Thin-Layer Chromatographic Quantification of trans-Resveratrol in

Cosmetic Raw Materials of Botanic Origin

Material dan Bahan

 Etil Asetat, methanol, etanol, Larutan Buffer pH 7,0 (dibuat dari KH2Po4 dan
Na2HPO4, trans-resveratrol (kemurnian 98%), p-ethoxybenzaldehyde
(anisaldehyde) dari kemurnian analitik, asam sulfat dan asam asetat glasial dari
kemurnian analitik (PPH POCh), dan pelat TLC RP-18 yang telah di pra-preparasi
(20 cm × 20 cm; cat No. 1.15389, Merck, Darmstadt, Jerman). Air yang dideionisasi
dan didistilasi ganda di laboratorium dengan menggunakan sistem Millipore
model Elix Advantage (Millipore, Molsheim, Prancis).
 20 Sampel uji bahan baku kosmetik diperoleh dari botani dibeli di toko on-line,
apotek, kilang anggur, dan supermarket.

Metode
1. Penyiapan Sampel
Sampel yang diperoleh disimpan ditempat yang sejuk dan gelap.
Sampel lalu diekstraksi. Solid Phase Ekstraksi SPE dengan Baker SPE-12G catrid
fase C (Baker, deventer, Holland).
2. Penyiapan Larutan Standar trans-Resveratrol
 Sampel trans-resveratrol ditimbang lalu dilarutkan dengan etil asetat
kemudian di masukkan ke dalam sonikasi ultra.
 Buat 10 larutan pada konsentrasi 0,01, 0,03, 0,05, 0,10, 0,15, 0,30 0,50, 1,00,
1,50, dan 2,00 μg μL untuk kurva kalibrasi pada satu pelat kromatografi
dengan Aliquot untuk pelat kromatrografi yaoti 5 μL dengan 6 pengulangan
pada enam piring kromatografi (n=6)
 Menentukan batas deteksi dan batas quantifikasi
Ketinggian puncak kromatrogram (ic) diplot terhadap jumlah kromatogram
trans-resveratrol yang ditetapkan pada piring kromatografi.
Batas Deteksi (LOD) dihitung menggunakan rumus : LOD=3,3xSD/a,
Batas kuantifikasi (LOQ) dihitung menggunakan rumus LOQ=10xSD/a.
 SD adalah standar deviasi dari ketinggian puncak yang diambil sebagai ukuran
noise, dan a adalah kemiringan kurva kalibrasi yang sesuai ( y = kapak + b ).
 Selanjutnya dilakukan kuantifikasi isi trans- resveratrol dalam bahan baku
kosmetik asal botani Menggunakan TLC

3. Penyiapan Sampel bahan Baku Kosmetika

 Ekstrak tanaman untuk pembuatan kosmetik padat dilarutkan dalam air atau
etanol lalu untuk di lakulakan sonikasi hingga diperoleh konsentrasi 1%(b/v).
dan Wines (anggur) dilakukan prosedur SPE yang belum diproses.
 Sampel Anggur dan ekstrak tanaman diekstraksi dengan SPE, Diekstraksi
dengan menggunakan kartrid C18 SPE fase terbalik.
 Pertama, 50 mL alikuot anggur dan larutan ekstrak tanaman dinetralkan
hingga pH 7,0 dengan NaOH (conc. 1,0 mol L-1). Kemudian, kartrid
diprioritaskan dengan 5 mL metanol dan 10 mL buffer (pH 7,0). Kartrid yang
telah dikondisikan secara perlahan dimuat dengan sampel yang dinetralkan.
Fraksi polifenol yang diekstraksi kemudian dielusi dengan alikuot etil asetat 5
mL, dan dikumpulkan dalam botol kaca sebagai fraksi yang tidak hanya
mengandung trans-resveratrol tetapi pterostilbene dan asam p-coumaric juga.
Eluen etil asetat dianalisis dengan menggunakan TLC.

