A.

Pendahuluan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) merupakan salah satu metode fisikokimia berdasarkan pada teknik kromatografi di mana
fase geraknya berupa cairan dan fase diam dapat dalam bentuk cair atau padat.

Metode ini sangat bermanfaat di bidang farmasi untuk menganalisis secara simultan beberapa analit
dalam martiks sederhana maupun kompleks.

Pada akhir 1960-an, semakin banyak usaha untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu
teknik untuk mengimbangi kromatografi gas.KCKT adalah kromatografi cair kolom modern, yang
dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi kolom menjadi suatu sistem pemisahan yang
cepat dan efisien.

Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan peningkatan performa kolomnya
yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel yang jauh lebih kecil dari kolom
yang dipakai pada kromatografi kolom, sehingga agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase
gerak dipompa dengan tekanan tinggi.Di samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung
dengan adanya berbagai sistem deteksi dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan
sistem kromatografinya.

KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi gas (KG), keduanya dapat digunakan
untuk menghasilkan efek pemisahan yang sama baiknya. Bila derivatisasi diperlukan dalam KG,
namun pada KCKT zat- zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis.Untuk zat-zat yang labil pada
pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti
KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan lebih besar dalam analisis.

B. Sejarah Singkat

Istilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang
bergerak kebawah kolom.Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan
kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui
sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.Penyelidikan tentang
kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk
kromatografi padatan cair (LSC).

Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan
Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958.Hasil karya yang baik sekali dari
Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah
dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan
kromatografi gas dan kromatografi kertas.Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan
makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an
kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih (Sudjadi, 1986).

Kromatografi cair kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dimana fase cair
yang mengalir perlahan-lahan melewati kolom akibat gaya gravitasi dan terjadi proses pemisahan di
kolom tersebut. Metode itu dicirikan dengan efisiensi kolom yang rendah dan waktu pemisahan
yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam teknik kolom cair kembali dilirik
dengan dikembangkannya sistem kolom bertekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang mampu
bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2 (3000p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom
berdiameter kecil (1-3 mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 nm dan eluen
dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-

Page 5

1).Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada
dengan kromatografi cair yang biasa (Bassett et. all., 1994).

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya
dibawah kondisi atmosfer.Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat
membosankan.Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan
kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance =
Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed= Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah
berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan
kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian
membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu.Tentu saja, saat ini dengan
teknik yangsudah matang dan dengan cepat HPLC mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan
kromatografi gas (Putra, 2004).

Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari
kromatografi kolom.Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan
bermacam diameter.Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang
stasioner.Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup
menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam.Secara keseluruhan
pemisahan ini memakan waktu lama.Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran
tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom.Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak
selalu menguntungkan.Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid
chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik.HPLC menggunakan kolom dengan
diameter umumnya kecil, 2-8
mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan
yang tinggi (Khopkar, 2003).

HPLC telah digunakan di Indonesia sejak tahun 1997 oleh Wiadnyana dalam penelitiannya yang
bertema menguji dan menentukan kadar toksisitas berbagai macam fitoplankton di perairan laut.
Selain digunakan untuk uji toksisitas, dalam bidang Biokimia HPLC kerap digunakan untuk
menghitung kadar vitamin dan protein dari suatu makanan atau sampel. Singkatnya, HPLC
merupakan sebuah metode analisa modern yang multifungsi dan sudah ada di Negara kita
Indonesia.Oleh karena itu ijinkan penulis untuk bercerita sedikit tentang High Perfomance Liquid
Chromatography.

C. Prinsip Kerja

berdasarkan kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang
akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah
menjadi senyawa- senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan
tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias)
pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh
recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan personal
computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.Yang paling membedakan HPLC
dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa
gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan kecepatannya untuk sampai
kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spectrum yang puncak-
puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon <
senyawa terhalogenasi < golongan

Prinsip dasar dari HPLC adalah

pemisahan analit-analit

eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol < golongan asam.

a. Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara
otomatis sehingga tidak bisa mengetahui yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena
proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.Sampeldiinjeksi
dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall . Dari injection hallini proses
utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolomoleh LC20AT
 dalam tekanan tinggi.

b. Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk
bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagaiwaktu retensi.Waktu retensi diukur
berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian
puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu
retensi yang berbeda pula. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi
dan bergantung pada:

  Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut).

  Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel).

  Komposisi yang tepat dari pelarut.

  Temperatur pada kolom

c. Detector
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah

melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan
ultra- violet.Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang
gelombang.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui
berkas pada waktu itu.
d. Interpretasi output dari detector
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili
satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda
mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi
senyawa yang diperoleh

.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini
dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang berwarna
hijau dalam gambar (sangat sederhana).

D. Bagian Alat dan Fungsinya

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan
suatu

komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair dapat dilihat
pada gambar di bawah ini :

1. Wadah fase gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.Wadah ini biasanya dapat menampung fase
gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing
(penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu
detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran
pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel.Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut.Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut.
Fase Gerak

Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut.Selain berfungsi
sebagai pembawa komponen- komponen campuran campuran menuju detector, fase gerak dapat

berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC merupakan salah satu
faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

Persyaratan fase gerak HPLC:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan
yang akan dianalisis.

2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya

kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.

3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada

kolom.

4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan
tidak beracun.
 5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP
(centi Poise).

6. Sesuai dengan detector.

2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana
syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai
untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam.Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit.Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran
fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang

konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.Tiga jenis
pompa yang digunakan dalam HPLC:

a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston
mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan
pelarut.Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya
ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang
pompa didorong masuk ke dalam kolom.

b) Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang
digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada
tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.

c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis ini murah dan bebas
pulsa.Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta
kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.

3. Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum
dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis
atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampelloop dengan
variabel volume (misalnya 20 – 500 μL).

 Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak
dipengaruhi

b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi
Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir.Tetapi septum ini tidak tahan
dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat
jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10
μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang
lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada
kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

Gambar 1. Posisi pada saat memuat sampel

Gambar 2. Posisi pada saat menyuntik sampel

 Syarat- syarat injektor yang baik :

- Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk
sesempit mungkin.
- Mudah digunakan
- Keberulangan tinggi

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan
bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni:

  Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10
-100 μl/menit).

  Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.

  Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis
kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.Permukaan silika
adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Page 14

Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan.
Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena
mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar.Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi.
Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena
adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecil.

c. Stabil dalam pengopersiannya.

d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.

e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).

f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Page 15

Detektor

Sensitifitas

Kisaran

Karakteristik
(g/ml)

linier

Absorbansi Uv-vis

Fotometer filter Spektrofotometer spektrometer photo- diode array

-10
5 x 10

-10 -10
5 x 10 > 2 x 10

4 5 5
10 10 10

Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur
yang tidak

jenuh.

Fluoresensi

-12
10

4
10

Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase
gerak.
Indeks bias

-7
5 x 10

4
10

Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan
tidak dapat digunakan pada elusi bergradien

Elektrokimia

Konduktimetri Amperometri

-8
10 -12
10

4 5
10 10

Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi
bergradien. Hanya

mendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan
adanya kontaminasi elektroda.

Page 16

JENIS SAMPEL

Sampel cair:
   Eksktraksi Cair-Cair

  Ekstraksi Fase Padat (SPE)

  Pemisahan dengan membran

  Distilasi (untuk beberapa sampel)

  Liofilisasi (untuk sampel biologi)

Sampel padat.

  Pengurangan ukuran sampel

  Pengeringan dan pencetakan

  Pelarutan dalam pelarut yang sesuai

  Ekstraksi

  Derivatisasi: Pembentukan senyawa derivat yang dapat

terukur oleh instrtument atau terdeteksi oleh detektor.
E. Metode Preparasi Sampel
a. Ekstraksi
Perlakuan ini dapat dikerjakan dengan berbagai cara, baik
secara fisik maupun secara kimiawi. Secara fisik dapat dilakukan dengan pengepresan
(pengempaan), penggilingan, pengendapan fisik (kristalisasi), pengendapan kimiawi
(penggumpalan), dan distilasi. Secara kimiawi dilakukan dengan cara pelarutan dengan
pelarut.
Metode distilasi merupakan ekstraksi dan pemisahan atas dasar perbedaan titik uapnya.
Distilasi dapat dilakukan dengan cara sederhana, misalnya distilasi air, distilasi uap, distilasi
uap dan air, dapat pula dilakuan dengan teknik fraksinasi (distilasi fraksinasi), atau distilasi
vakum. Cara ekstraksi lainnya yang relatif merupakan

teknologi barn adalah penggunaan teknik superkritik (super critical extraction).

