LAPORAN TETAP

PRAKTIKUM BIOKIMIA

I. Nomor Percobaan : V

II. Nama Percobaan : Titrasi Formal Asam Amino

III. Tujuan Percobaan : Untuk mengetahui titik akhir titrasi antara gugus
karboksil dengan NaOH

IV. Dasar Teori

Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup
dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan didalam semua
sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi; ratusan jenis yang berbeda
dapat ditemukan dalam satu sel. (Lehninger, 1982)
Kunci struktur ribuan protein yang berbeda-beda adalah gugus pada
molekul unit pembangun protein yang relative sederhana. Semua protein, baik
yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan
tertinggi, dibangun dari rangkaian dasar yang sama dari 20 asam amino yang
berikatan kovalen dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino
mempunyai rantai samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masing-
masing individu, kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap
sebagai abjad struktur protein. (Lehninger, 1982)
Asam amino adalah senyawa organik yang
memiliki gugus fungsional karboksil (-COOH) dan amina (biasanya -NH2).
Dalam biokimia seringkali pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu
atom karbon yang sama (disebut atom C "alfa" atau α). Gugus karboksil
memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. Dalam bentuk
larutan, asam amino bersifat amfoterik: cenderung menjadi asam pada larutan
basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino
mampu menjadi zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa yang

1
paling banyak dipelajari karena salah satu fungsinya sangat penting
dalam organisme, yaitu sebagai penyusun protein.
Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C yang mengikat
empat gugus: gugus amina (NH2), gugus karboksil (COOH), atom hidrogen (H),
dan satu gugus sisa (R, dari residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping
yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya.
Gambar Struktur asam α-amino, dengan gugus amina di sebelah kiri dan
gugus karboksil di sebelah kanan

Atom C pusat tersebut dinamai atom Cα ("C-alfa") sesuai dengan

penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung
dengan gugus karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom C αini,
senyawa tersebut merupakan asam α-amino.
Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai
samping tersebut menjadi empat kelompok. Rantai samping dapat membuat asam
amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik jika
nonpolar.
Asam amino dalam bentuk tidak terion (kiri) dan dalam bentuk zwitter-
ion.

Karena asam amino memiliki gugus aktif amina dan karboksil sekaligus,
zat ini dapat dianggap sebagai sekaligus asam dan basa (walaupun pH alaminya
biasanya dipengaruhi oleh gugus-R yang dimiliki). Pada pH tertentu yang
disebut titik isolistrik, gugus amina pada asam amino menjadi bermuatan positif
(terprotonasi, –NH3+), sedangkan gugus karboksilnya menjadi bermuatan negatif

2
(terdeprotonasi, –COO-). Titik isolistrik ini spesifik bergantung pada jenis asam
aminonya. Dalam keadaan demikian, asam amino tersebut dikatakan
berbentuk zwitter-ion. Zwitter-ion dapat diekstrak dari larutan asam amino
sebagai struktur kristal putih yang bertitik lebur tinggi karena sifat dipolarnya.
Kebanyakan asam amino bebas berada dalam bentuk zwitter-ion pada pH netral
maupun pH fisiologis yang dekat netral.
Menurut Lehninger (1982), Asam amino dapat digolongkan berdasarkan
gugus R. Terdapat empat golongan asam amino: (1) golongan dengan gugus R
nonpolar atau hidrofobik, (2) golongan dengan gugus R polar, tetapi tidak
bermuatan, (3) golongan dengan gugus R bermuatan negatif, dan (4) golongan
dengan gugus R bermuatan positif.
1. Golongan dengan gugus R nonpolar atau hidrofobik
Gugus R dalam golongan asam amino ini merupakan hidrokarbon, dan
bersifat hidrofobik. Meliputi lima asam amino dengan gugus R alifatik
(alanin, valin, leusin, isoleusin, dan prolin), dua dengan lingkaran aromatic
(fenilalanin dan triptofan), dan satu yang mengandung sulfur (metionin).
2. Golongan dengan gugus R polar tidak bermuatan
Gugus R dari asam amino polar lebih larut di dalam air, atau lebih hidrofilik,
dibandingkan dengan asam amino nonpolar, karena golongan ini mengandung
gugus fungsionil yang membentuk ikatan hydrogen dengan air. Meliputi:
glisin, serin, treonin, sistein, tirosin, asparagin, dan glutamine.
3. Golongan dengan gugus R bermuatan negative
Mengandung gugus R dengan muatan total negative pada pH 7 adalah asam
aspartat dan asam glutamate, masing-masing mempunyai tambahan gugus
karboksil. Asam amino ini merupakan senyawa induk asparagin dan
glutamine berturut-turut.
4. Golongan dengan gugus R bermuatan positif
Asam amino yang mengandung gugus R dengan muatan total positif pada pH
7 adalah lisin, yang mengandung tambahan gugus amino (kedua) pada posisi
є di rantai alifatiknya; arginin, yang mengandung gugus guanidine bermuatan
positif; dan histidin yang mengandung gugus inidazol yang mengion sedikit.