4. Analisis dengan Thin – Layer Chromatography (TLC)

 Sampel cairan (dalam alikuot dari 3 sampai 5 μL) diaplikasikan dengan
menggunakan mikrokapiler ke pelat kromatografi lapis tipis, sebanyak 12
sampel per satu piring.
 Sampel tepat di gantungkan pada pelat dengan jarak 15 mm dari satu sama
lain dan dari kiri dan tepi kanan piring dan 10 mm di atas tepi bawah.
 Pada setiap lempeng, dua sampel standar trans-resveratrol (3 dan 5 μL pada
konsentrasi 0,10 mg mL-1) dan sepuluh sampel tanaman yang terlihat.
 Kromatogram dikembangkan di ruang kromatografi vertikal dengan jarak 17
cm dengan menggunakan metanol-air (6: 4, v / v) sebagai fase gerak.
 Setelah dikembangkan, kromatogram dikeringkan di udara sekitar selama 3
jam.
 Kromatogram dipindai secara densitometrik dengan menggunakan
densitometer model CD 60 Desaga yang dilengkapi dengan perangkat lunak
ProQuant yang kompatibel dengan Windows (Desaga, Heidelberg, Jerman).
 Konsentrasi jalur pengembangan diukur dengan mode fluoresensi
menggunakan lampu deuterium pada panjang gelombang iradiasi λ = 340 nm.
 Analisis TLC diulang untuk setiap sampel yang diperiksa enam kali (n = 6).
 Pembuatan reagen visualisasi yaitu dua larutan disiapkan, A dan B. Solusi A
terdiri dari 20 mL asam asetat glasial dan 70 mL metanol, dan larutan B
mengandung 16 mL konsentrasi. asam sulfat dan 1 mL anisaldehida. Setelah
persiapan, larutan B perlahan-lahan dituang ke larutan A, dan entitas
didinginkan dengan air dingin.
 Kromatogram divisualisasikan dalam kotak TLC plate viewing box (Merck)
pada panjang gelombang λ = 366 nm dan dengan menggunakan larutan
anisaldehida sebagai reagen visualisasi selektif Kromatogram yang
dikembangkan dicelupkan dalam reagen ini untuk ca. 2 detik dan kemudian
dikeringkan pada 110 ° C selama 2 menit.
 Chromatograms divisualisasikan dalam kotak tampilan TLC dan dengan
menggunakan larutan anisaldehyde difoto dengan kamera digital.
 Application of Stability-Indicating RP-TLC Densitometric Determination
of Rabeprazole Sodium in Bulk and Pharmaceutical Formulation

Material dan Bahan

 Natrium Rabeprazole dipasok oleh Torrent Pharmaceutical Ltd. Ahmedabad,
India.
 gel silika 60 RP-18 F-254 S (20 cm x 10 cm dengan ketebalan 0,2 mm E. Merck
 Fase gerak terdiri dari aseton: air (3,5: 1,5 v / v ) dan 8,0 mL seluler fase
digunakan per kromatografi.
 Pelat RP-TLC
 Pemindai Camag TLC 3
 lampu deuterium sebagai sumber radiasi

Metode
1. Penyiapan Sampel
Sampel yang digunakan yaitu rabeprazole sodium
2. Penyiapan Instrumen HPTLC
Sampel diletakan dalam bentuk pita selebar 6 mm dengan jarum suntik Camag
mikroliter pada gel silika 60 RP-18 F-254 S (20 cm x 10 cm dengan ketebalan 0,2
mm E. Merck, Germany) menggunakan Camag Linomat 5 (Swiss ). Tingkat aplikasi
konstan 150 nL detik -1 digunakan dan ruang antara dua band adalah 15,4 mm.
Dimensi celah disimpan 6 mm x 0,45 mm.
Fase gerak terdiri dari aseton: air (3,5: 1,5 v / v) dan fase gerak 8,0 mL digunakan
per kromatografi. Pengembangan linear naik dilakukan dalam 20 cm x 10 cm
kembar melalui ruang kaca jenuh dengan fase gerak. Waktu saturasi ruang yang
dioptimalkan untuk fase gerak adalah 30 menit pada suhu kamar (250C ± 2) dan
kelembaban relatif 60% ± 5. Panjang proses kromatogram sekitar 8 cm. Setelah
pengembangan; Pelat RP-TLC dikeringkan dalam arus udara dengan bantuan
 pengering udara. Pemindaian densitometri dilakukan pada pemindai Camag TLC 3
dalam mode reflektansi-absorbansi pada 284 nm. Sumber radiasi menggunakan
radiasi lampu deuterium dalam kisaran 190 nm hingga 400 nm.

3. Penyiapan Larutan Standar dan Penyiapan Grafik Kalibrasi Natrium Rabeprazole

Larutan stok standar dibuat dengan melarutkan 10 mg rabeprazole sodium dalam
10 mL metanol untuk mendapatkan konsentrasi (1,0 mg mL -1). Volume larutan
stok yang berbeda 0,4 - 2,4 μL terlihat pada pelat RP-TLC dalam tiga ulangan untuk
mendapatkan konsentrasi 400, 800, 1200, 1600, 2000 dan 2400 ng spot -1 dari
rabeprazole sodium, masing-masing.
Data luas puncak dibandingkan konsentrasi obat diobati dengan regresi linier
kuadrat terkecil.