b. Filtrasi
Filtrasi adalah cara untuk memisahkan dua komponen yang
berbeda sifatnya atau ukurannya melalui sebuah membran permiabel yang porous. Filtrasi dapat
dilakukan dengan teknik penyaringan.Penyaringan lazim digunakan untuk memisahkan padatan dan
cairan yang bercampur menjadi satu dan tidak lazim untuk memisahkan campuran dua macam
cairan yang berbeda berat jenisnya.

Penyaringan menggunakan bahan penyaring yang berupa membran.Sebagai membran dapat

digunakan kain saring, kapas, glasswool, kertas selulosa, membran silika, membran millipore,
poliester atau nilon, dan sebagainya. Bahan-bahan lain yang dapat digunakan untuk menyaring
adalah polietilen, polipropilen, fluorokarbon, dan benang halus logam baja tahan karat.

Partikel-partikel halus atau molekul-molekul harus disaring dengan membran yang mempunyai
pori-pori lebih kecil, yang bahan- bahannya juga dapat berupa selulosa, selulosa ester, polikarbonat,
nion, atau politetra fluoroetilen. Hal yang terpenting sebagai bahan penyaring adalah harus bersifat
inert artinya
Tidak bereaksi dengan bahan yang disaring.Selain itu bahan penyaring harus tahan panas, tidak
terpengaruh oleh asam atau basa dan tidak mempengaruhi pH bahan yang disaring.

Membran-membran yang porous, tergantung pada garis tengah lubang pori-porinya maka hanya
partikel-partikel padatan yang lebih kecil atau sama dengan garis tengah pori-pori tersebut dapat
melaluinya. Atas dasar inilah penyaringan selalu akan menghasilkan filtrat yang masih mengandung
partikel-partikel padatan yang dapat berupa butiran kasar, halus, atau berupa molekul- molekul.

c. Homogenisasi
Jika sampel mempunyai sifat-sifat yang terdistribusi tidak

merata, maka perlu dilakukan homogenisasi. Homogenisasi juga mempunyai tujuan lainnya, yaitu
untuk menyesuaikan ukuran atau kondisi sampel sehingga memudahkan teijadinya proses kimiawi
(misalnya reaksi, interaksi, dll.), proses fisikawi (misalnya difusi panas, dll.). Homogensisasi dapat
dilakukan dengan alat homogenizer, chopper, warring blender, menggunakan metode penggilingan
(penepungan), vortexing, penggojogan, dll.

d. Sentrifugasi
Tujuan utama sentrifugasi adalah memisahkan partikel-
partikel padatan dari cairan yang bercampur. Jadi sama seperti filtrasi, tetapi pemisahan
dengan sentrifugasi didasarkan pada perbedaan berat jenis partikel. Dalam hal ini gaya
sentrifugasi sangat berpengaruh pada hasil. Makin tinggi gaya sentrifugasi, makin terjadi
pemisahan dengan baik.
Pada umumnya gaya sentrifugasi dinyatakan dalam satuan “rotation per minute” (rpm).
Satuan ini tidak menunjukkan keseragaman gaya pusingan yang terjadi untuk satu alat
dengan alat yang lain yang berbeda demensinya meskipun kecepatan berputarnya sama.
 Untuk mengatasi hal ini, gaya sentrifugasi dapat dinyatakan dengan “relative centrifugal
force” (rcf).

e. Lisis
Lisis umumnya dilakukan untuk merusak atau memecah
dinding sel tanaman, hewan, atau mikroba.Lisis dapat dilakukan secara fisik misalnya
dengan penggilingan, penggerusan, atau dengan sonikasi.Seringkali dinding sel terlalu keras
atau lentur, terutama sel-sel mikroba, sehingga dengan perlakuan fisik tidak

dapat terjadi lisis dengan sempurna. Untuk mengatasi hal tersebut dapat dilakukan dengan cara
kimiawi, misalnya dengan menggunakan asam pekat seperti asam sulfat, asam klorida, asam asetat,
dan sebagainya.

