Nama : Hadi Birnando

NIM : 161810301050
1. Yang dibutuhkan untuk proses kloning adalah sel inang, plasmid, fragmen DNA , enzim
restriksi, enzim ligase. Sel inang adalah tempat penyimpanan gen atau fragmen DNA yang
telah di klon. Fragmen DNA adalah suatu fragmen yang digunakan sebagai gen yang nantinya
akan diperbanyak. Plasmid adalah tempat yang berfungsi sebagai wadah DNA sisipan. Enzim
restriksi adalah enzim yang digunakan untuk memotong DNA. Enzim ligase adalah enzim
yang digunakan untuk penyambungan DNA
2. Komponen Plasmid,
Secara umum, plasmid terdiri dari tiga komponen utama yang meliputi:
Asal replikasi (replicon) – Asal usul replikasi (ori) mengacu pada lokasi spesifik di untai di
mana replikasi dimulai. Untuk plasmid, lokasi ini sebagian besar terdiri dari pasangan basa A-
T yang lebih mudah dipisahkan selama replikasi.
- Dibandingkan dengan DNA organisme yang terdiri dari banyak asal replikasi, plasmid
memiliki satu dari beberapa asal replikasi karena ukurannya lebih kecil. Pada asal replikasi,
plasmid juga mengandung sejumlah elemen pengatur yang berkontribusi pada proses (mis.
Protein Rep)
- Polilinker (beberapa situs kloning) – Dalam plasmid, polylinker (MCS) adalah salah satu
bagian terpenting dari molekul. Ini karena memungkinkan siswa untuk belajar lebih banyak
tentang kloning. Pada dasarnya, plasmid polilinker adalah urutan pendek DNA yang terdiri
dari beberapa situs untuk pembelahan oleh enzim restriksi. Dengan demikian, plasmid ini
memungkinkan penyisipan DNA yang mudah melalui ligasi atau restriksi enzim restriksi. Di
lokasi belahan dada, polylinker yang berbeda dapat memotong untai. Oleh karena itu, salah
satu enzim restriksi dapat memotong plasmid pada titik yang diberikan oleh sang pejantan
untuk memungkinkan penyisipan DNA.
- Gen resistensi antibiotik – Gen resistensi antibiotik adalah salah satu komponen utama
plasmid. Gen-gen ini memainkan peran penting dalam resistensi obat (terhadap satu atau
lebih antibiotik) sehingga membuat pengobatan beberapa penyakit lebih menantang.
Beberapa komponen lain dari plasmid termasuk: Wilayah promotor – Ini adalah komponen
plasmid yang terlibat dalam merekrut mesin transkripsi.
Situs pengikatan primer – Kompoen plasmid ini adalah sekuens pendek DNA pada untai
tunggal yang biasanya digunakan untuk keperluan amplifikasi PCR atau sekuensing DNA
Nama : Hadi Birnando

NIM : 161810301050

3. Tahapan-tahapan dalam mengkloning suatu gen adalah sebagai berikut :

1. Suatu fragmen DNA yang mengandung gen yang akan dikloning pertama-tama diinsersikan
dulu pada molekul DNA sirkular yang disebut sector untuk menghasilkan molekul DNA
rekombinan atau chimoera.
2. Vektor kemudian bertindak sebagai pembawa DNA rekombinan tersebut untuk masuk ke
dalam tuan rumah biasanya berupa bakteri, maupun sel-sel jenis lainnya yang bisa
digunakan. Kemudian vector mengadakan replikasi dalam sel tuan rumah yang
menghasilkan banyak turunan-turunan identik, baik vektornya sendiri, maupun gen yang
dia bawa.
3. Ketika sel tuan rumah membelah, kopi molekul DNA rekombinan diwariskan pada progeny
dan terjadi replikasi vektro selanjutnya. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel,
maka dihasilkan koloni atau sel kloningan yang identik. Tiap-tiap sel dalam klon
mengandung satu atau lebih kopian molekul DNA rekombinasi. Dengan demikian, dapat
dikatakan bahwa, gen yang dibawa oleh molekul rekombinasi telah diklon.
Kloning merupakan salah satu bentuk penemuan dari para ilmuwan untuk dalam rangka
perolehan keturunan yang sampai sekarang, detik ini juga, terus menerus mendapat pro dan
kontra dari masyarakat. Diawali dari lahirnya dolly sebagai hewan hasil kloningan pertama,
sampai munculnya isu-isu tentang bayi perempuan bernama Eve yang dikatakan
merupakan manusia kloningan pertama yang pernah dibuat oleh manusia.

4. Pemilihan host (inang) perlu diperhitungkan karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel
inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel
inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel¬sel
transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk
mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang
diinginkan. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi
dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal, (2)
sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor
rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
Nama : Hadi Birnando

NIM : 161810301050
Untuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang
terjadi pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat
dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara
kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika
sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat
dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi. Seleksi sel rekombinan yang
membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut
menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro
menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR).

5. Proses restriksi molekul DNA dan vektor merupakan tahap yang paling penting dalam cloning
gen dengan ukuran yang tepat. Tiap vektor dipotong pada posisi tunggal yang berfungsi untuk
membuka lingkaran. Hal ini bertjuan agar molekul DNA baru dapat diinsersikan. Enzim
restriksi adalah enzim yang mampu membelah molekul untai ganda DNA pada suatu
pasangan sekuen nukleotida tertentu. Enzim restriksi dibagi menjadi 3 tipeya itu komposisi
subunit, posisi pemotongan, spesifisi tassekuens dan kofaktor yang diperlukan. Jenis dari
enzim restriksi ada dua yaitu enzim restriksi tipe I dan enzim restriksi tipe II. Enzim restriksi
tipe I adalah enzim yang mengenali sekuen tertentu namun memotong di daerah lain, dan
enzim restriksi tipe II merupakan enzim yang dapat memotong hanya dalam situs pengenalan.
Enzim restriksi dapat membuat dua potongan untai tunggal dimana satu potong di masing-
masin guntai. Pengaturan pemotongan enzim restriksi ada dua yaitu:
(1) potongan di pusat simetri (menghasilkan ujung tumpul) atau
(2) potongan yang simetris, ditempatkan di sekitar garis simetri (menghasilkan ujung kohesif
atau ujung lengket).
Pada proses kloning gen, enzim restriksi endonuklease yang digunakan umumnya adalah tipe
II karena dapat memotong DNA pada sisi spesifik, sehingga dihasilkan polapotongan spesifik.