3
 Di dalam larutan, asam amino terionisasi dan dapat bersifat sebagai asam
atau basa. Pengetahuan mengenai sifat-sifat asam basa dari asam amino amat
penting di dalam pengertian berbagai sifat protein. Tambahan lagi, seni
pemisahan, identifikasi, dan kuantifikasi asam amino yang berbeda, yang
merupakan tahap penting dalam menentukan komposisi dan urutan asam amino
dari molekul protein, didasarkan atas tingkah laku asam-basa yang khas.
Asam-asam α-amino yang mempunyai gugus amino tunggal dan gugus
karboksil tunggal mengkristal dari larutan netral dalam bentuk ion penuh, yang
disebut ion dipolar atau zwiterion . Walaupun ion dipolar bersifat netral dan tidak
bergerak di dalam medan listrik, ion ini mempunyai muatan listrik yang
berlawanan pada kedua kutubnya. Sifat dipolar asam amino pertama-tama
ditunjukkan oleh kenyataan bahwa kristal asam amino mempunyai titik lebur yang
jauh lebih tinggi dari titik didih molekul organic lain yang berukuran sama. Kisi
kristal asam amino dipertahankan oleh gaya elektrostatik yang kuat di antara
muatan positif dan negative gugus fungsionil molekul sekelilingnya, serupa
dengan kisi kristal ion NaCl yang stabil. Suhu yang amat tinggi harus diberikan
pada kisi ion tersebut, untuk memisahkan muatan positif dan negative yang
salaing berinteraksi secara kuat satu dengan yang lainnya, sehingga kristal dapat
melebur. Sebaliknya, kebanyakan senyawa organic nonionic sederhana yang berat
molekulnya sama, yang mempunyai titik didih yang relative rendah, sesuai
dengan kisi kristal nonioniknya yang relative ‘lunak’ dan tidak stabil.

Asam Amino Dapat Berperan Sebagai Asam dan Sebagai Basa

Jika suatu kristal asam amino, misalnya alanin, dilarutkan di dalam air,
molekul ini menjadi ion dipolar, yang dapat berperan sebagai suatu asam (donor
proton) atau sebagai basa (akseptor proton) . Senyawa yang mempunyai kedua
sifat ini dinyatakan sebagai amfoter
dan sering kali disebut sebagai ampolit, singkatan dari amfoteric
electrolytes. Asam monoamino monokarboksilat α-amino yang sederhana seperti
alanin, sebenarnya merupakan asam diprotik dalam keadaan semua molekul

4
mengikat proton, yaitu jika gugus karboksil dan gugus amino telah mengikat
proton. Dalam bentuk ini, asam amino mempunyai dua gugus yang dapat mengion
menghasilkan proton.

Asam Amino Mempunyai Kurva Titrasi yang Khas

Terdapat dua tahap yang nyata, masing-masing berhubungan dengan
pelepasan satu proton. Tiap-tiap tahap menyerupai bentuk kurva titrasi asam
monoprotik, seperti asam asetat dan dapat di analisis dengan cara yang sama. Pada
awal titrasi alanin, bentuk yang dominan adalah +NH3-CHR-COOH, bentuk
protonnya (di dalam rumus ini R melambangkan gugus metal dari alanin). Pada
titik tengah tahap pertama titrasi, gugus karboksil alanin akan kehilangan proton,
dan konsentrasi molar donor proton (+NH3-CHR-COOH) sama dengan konsentrasi
molar akseptor proton (+NH3-CHR-COO-).
Pada titik tengah titrasi, pH sama dengan pK’ dari gugus berproton yang
sedang dititrasi. Karena titik tengah pH mencapai 2,34, gugus karboksil alanin
mempunyai pK’ 2,34. Jika sekarang kita melanjutkan titrasi lebih jauh, kita akan
memperoleh titik lain yang penting, yakni pada pH 6,02. Disini, terdapat titik
belok, yang mencerminkan bahwa kita tel;ah menyelesaikan pembebasan proton
yang pertama dan mulai melepaskan proton yang kedua. Pada pH ini, alanin
terdapat, sebagian besar dalam bentuk ion dipolar +NH3-CHR-COO-.
Tahap kedua titrasi berhubungan dengan pembebasan proton dari gugus
+
NH3 alanin. Pada titrik tengah, kita memperoleh konsentrasi molar yang sama
bagi +NH3-CHR-COO- dan NH2-CHR-COO-. pH pada titik ini adalah 9,69, sama
dengan pK’ bagi gugus +NH3-. Titrasi sempurna terjadi pada pH kira-kira 12, pada
saat ini, sebagian besar alanin berbentuk NH2-CHR-COO-.

