Título: Neovascularización en un modelo murino de Shock séptico.

Introducción

El concepto de angiogénesis surgió en los años 70. Fue el estadounidense

Judah Folkman (24 de febrero de 1933 - 14 de enero de 2008) quien empezó a
hablar del mecanismo de la angiogénesis.

Neovascularización

Aspectos generales de la angiogénesis

La angiogénesis es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de

otros preexistentes y comprende una secuencia de eventos que es fundamental
para muchos procesos fisiológicos tales como el desarrollo embrionario, la
reparación de heridas, la formación del cuerpo lúteo y del endometrio uterino en el
ciclo menstrual durante la adultez.
En cambio, la vasculogénesis es el proceso de formación de vasos
sanguíneos a partir del ensamblaje de angioblastos, precursores endoteliales
diferenciados, en una red vascular primitiva. Subsecuentemente, las células
endoteliales proliferan y el lecho vascular naciente se expande y remodela
formando una red madura que posibilita la circulación sanguínea, siendo éste el
proceso que se denomina angiogénesis (Carmeliet P, 2000). Además, colaboran
otras células de soporte, como los pericitos y células musculares que favorecen la
maduración y el funcionamiento de los vasos sanguíneos. Entre estas células
existe una matriz extracelular (MEC) especializada que se denomina lámina basal.
En condiciones fisiológicas, la angiogénesis está estrictamente controlada
mediante el equilibrio de factores anti-angiogénicos y proangiogénicos. Un cambio
en el balance a favor de los factores proangiogénicos puede conducir a un
crecimiento inadecuado de los vasos sanguíneos, desempeñando un papel
esencial en una serie de patologías: la ateroesclerosis, la artritis reumatoidea, la
psoriasis, la retinopatía diabética y el crecimiento tumoral. Así por ejemplo, en la
artritis el crecimiento de un pannus vascular puede estar mediado por una
concentración excesiva de factores angiogénicos producidos por los macrófagos
(Mfs) infiltrantes, otras células del sistema inmune o células inflamatorias.
Asimismo, otras patologías como la isquemia del miocardio o de los
miembros inferiores, mejorarían mediante la promoción de la formación de vasos
sanguíneos funcionales por factores pro-angiogénicos (Carmeliet P, 2003).

Etapas del proceso angiogénico

La angiogénesis clásica o brotación es un proceso complejo que consta

de varias etapas que están muy reguladas en el tiempo y en el espacio. Cada
paso implica una complicada interrelación entre reactividad celular, factores
solubles y componentes de la MEC. Diversas señales son capaces de iniciar el
proceso angiogénico, principalmente el estrés metabólico y la hipoxia pero
también la respuesta inmune o inflamatoria.
En un intento de simplificación, el proceso angiogénico puede esquematizarse en
cuatro etapas, cada una de las cuales supone un posible blanco para su
intervención farmacológica (Fig. 1). Puede comenzar por la activación de las
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células endoteliales bajo la acción de una serie de citoquinas angiogénicas y de
otros mediadores fisiológicos. Entre los factores de crecimiento promotores de la
angiogénesis que están mejor caracterizados, se destacan algunos factores de
tipo polipeptídico tales como el factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento
placentario (PlGF), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de
crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Fig. 1
A). Otros mediadores solubles de la angiogénesis son el factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF) y el óxido nítrico (NO). La activación del endotelio
quiescente por acción de las citoquinas mencionadas suele tener lugar mediante
la unión a sus respectivos receptores del tipo tirosina quinasa. Algunos de estos
receptores se expresan preferentemente en células endoteliales, como es el caso
de los dos receptores de VEGF, denominados VEGFR-1/Flt-1 y VEGFR-2/Flk-1
(Yancopoulos GD y col., 2000). También se ha descrito un tercer receptor del tipo
tirosina quinasa, el VEGFR-3, relacionado estructuralmente con los anteriores y
que parece estar expresado en el endotelio linfático.

Una vez que las células endoteliales se activan por acción del estímulo
angiogénico, su fenotipo cambia notablemente. Además de producirse un cambio
en su forma, de plana a redondeada, se produce la liberación de una serie de
proteasas que le permitirán degradar su membrana basal. Para esto se requiere la
separación de los pericitos que recubren la pared del vaso sanguíneo.
Aunque diversas familias de proteasas han sido implicadas en el proceso
de la angiogénesis, las que parecen tener un papel más importante son el
activador del plasminógeno y las metaloproteasas de la MEC (MMPs). Estas
ultimas participan en situaciones que requieren angiogénesis, tales como la artritis

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y la cicatrización de heridas. Algunos factores angiogénicos, tales como VEGF,
FGF, TNF- e interleuquina-1 (IL- 1) estimulan la producción de MMP-1, MMP-3 y
MMP-9 por las células endoteliales. Durante la angiogénesis, la acción
degradadora ejercida por las enzimas proteolíticas participa en al menos tres
pasos del proceso: ruptura de la membrana basal, migración de las células
endoteliales y formación del lumen vascular (Fig. 1 B).
En respuesta al estímulo angiogénico, las células endoteliales migran desde
el lecho vascular hacia dicho estímulo, invadiendo el tejido conectivo y el
parénquima (Fig. 2 A).
El proceso de diferenciación de las células endoteliales para dar lugar a la
formación de capilares no está completamente caracterizado, aunque debe estar
perfectamente controlado de modo que las células endoteliales que proliferan no
ocluyan el lumen de los capilares que se van formando. A medida que el nuevo
brote se forma, algunas de las células vuelven al estado de reposo para formar las
paredes de los nuevos capilares y comienzan a producir la MEC y la membrana
basal necesarias para estabilizarlos (Fig. 2 B) (Rundhaug JE, 2005).

