Liquid Chromatography

     IUPAC mendefinisikan kromatografi sebagai metode pemisahan campuran dimana

komponen yang akan dipisahkan, didistribusikan antara dua fasa yaitu, fasa diam dan fasa
bergerak dalam arah tertentu. Fasa bergerak adalah fluida yang bergerak/ merembes di
sepanjang fasa diam pada arah tertentu. Fluida dapat berupa cairan, gas, cairan superkritis.
Fasa diam dapat berupa solid, gel, atau cairan. Berdasarkan fase gerak yang digunakan,
kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu, liquid kromatografi dan gas
kromatografi.
    Kromatografi cair (LC) adalah teknik kromatografi analisis yang berguna untuk
memisahkan ion atau molekul yang dilarutkan dalam pelarut (fasa bergerak berupa cairan).
Jika larutan sampel kontak dengan fasa cair, zat terlarut yang berbeda akan berinteraksi
dengan fase lain. namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap
(adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini
membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari
lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom.

FASE GERAK UNTUK KROMATOGRAFI CAIR

Sifat-sifat berikut diperlukan untuk fase gerak dalam Kromatografi Cair.
A. Solven (pelarut) harus siap tersedia
B. Pelarut harus sesuai dengan detektor yang digunakkan. Dengan mempertimbangkan :
- Deteksi Photometric – UV
- Deteksi Refractive Index –|ΔR| pelarut dan analit
- Ketidak murnian yang memiliki extinction coeffisient tinggi, yaitu mengabsorbsi dengat kuat.
C. Reaktivitas Pelarut. Pelarut sbaiknya tidak bereaksi dengan sampel atau polymerisasi dengan fase
diam.
D. Pelarut sebaiknya tidak terlalu kental. Viskositas tinggi (menimbulkan tekanan
operasional) mengurangi efisiensi pemisahan. Tiik didih dapt menjadi petunjuk viskositas, senyawa
dengan titik didih yang rendah lebih kurangkental. Pelarut sebaiknya mendidih pada 20 0-500diatas
temperatur pemisahan.
E. Untuk Kromatografi Cair Partisi dengan fase diam mekanik, fase gerak harus tidak dapat dicampur
dengan fase diam.
F. Keamanan dalam penggunaan pelarut harus dipertimbagkan terutamakemungkinan timbulnya
pembakaran atau keracunan.
 Fasa tetap yang umum (dan interaksinya dengan zat terlarut) adalah: padatan (adsorpsi),
kelompok ion pada resin (ion-exchange), dan cairan pada dukungan solid inert (partisi).

1. Adsorpsi, adalah proses pemisahan bahan dari suatu campuran dengan cara
pengikatan bahan tersebut pada seluruh bagian adsorben cair yang diikuti dengan
pelarutan. Bahan yang dijadikan adsorben harus selektif, memiliki tekanan uap
rendah, tidak korosif, mempunyai viskositas yang rendah, stabil secara termis, murah,
dan memiliki daya melarutkan bahan yang akan diadsorpsi sebesar mungkin. Dengan
demikian kebutuhan akan cairan lebih sedikit dan volum alat menjadi lebih kecil.
Teknik ini cocok untuk senyawa nonpolar yang kecil (berat molekul<5000).
Keuntungan metode ini adalah dapat memisahkan dan menahan beberapa senyawa
yang tidak bisa dilakukan dengan metode lainnya, misalnya pada pemisahan isomer
geometri. Mekanismenya dapat dilihat pada gambar berikut, zat terlarut A
mengangkat n molekul dari pelarut M dari permukaannya.

2. Ion-exchange, digunakan untuk memisahkan sejumlah anion dan kation. Anorganik

kation dipisahkan pada kolom resin pemisah kation. Sementara anorganik anion
dipisahkan pada kolom resin pemisah anion.

3. Partisi cair-cair, tergantung dari partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat
bercampur. Salah satu diantaranya bertindak sebagai fase diam dan yang lainnya
sebagai fase bergerak. Bahan yang digunakan biasanya adalah silika. Mekanismenya
diberikan oleh hubungan berikut.

Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya :

1) Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya
adsorbsi suatu adsorben  terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya
Kelebihan kromatografi kolom

1.Proses kromatografi kolom termasuk proses yang sederhana

2. Tidak membutuhkan alat-alat yang kompleks dalam melakukan metode kromatografi kolom

3. Biaya yang dikeluarkan untuk metode kromatografi kolom cukup murah jika dibandingkan dengan
metode kromatografi lainnya

kekurangan kromatografi kolom

1. Membutuhkan waktu yang lama untuk menyelesaikan prosesnya

2. Perlu dilakukan elusi secara bertahap agar semua fasa gerak yang digunakan akan habis dan di
tampung pada wadah yang berbedakromatografi kolom

2) Kromatografi Kertas (Partisi)

Kromatografi kertas adalah suatu metode pemisahan yang menggunakan media kertas
(selulosa) sebagai fase diam, sedangkan untuk fase gerak menggunakan pelarut atau
campuran pelarut yang sesuai.. Jarak relatif pada pelarut disebut sebagai nilai Rf , yaitu jarak
tempuh senyawa dibagi dengan jarak tempuh pelarut.

Kromatografi kertas termasuk pada kromatografi partisi cair-cair. Prinsip kromatografi

partisi cair-cair adalah distribusi sampel antara fase cair diam dan fase cair bergerak dengan
membatasi kemampuan pencampuran (contoh, pemisahan tinta, zat warna, klorofil, make up,
dll )
Contoh:
kelebihan kromatografi kertas

1.Tidak diperlukan peralatan yang teliti dan mahal

2.Dapat diperoleh hasil yang baik walaupun dengan peralatan dan materi yang sederhana

3.Senyawa yang terpisah dapat dideteksi pada kertas dan diidentifikasi

kekurangan kromatografi kertas

1.Banyaknya permasalahan menyangkut cara pemasukan fasa gerak, perambatan fasa gerak, dan
penggumpalan

2.Membutuhkan waktu lama

3.Keterbatasan parameter senyawa yang diuji

3) Kromatografi Lapisan Tipis (Absorbsi)

Kromatografi lapisan Tipis adalah suatu metode pemisahan yang menggunakan lempengan
tipis yang terbalut gel silica atau alumina sebagai fase diam, sedangkan untuk fase gerak
menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai, digunakan untuk mengetahui jenis
campuran asam amino
Beberapa kelebihan KLT yaitu:

a. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.

b. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau
dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
c. Perlakuan dapat dengan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau
dengan cara elusi 2 dimensi.
d. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan
merupakan bercak yang tidak bergerak.
e. Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
f. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
g. Jumlah perlengkapan sedikit.
h. Preparasi sample yang mudah
i. Berfungsi untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan
metode kertas tidak bisa (Gandjar dan Rohman, 2007).

Adapun kekurangan KLT yaitu:

a. Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang
diharapkan.
b. Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
c. Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun
 4) Kromatografi liquid sederhana (LPLC/ Low Performance LiquidChromatography)

Terdiri dari sebuah kolom dengan dasar fritted yang menjaga fasa tetap berada dalam
keseimbangan dengan pelarut. Dengan pelarut dan kondisi yang sesuai, komponen-komponen
berbeda dalam campuran akan lewat dengan kecepatan berbeda di sepanjang kolom dari
komponen lainnya sehingga terjadi pemisahan yang diinginkan dikarenakan perbedaan sifat
partisi antara fase tetap dan fase bergerak cair.