Muatan Formal
Muatan-muatan formal yang dijumlahkan seluruhnya, memberikan total
keseluruhan muatan molekul atau ion. Muatan formal juga dapat menjelaskan
kemungkinan tempat muatan dapat diketemukan dalam suatu molekul. Ingatlah
bahwa muatan formal akan sama dengan :

5
 Muatan Formal = (# electron valensi) – (# ikatan) – (# pasangan electron
bebas)
Sebagai contoh, perhatikan ion nitrit (NO 2-) . Pertanyaan utama
menyangkut lokasi secara tepat muatan-1 resminya berada. Keseluruhan ion
membawa muatan formal pada atom-atom yang mana muatan ini “resminya “
terletak?
Untuk menemukan jawabannya, mulailah dengan menggambarkan
diagram titik Lewis yang sebenarnya untuk NO 2-. Ingatlah bahwa jumlah muatan
formal pada atom-atom sama dengan keseluruhan muatan dari molekul (-1).
Diagram ini juga mengungkapkan bahwa muatan -1 ditempatkan pada oksigen
dengan satu ikatan. Sebenarnya nitritmempunyai diagram titik Lewis yang lain
dan yang ekuivalen (struktur resonansi) tempat muatan -1 diletakkan pada atom
oksigen yang lain.

V. Alat dan Bahan

Alat: Bahan:
1. Pipet tetes 1. Indikator PP
2. Gelas Kimia 2. Formalin
3. Gelas ukur 3. Larutan NaOH
4. Bunsen 4. Larutan HCl
5. Kawat kasa 5. Tripsin
6. Batang pengaduk 6. Gelatin
7. Penangas air
8. Statif
9. Klem
10. Buret
11. Erlenmeyer

6
VI. Prosedur
Menyiapkan 100 ml gelatin 5%. Mengatur temperature 38oC.
Menambahkan ke dalamnya 1 ml indikator PP dan 0,2M NaOH tetes demi
tetes sampai tepat warna merah muda. Kemudian menambahkan tetes
demi tetes 0,1M HCl sampai warna merah muda tadi hilang (pH = 8,0).
Hati-hati jangan terlalu asam. Masukan gelatin yang telah di netralisir tadi
ke dalam incubator 38oC. Pada 25ml larutan tripsin menambahkan
beberapa tetes PP. Menambahkan tetes demi tetes 0,2M NaOH sampai
warna merah muda. Kemudian menambahkan tetes demi tetes 0,1M HCl
samapi warna tersebut tepat hilang (pH – 8,0). Tepat pada jam “nol”
menambahkan larutan tripsin tersebut ke dalam gelatin. Mengaduknya!
Setelah tercampur rata, mengambil 10ml campuran, memasukkannya ke
dalam 100ml beker gelas. Mendidihkannya untuk merusak enzim.
Mencatat waktunya, dinginkan. Menambahkan 15ml formalin
netral dan 3 tetes indikator PP. Pada interval 15 menit melakukan hal yang
sama seperti di atas. Semua ini dilakukan duplo. Pada masing-masing hasil
reaksi diatas (interval 0, 15, 30, 60, 90, dan 120 menit) melakukan titrasi
dengan 0,02M NaOH dengan titik akhir warna merah muda.

VII. Hasil Pengamatan

 Tabung 1 (Gelatin)
Sebanyak 100 ml gelatin (kuning bening) ditambahkan dengan 1ml
phenolphthalein dan ditetesi dengan NaOH 0,2 M sebanyak 4ml, larutan gelatin
berwarna merah muda. Lalu ditetesi dengan 16 tetes HCl 0,1M, larutan menjadi
warna kuning bening.

 Tabung II (Urine)
Urine 100ml (kuning bening) ditambahkan dengan 1 ml PP dan ditetesi
dengan NaOH o,2 M sebanyak 3 ml. larutan urine berubah warna menjadi merah
muda. Kemudian ditetesi dengan HCl 0,1 10 tetes, larutan menjadi kuning bening.