4. Validasi Metode
 Presisi
Pengulangan penerapan sampel dan pengukuran area puncak dilakukan
menggunakan enam kali dari tempat yang sama (1000 ng spot -1 dari
rabeprazole sodium). Variasi intra-day dan inter-day untuk natrium
rabeprazole dilakukan pada tiga tingkat konsentrasi yang berbeda sekitar 800,
1200 dan 1600 ng spot -1.
 Robusteness
Memperlihatkan berbagai perubahan pada kondisi kromatografi sebelumya,
efeknya pada hasil yang diperiksa.
 Batas deteksi dan batas kuantifikasi
Larutan stok natrium rabeprazol (0,1 mg mL-1) disiapkan dan volume larutan
stok yang berbeda dalam kisaran 400 hingga 800 ng terlihat dalam rangkap
tiga. Jumlah natrium rabeprazole berdasarkan respons spot versus rata-rata
(area puncak) digambarkan dan persamaan untuk ini ditentukan. Deviasi
standar (S.D.) dari tanggapan dihitung. Rata-rata penyimpangan standar
dihitung (A.S.D.). Batas deteksi dihitung dengan (3.3 × A.S.D.) / B dan batas
 kuantifikasi dihitung oleh (10 × A.S.D.) / B, di mana "b" sesuai dengan
kemiringan yang diperoleh dalam studi linearitas metode.
 Specifisitas
Spesifisitas metode ini dengan menganalisis obat dan sampel standar. Spot
untuk rabeprazole sodium dalam sampel dibandingkan dengan
membandingkan nilai Rf dan spektrum spot dengan standar. Kemurnian
puncak natrium rabeprazol diakses dengan membandingkan spektrum pada
tiga tingkat yang berbeda, yaitu posisi puncak-awal (S), puncak-puncak (M)
dan puncak-akhir (E) tempat.

5. Studi Recovery
Studi recovery dilakukan dengan menerapkan metode untuk sampel obat yang
diketahui jumlah rabeprazole natrium yang sesuai dengan 80%, 100% dan 120%
dari obat standar rabeprazole natrium telah terlihat berlebihan. Pada setiap
tingkat jumlah tiga penentuan dilakukan dan hasil yang diperoleh dibandingkan
dengan hasil yang diharapkan.

6. Analisis Formulasi yang dipasarkan

Untuk menentukan kandungan rabeprazole sodium dalam tablet konvensional (10
mg rabeprazole); kedua puluh tablet ditimbang, digerus menjadi bubuk halus
dalam mortar kaca. Sejumlah bubuk setara dengan 10 mg rabeprazole sodium
dipindahkan ke labu ukur 100 mL, diekstraksi dengan metanol, disonikasi selama
30 menit dan diencerkan. larutan yang dihasilkan disaring, menggunakan 0,45 μm
filter (Millifilter, Milford, MA). Larutan (10 μL, 1000 ng rabeprazole sodium) untuk
pengujian rabeprazole sodium. Bercak pada Rf 0,45 untuk rabeprazole sodium
diamati dalam densitogram yang diekstraksi dari tablet.

7. Forced degradation of standard rabeprazole sodium (untuk menguji stabilitas

tablet)
Dalam semua studi degradasi rata-rata puncak puncak rabeprazole sodium setelah
aplikasi (1000 ng spot -1) dari tujuh ulangan diperoleh. Plat dikembangkan dan
 dipindai dalam kondisi kromatografi. Area puncak dicatat untuk setiap konsentrasi
obat yang terdegradasi.

8. Persiapan produk degradasi yang diinduksi asam dan basa

10 mg rabeprazole sodium secara terpisah dilarutkan dalam 10 mL larutan
metanol 0,1 M HCl dan 0,1 M NaOH. Larutan ini disimpan selama 8 jam pada suhu
kamar dalam terhidar dari cahaya untuk menghindari kemungkinan efek degradasi
cahaya. 1 mL larutan di atas diambil dan dinetralkan, kemudian diencerkan hingga
10 mL dengan metanol. larutan yang dihasilkan diaplikasikan pada pelat RP-TLC
dalam rangkap tiga (masing-masing 10 μL, yaitu 1000 ng spot.

9. Degradasi hidrogen peroksida

10 mg rabeprazole sodium dilarutkan dalam 10 mL larutan metanol hidrogen
peroksida (10% v / v). disimpan selama 8 jam pada suhu kamar dalam gelap untuk
menghindari kemungkinan efek degradatif cahaya. 1 mL larutan di atas diambil
dan diencerkan hingga 10 mL dengan metanol. larutan yang dihasilkan
diaplikasikan pada pelat RP-TLC dalam rangkap tiga (masing-masing 10 μL, yaitu
1000 ng spot -1).

10. Produk degradasi panas kering

Serbuk Obat disimpan pada suhu 55 oC selama 2 jam dalam kondisi panas kering
menunjukkan degradasi yang signifikan. Produk yang terdegradasi diselesaikan
dari standar. Daerah puncak rata-rata natrium rabeprazole setelah aplikasi (1000
ng spot -1) dari tiga ulangan diperoleh.

11. Produk degradasi Fitokimia

10 mg rabeprazole sodium dilarutkan dalam 10 mL metanol. Solusinya disimpan di
bawah sinar matahari selama 8 jam. Larutan yang dihasilkan diaplikasikan pada
pelat RP-TLC dalam rangkap tiga (masing-masing 1 μL, yaitu 1000 ng spot -1).