Misalnya, kita ingin memisahkan sebuah campuran yang jika ditambahkan pelarut
akan menghasilkan warna berbeda. Warna larutan awal adalah hijau. Pertama, penutup kran
dibuka untuk membiarkan pelarut yang berada di kolom mengering sehingga material
terpadatkan rata pada bagian atas. Kemudian, campuran dimasukan dengan hati-hati dari
bagian atas kolom. Setelah itu, kran dibuka lagi agar campuran berwarna diserap pada bagian
atas material terpadatkan. Karena pelarut mengalir secara terus-menerus, pelarut baru perlu
ditambahkan melalui bagian atas kolom dengan tidak merusak material terpadatkan dalam
kolom, sehingga kolom tidak pernah kering. Pelarut yang mengalir dikumpulkan dalam satu
gelas kimia.

5) Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut denganHigh
Performance Liquid Chromatography (HPLC)

merupakan metode yang dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada KCKT digunakan
tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan
terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu
retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak- puncaknya
terpisah. Prinsip dasar dari KCKT, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan
setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi(kualitatif).

Kelebihan itu antara lain:

a. Mampu memisahkan molekul- molekul dari suatu campuran
b. Mudah melaksanakannya
c. Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
d. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ü
Resolusi yang baik
e. Dapat digunakan bermacam- macam detektor
f. Kolom dapat digunakan kembali
 g. Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali
cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang dianalisis.
h. Dapat menganalisis senyawa organik yang terurai (labil) pada suhu tinggi karena
HPLC dilakukan pada suhu kamar.
i. Dapat menganalisis cuplikan yang berasal dari senyawa-senyawa anorganik.
j. Dapat menganalisis cuplikan yang memiliki berat molekul tinggi atau titik didihnya
sangat tinggi seperti polimer
k. Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan panas

Sedangkan kekurangannya adalah:

a. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu
b. Hanya bisa digunakan untuk asam organic
c. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi
d. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

     Untuk melakukan analisa kualitatif dengan liquid kromatografi dasarnya adalah waktu
retensi atau volum retensi suatu senyawa. Kemudian t atau V senyawa dalam sampel
dibandingkan dengan t atau V suatu senyawa standar yang telah diketahui sebelumnya. Rasio
waktu retensi dari dua komponen atau selektifitas dapat dihitung dengan cara berikut:   

     Sementara untuk analisa kuantitatif ada beberapa metode yang perlu diketahui diantaranya
adalah sebagai berikut:

 Metode pengukuran tinggi puncak.

    Tinggi puncak suatu kromatogram akan sebanding dengan kadar senyawa yang
membentuk kromatogram tersebut. Pengukuran tinggi puncak didasarkan pada rumus
pengukuran tinggi suatu segitiga yaitu, suatu garis tegak lurus dari titik tengah alas
kromatogram sampai dengan perpotongan sisi segitiga kromatogram tersebut.
 Metode pengukuran luas puncak.

    Dapat memberikan hasil yang lebih akurat jika dibandingkan dengan cara pengukuran
tinggi puncak. Luas puncak diukur seperti menghitung luas segitiga yaitu, 1/2 x alas x tinggi.
Rumus tersebut memberikan hasill yang baik jika kromatogramnya berbentuk lancip. Cara
lain untuk bentuk kromatogram yang lain yaitu, tinggi x lebar pada 1/2 puncak.

 Metode gunting dan timbang.

    Kromatogram yang telah digambarkan pada kertas digunting sesuai bentuknya, kemudian
guntingan-guntingan ini ditimbang. Berat dari masing-masing guntingan kromatogram ini
akan sebanding dengan kadar senyawa yang membentuk kromatogram tersebut.
 Metode integrator.

    Integratoremrupakan alat elektronik yang sering dijumpai pada peralatan kromatografi
modern. Alat ini akan mengubah tanda-tanda listrik dari detektor menjadi suatu gambaran
kromatogram sekaligus menghitung luas kromatogram yang dibentuk secara elektronik.

Area di bawah puncak sebanding dengan jumlah zat x yang terdeteksi. Jika larutan kurang
pekat, area di bawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi sama. Hal lain yang
perlu diperhatikan adalah puncak. Area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding area di
bawah puncak X dapat berarti: Y lebih sedikit dari X; bisa juga  erarti jumlahnya sama karena
Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang yang lebih sedikit dibanding X.