7
 Tabung I (Gelatin) + Tabung II (urine)

10 ml campuran antara gelatin+urine ditambahkan 15ml formalin+ 3

tetes penolthaplein dan dititrasi dengan NaOH 0,02 M, larutan menjadi
merah muda.

Table interval waktu

No Waktu Tabung V.NaOH (ml) V.NaOH rata-rata
1 8,7
1 t = 0’ 8,95
2 9,2
1 9
2 t = 15’ 9.25
2 9,5
1 9,25
3 t = 30’ 9.5
2 9,75
1 9,5
4 t = 60’ 9.65
2 9,8
1 10
5 t = 90’ 10.05
2 10,1
1 10,2
6 t = 120’ 10.3
2 10,4

8
VIII. Persamaan Reaksi

 Reaksi pada Inkubator

O
O O
- C – N – CH – C – N – CH - Tripsin 2 R – CH- C
H R H R 
NH2 OH
Protein Asam Amino

 Reaksi pemanasan untuk merusak enzim tripsin

O H O

R – CH – C R – C- C
 
NH2 OH NH3+ O-
Asam Amino Ion dipolar

 Reaksi jika ditambahkan formalin

H O H
 
R–C–C + 2CH2O R – C – COOH
 
NH3+ O- HOH2C – N – CH2OH

Ion dipolar Formalin Metil diol

 Reaksi Titrasi

H H O
 
R – C – COOH + NaOH R–C–C
  ONa
HOH2C – N – CH2OH HOH2C – N – CH2OH

Metil diol Natrium hidroksida Natrium metil diol

9
IX. Analisis Data

Waktu (X) V.NaOH (Y) XY X2 Y2

t = 0’ 7,25 0 0 52,5625
t = 15’ 8,15 122,25 225 66,4225
t = 30’ 9,05 271,5 900 81,9025
t = 60’ 9,4 564 3600 88,36
t = 90’ 9,7 873 8100 94,09
t = 120’ 10 1200 14400 100
∑=315 53,55 3030,75 27225 483,3375

n . ΣXY −ΣxΣY
Slope =
n ΣX 2−¿¿
(6)(3030,75)– (315)(5 3,55)
= ( 6 )( 27225 )−¿ ¿

18184,5−16868,25
=
163350−99225
1316,25
=
64125
= 0.0205263

ΣX 2 ΣY −ΣxΣXY
Intersept =
n ΣX 2−¿¿
(27225)(53,55) – (315)(3030,75)
= ( 6 )( 27225 ) −¿ ¿

1457898,75−954686,25
=
163350−99225
503212,5
=
64125
= 7,8473
Persamaan Garis Lurus : y = bx+a
y = 0.0205263x + 7,8473
X 0 1 2 3 4 5
Y 7,8473 7,8678 7,8883 7,9088 7,9294 7,9499

10
 Perhitungan mg N asam amino
(Anggap 1 ml NaOH 0,1 N equivalen dengan 1,4 mg N asam amino)
V rata−rata NaOH
mg N asam amino = × 1,4 mg
1 ml
7,25 ml
 t 0’ = ×1,4 mg = 10,15 mg
1ml
8,15 ml
 t 15’ = × 1,4 mg = 11,41 mg
1 ml
9,05 ml
 t 30’ = × 1,4 mg =12,67 mg
1 ml
9,4 ml
 t 60’ = ×1,4 mg = 13,16 mg
1 ml
9,7 ml
 t 90’ = ×1,4 mg = 13,58 mg
1 ml
10 ml
 t 120’ = × 1,4 mg = 14 mg
1ml

X. Pembahasan
Percobaan titrasi formal ini bertujuan untuk mengetahui titik akhir
titrasi antara gugus karboksil dengan NaOH. Asam amino yang digunakan
pada percobaan totrasi formal asam amino ini adalah gelatin dan tripsin.
Karena pada prinsipnya titrasi formal ini adalah titrasi asama basa, maka
formalin, tripsin, dan gelatin yang digunakan pada percobaan harus
dinetralkan dulu supaya tidak mengganggu hasil percobaan nantinya.
Kondisi bahan-bahan yang tidak netral akan merubah kebutuhan Natrium
Hidroksida dalam mentitrasi sampel. Apabila hal itu terjadi, maka data
yang diperoleh tidak valid karena tidak sesuai dengan yang seharusnya.
Setelah dinetralkan, selanjutnya larutan protein tersebut
dimasukkan ke dalam incubator. Inkubasi larutan dilakukan pada suhu
38oC. Hal ini disesuaikan dengan kondisi optimum aktivitas enzim untuk
bereaksi dengan substrat dalam menghasilkan asam amino (produk).