Shock séptico y neovascularización

El shock séptico es una de las enfermedades más complejas, que

sobreviene al manejo de una infección severa y cuyas manifestaciones son la
hipotensión y la falla multiorgánica. El daño de las células cardíacas puede
conducir a la muerte por fallo cardíaco. Esta enfermedad, que es un proceso
inflamatorio sistémico, es la principal causa de muerte en los pacientes internados
en las unidades de cuidados intensivos. Las bacterias Gram- y sus toxinas son un
grupo de patógenos que causan esta enfermedad (Parrillo JE,1993). El LPS
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(lipopolisacárido), que es una endotoxina derivada de las paredes celulares de
bacterias Gram- con actividad inflamatoria, es un potente estimulador de la
respuesta efectora, principalmente de los macrófagos en el sistema inmune.
Cuando ingresa en un organismo se asocia a una proteína de unión al LPS (LBP),
el complejo LPS-LBP interactúa con el CD14 que es un receptor que sintetizan y
expresan los macrófagos. Luego el complejo LPS-LBP-CD14 activa al receptor
tipo Toll 4, el cual desencadena diferentes cascadas de señalización que llevan a
la activación de distintos factores de como el NF-kB y AP-1, que promueven la
transcripción de genes de numerosas moléculas inflamatorias como son el Factor
de necrosis tumoral (TNF) o Interleuquinas (IL) generando una respuesta
inflamatoria local o sistémica (Karima R y col., 1999) (Figura 3).

Cascada
de
señalización

Activación de factores de
trascripción Transcripción de
genes
Respuesta inflamatoria

Figura 3: Vía de señalización del LPS.

Si bien se conocen los blancos de la secuencia patogénica en el shock

séptico (Toxinas bacterianas → activación de proteínas plasmáticas;
monocitos/macrófagos, células endoteliales → liberación de mediadores
proinflamatorios → depresión del miocardio; vasodilatación →disfunción orgánica
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por efectos metabólicos) poco se conoce a cerca del efecto de los patógenos
sobre la capacidad angiogénica de los macrófagos en esta enfermedad. Se ha
demostrado en un modelo in vitro, que frente a estímulos que favorecen la
angiogénesis, los macrófagos pueden adquirir marcadores endoteliales (CD34+) e
insertarse en estructuras tubulares semejantes a vasos sanguíneos (Schmeisser A
y col., 2001). En nuestro laboratorio demostramos que los macrófagos son células
promotoras de la angiogénesis tumoral en un modelo murino de cáncer de mama
por liberación de VEGF-A y productos inflamatorios como PGE 2 (de la Torre E y
col., 2005)

Neovascularización y productos inflamatorios

Las señales que inician y sostienen la angiogénesis son múltiples y

complejas: incluyen citoquinas y factores de crecimiento como: VEGF, TGFβ, FGF,
PDGF, angiopoyetinas, IL-8, secretados por las células inflamatorias (mastocitos,
macrófagos, etc.) que infiltran el tejido inflamado. Entre estos mediadores el más
estudiado es el VEGF-A, que se sintetiza por estímulos como la hipoxia o la
isquemia. Cuando este mediador se une a sus receptores de los subtipos 1 y 2
estimula la movilización de precursores endoteliales sanguíneos de médula ósea
vía MMP-9, la quimiotaxis de monocitos que estimulan la arteriogénesis cardíaca,
efectos antiapoptóticos sobre las células endoteliales y la vasodilatación y
reperfusión cardíaca vía NO (Molin D y Post MJ, 2007). Estos resultados
provienen de modelos experimentales de isquemia y reperfusión quirúrgica, pero
no se tienen antecedentes en modelos de shock por infección aguda con LPS
bacteriano.
En una respuesta inflamatoria frente a patógenos, se considera a la
modulación de la expresión de NOS-2, COX-2 y MMPs como parte de la
maquinaria defensiva que se pone en marcha en esa circunstancia. Estas enzimas
modulan otro aspecto no menos importante de la respuesta inflamatoria como es
la angiogénesis y/o arteriogénesis cardíaca, que es un mecanismo compensatorio
al daño del tejido y cuyo desarrollo y manejo farmacológico son escasamente
conocidos en estas enfermedades.

Objetivos Generales y específicos

El shock séptico inducido por infecciones bacterianas afecta al miocardio, a

las células del sistema inmune y a la microcirculación. El daño es causado por los
propios microorganismos o sus endotoxinas induce la liberación de sustancias
vasoactivas, a nivel de capilares, vénulas y arteriolas promoviendo, un fenómeno
vascular trombótico. Teniendo en cuenta que el proceso de neovascularización
puede contribuir al agravamiento o a la reparación del tejido dañado, en un modelo
murino de infección aguda por LPS nos proponemos:

 Investigar la capacidad de los miocardiocitos para inducir neovascularización

o Cuantificar la respuesta neovascular in vivo.
o Determinar la expresión de VEGF-A y CD-31.
 Caracterizar el papel de los macrófagos como inductores de la respuesta
angiogénica
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 o Cuantificar la respuesta vascular inducida por macrófagos
o Determinar la expresión de VEGF-A y CD-31

 Estudiar la participación de proteínas inflamatorias durante el proceso

angiogénico
o Carcacterizar la expresión y actividad de Oxido Nitrico Sintasa 2
(NOS-2)
o Caracterizar la expresión y actividad de Ciclooxigenasa 2 (COX-2)
o Caracterizar la expresión y actividad de metaloproteasa-9

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