suhu annealing siklus.
yang bertingkat, yaitu dari suhu yang tinggi ke
suhu yang rendah. Pada siklus annealing yang Hasil yang diperoleh menunjukkan adanya pita
pertama digunakan suhu yang tinggi, dalam pada sampel DNA yang berasal dari Kawah
percobaan ini digunakan suhu 53°C Hitam yang ditumbuhkan dalam media LB,
selanjutnya dengan cara mengatur program namun pita yang dihasilkan masih tipis (tidak
yang terdapat pada mesin PCR suhu annealing didokumentasi), sehingga dilakukan percobaan
pada setiap siklus diturunkan dua derajat dengan kombinasi suhu III yang menggunakan
hingga siklus yang terakhir suhu annealingnya template DNA dari Kawah Hitam dengan
44°C. Dengan metode ini diharapkan primer media LB. Amplikon yang diperoleh pada
dapat menempel pada daerah yang spesifik kondisi dengan kombinasi suhu II dilakukan
sehingga diperoleh amplikon sesuai dengan PCR ulang dengan kondisi kombinasi suhu III.
analisis. Untuk mendapatkan hasil yang Perbedaan kombinasi suhu II dengan
optimal, maka dalam penelitian ini amplifikasi kombinasi suhu III adalah satu kombinasi suhu
dilakukan dalam empat kombinasi suhu PCR annealing dihilangkan, yaitu suhu annealing
Kombinasi suhu I dilakukan dengan mengatur 44°C.
suhu annealing pada siklus mulai dari 53°C
hingga 44°C, suhu annealing turun dua derajat Hasil percobaan menunjukkan bahwa proses
untuk setiap 7 siklus. Kombinasi suhu II PCR yang menggunakan template DNA
dilakukan seperti sebelumnya dengan jumlah kromosom secara langsung tidak menunjukkan
siklus yang sama hanya pada suhu 44°C adanya amplifikasi, sedangkan PCR yang
siklusnya diperbanyak menjadi 20 siklus. dilakukan dengan menggunakan template hasil
amplifikasi (re-PCR) menunjukkan pita DNA
ISSN : 1978-628X 86
J. Ris. Kim. Vol. 3, No. 1, September 2009
yang lebih tebal dengan ukuran sekitar 1,5 kb, digunakan adalah DNA kromosom dari
hasil amplifikasi terlihat pada elektroforegram Kawah Hitam dan kawah asin media
pada kolom 2 (Gambar 2). Namun masih Thermus, serta Kawah Hitam dan kawah asin
terdapat pita DNA yang berada pada daerah di media LB. Pemilihan sampel ini didasarkan
atas 1,5 kb. Hal ini menunjukkan annealing pada kualitas pita DNA hasil presipitasi etanol.
primer yang belum spesifik, kemungkinan
disebabkan oleh suhu annealing yang terlalu Hasil elektroforesis menunjukkan adanya pita
rendah. Oleh karena itu, kembali dilakukan DNA pada daerah sekitar 1,5 kb untuk sampel
PCR dengan kombinasi suhu IV yaitu dengan DNA kromosom dari Kawah Hitam dengan
menaikkan suhu annealing terendahnya media Thermus dan Kawah Asin dengan media
menjadi 45°C. Namun demikian dapat LB. Hanya terdapat satu pita DNA, hal ini
disimpulkan bahwa kondisi touchdown PCR menunjukkan bahwa annealing primer pada
dengan kombinasi suhu annealing III telah DNA tempelate sudah spesifik (Gambar 3).
berhasil mengamplifikasi.
Tahap selanjutnya pada penelitian ini adalah
Ukuran DNA amplikon yang diperoleh telah mengamplifikasi sampel-sampel dari kawah
sesuai dengan penelitian yang dilakukan lain dengan kondisi PCR yang optimum.
sebelumnya[7] dengan menggunakan primer Konsentrasi DNA diukur terlebih dahulu
yang sama yaitu 1,5 kb. Menurut Bottger[5] gen sebelum diamplifikasi untuk menentukan
penyandi 16S-rRNA mempunyai daerah jumlah DNA yang ditambahkan pada
berbeda yang terdiri atas sekuen gen yang campuran reaksi PCR. Hasil pengukuran,
konservatif dan berguna untuk mengkonstruksi diperoleh konsentrasi DNA dari isolat Kawah
pohon filogenik yang lebih diskriminatif. 16S- Hitam Thermus 387 µg/mL dan Asin LB 489
rRNA merupakan kerangka penyusun µg/mL. Perbandingan absorban DNA pada
ribosom yang peranannya sangat penting di panjang gelombang 260 dengan absorban
dalam sintesis protein dan dimiliki oleh semua DNA pada panjang gelombang 280
sel sehingga semua organisme dapat menunjukkan kemurnian DNA kromosom
dibandingkan secara setara[8]. Database sekuen yang diperoleh. Kemurnian DNA dinilai baik
gen penyandi 16S-rRNA dari berbagai jika mempunyai nilai perbandingan ≥ 1,7; hal
organisme yang sudah dapat dikulturkan ini berarti perbandingan antara DNA dengan
maupun yang tidak dapat dikulturkan telah protein adalah 1,7:1. Hasil pengukuran yang
dibuat databasenya. Tujuan utama pendataan menunjukkan nilai tersebut adalah isolat dari
ini adalah untuk mengukur secara tepat Kawah Hitam Thermus dan isolat dari Kawah
hubungan evolusioner di antara organisme- Asin LB (Tabel 2). Hal ini juga menunjukkan
organisme, disamping dapat menjadi katalog bahwa isolasi DNA kromosom telah berhasil
untuk keragaman mikroba. dilakukan.
1,5 kb
1 2 3
Gambar 2. Elektroforegram gel agarosa hasil amplifikasi kombinasi III suhu PCR; (1) DNA kromosom
Kawah Hitam LB; (2) Re-PCR 16S-rRNA; (3) marker 0,1 kb
87 ISSN : 1978-628X
Vol. 3, No. 1, September 2009 J. Ris. Kim.
1.5 kb
1 2 3 4 5
Gambar 3. Elektroforegram gel agarosa hasil amplifikasi kombinasi suhu IV; (1) DNA kromosom Kawah
Hitam Thermus; (2) DNA kromosom Kawah Hitam LB; (3) DNA kromosom Kawah Asin LB; (4) DNA
kromosom Kawah Asin Thermus; (5) marker 0,1 kb
2 kb
1.5 kb
1.65 kb
1 2 3 4 5 6 7 8
Gambar 4. Elektroforegram amplikon;(1) Marker 1 kb; (2) isolat Kawah Hitam Thermus PCR kombinasi
suhu III; (3) isolat Kawah Hitam Thermus PCR kombinasi suhu IV; (4) isolat Kawah Asin Thermus
kombinasi suhu IV;(5) isolat Kawah Hitam Thermus kombinasi suhu IV;(6) isolat Kawah Merah Thermus
kombinasi suhu IV ;(7) isolat Kawah Putih LB kombinasi suhu IV;(8) isolat Kawah Asin LB kombinasi suhu
IV
ISSN : 1978-628X 88
J. Ris. Kim. Vol. 3, No. 1, September 2009
89 ISSN : 1978-628X