11
 Masing-masing asam amino tersebut ditambahkan indikator PP dan
formalin. Penambahan ini bertujuan untuk membentuk dimentiol. Dengan
adanya dimentiol ini berarti gugus amino dari asam amino tersebut terikat.
Penambahan ini tidak akan mempengaruhi titrasi antara gugus karboksil
dan NaOH. Terbentuknya dimentiol ini dapat menunjukkan titik akhir
titrasi yang ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi merah
muda.
Pada percobaan ini juga dilakukan pemanasan. Pemanasan itu
dimaksudkan agar enzim yang terdapat di dalam protein rusak.
Penghentian aktivitas enzim ini akan memberikan nilai/angka pasti
terhadap produk yang dihasilkan, sehingga jumlah asam amino yang
terbentuk tepat dan tidak bertambah lagi ketika proses titrasi berlangsung
dan dapat diperhitungkan dengan benar.
Gugus asam amino produk yang dihasilkan oleh reaksi enzimatik
antara tripsin dan gelatin pada larutan sampel yang dititrasi oleh Natrium
Hidroksida adalah gugus NH3+ yang bersifat asam, oleh karena ini titrasi
ini pada prinsipnya dikatakan tritrasi asam basa. Kurva kebutuhan Natrium
Hidoksida yang dibutuhkan untuk menetralkan gugus NH 3+ pada titrasi
formol ini dibandingkan dengan waktu/lama masa inkubasi menunjukkan
garis yang terus naik dan kemudian menjadi hampir datar. Ini
menunjukkan bahwa pada masa inkubasi yang paling lama tersebut,
jumlah substrat sudah habis bereaksi dengan enzimnya. Sehingga produk
asam amino pada larutan memberikan konsentrasi yang konstan/tetap.
Laju pembentukan asam amino yang paling cepat terjadi pada
kisaran 0-15 menit dari awal. Hal ini mungkin saja terjadi karena kuantitas
asam amino yang ada pada saat itu masih cukup banyak dan kondisi
aktivitas enzimatik yang sangat optimal sehingga laju nya paling cepat.

XI. Kesimpulan

12
 1. Titrasi formal ini bertujuan untuk mengetahui titik akhir titrasi antara
gugus karboksil dengan NaOH.
2. Prinsipnya titrasi formol ini adalah titrasi asama basa.
3. Pemanasan sampel larutan setelah masa inkubasi dimaksudkan untuk
menghentikan aktivitas enzim sehingga tidak lagi bereaksi dengan
substrat. 
4. Lama waktu kontak antara enzim dan substrat mempengaruhi jumlah
asam amino yang dihasilkan selagi substrat masih tersedia.

XII. Daftar Pustaka

Andi. 2010. Titrasi Formol Asam Amino, (Online),
(http://andiscientist.blogspot.com/2010/08/titrasi-formol-asam-amino.html,
diakses tanggal 12 April 2012).

Lehninger, 1982. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : Erlangga

Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI.

13
XIII. Gambar Alat

Pipet Tetes Erlenmeyer

Beker gelas Batang pengaduk

Buret
Gelas Ukur

14
 Bunsen spiritus Penangas Air

XIV. Jawaban Pertanyaan

Pertanyaan:

15
 1. Buatlah kurva titrasi antara volum alkali (ordinat) terhadap waktu (absis)
2. Buat kurva antara mg nitrogen asam amino (ordinat) terhadap waktu
(absis)
3. Mengapa harus ditambahkan alkali pada formalin sampai merah muda dan
phenoltaflein?
4. Apa tujuan dilakukan titrasi formal ini?

Jawaban:

1. Kurva 1. Kurva volum titrasi NaOH terhadap waktu

12

10

8
volume NaOH

0
0 20 40 60 80 100 120 140
waktu

2. Kurva 2. Kurva mg N asam amino terhadap waktu

16
 16

14

12
mg N asam amino

10

0
0 20 40 60 80 100 120 140
Waktu

Kurva y = 0.0205263x + 7,8473

7.96

7.94

7.92

7.9

7.88

7.86

7.84

7.82

7.8

7.78
0 1 2 3 4 5 6

3. Karena dengan ditambahkan alkali pada formalin maka akan terbentuk

dimethiol dan dengan terbentuknya dimethiol ini berarti gugus anionnya
sedah terikat, sehingga tidak mempengaruhi reaksi antara asam dengan
basa (NaOH) dan titik titrasi dapat ditentukkan dengan tepat. Penambahan
pp berguna untuk menunjukkan titik akhir titrasi dengan perubahan warna.

17
4. Untuk mengetahui titik akhir titrasi antara gugus karboksil dengan NaOH.

18