f. Dialisis
Dialisis merupakan teknik pemisahan menggunakan
membrane semipermiabel.Dialisis dapat berfungsi sebagai penyaring molekuler dan bekerja
atas dasar peristiwa osmosis.Dalam prakteknya, dianalisis digunakan untuk menghilangkan
kontaminan molekul-molekul yang tidak dikehendaki. Partikel-partikel (molekul) yang kecil
akan melalui membran sampai terjadi keseimbangan. Keseimbangan tercapai jika
konsentrasi partikel dalam larutan pada sisi-sisi yang bersebelahan dengan membran, sudah
mencapai rasio yang seimbang dengan volume masing-masing larutan, yaitu C1:C2 = V1 /
(V1+V2 ) dimana C adalah konsentrasi dan V adalah volume larutan.

g. Inaktivasi Enzim
Terdapatnya enzim seringkali mengganggu hasil karena
enzim yang masih aktif dapat mengadakan perubahan-perubahan kimiawi, misalnya pada
elektroforesis, enzim protease dapat menguraikan protein atau peptide-peptida selama proses
elektroforesis berlangsung. Enzim amilase dapat menguraikan gel tepung yang digunakan
sebagai media elektroforesis karbohidrat.
Inaktivasi enzim dapat dilakukan secara fisik, misalnya dengan pemanasan, atau secara
kimiawi menggunakan denaturan (misalnya urea, guanidin hidrokiorida, merkaptoetanol,
sodium dodesil sulfat, asam trikioro asetat, dsb.), mengubah kondisi pH lingkungannya,
menambahkan garam (NaC1), dsb.
Page 20
h. Modifikasi Kimiawi dan Enzimatik
Perlakuan ini bertujuan mengubah struktur kimiawi sampel

untuk tujuan tertentu yang memudahkan analisis. Modifikasi kimiawi dapat dilakukan dengan cara
derivatisasi, misalnya metilasi pada asam lemak, dan penambahan agensia derivat seperti opa
(ortoftalaldehida), ninhidrin, fluoroscamine, fenilisotiosianat, dan sil kiorida, dabsil klorida,
diaminoazobenzenisotiosianat, atau fluoronilmetilkioroformat untuk derivatisasi asam amino.

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara analit dengan reagen untuk mengubah sifat fisika-
kimia suatu analit.Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column
derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).
Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC antara lain:

1. Meningkatkan deteksi

2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan

menghasilkan puncak
kromatografi yang lebih baik

3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik

4. Menstabilkan analit yang sensitif

Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut:

1. Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap, baik sinar ultraviolet atau sinar tampak
atau dapat membentuk senyawa berfluoresen, sehingga dapat dideteksi dengan
spektrofluorometri

2. Proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100%)

3. Produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi

4. Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi

Berbagai macam bahan penderivat antara lain:
 Page 21

Gugus fungsi onal

Reagen untuk dapat dideteksi dengan UV-Vis

Reagen untuk dapat dideteksi dengan Fluoresen

Asam- asam

p-nitrobenzil- N,N’

4- bromometil-

kaboks ilat; Asam- asam lemak; Asam- asam fosfat

diisopropilisourea (PNBDI); 3,5- dinitrobenzil- N,N’- diisopropilisourea (DNBDI); p- bromofenasil

bromida (PBPB)

7- asetoksikum arin;
4- bromometil- 7- metoksikum arin;

Alkoh ol

3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); 4- dimetilaminiazobe nzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-

naftilisosianat (NIC-1).

p- nitrobenziloksiam in hidroklorida (PNBA); 3,5- dinitrobenziloksia min hidroklorida (DNBA);

Aldehi d; Keton

Dansil hidrazin

Amina primer

Fluoresamin o-
Page 22

ftalaldehid (OPA)

3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC);N- suksinimidil-p- nitrofenilasetat

7-kloro-4- nitrobenzo- 2-oksa-1,3- diazol

Amina

o o
primer (1 ) dan sekund er (2 )

(SNPA);N- suksinimidil-3,5- dinitrofenilasetat (SDNPA); 4- dimetilaminiazobe nzen-4-sulfinil

(Dabsyl-Cl); 1- naftilisosianat (NIC-1).

(NBD-Cl); 7-fluoro-4- nitrobenzo- 2-oksa-1,3- diazol (NBD-F); Dansil klorida

Asam- asam amino (peptid a)

4- dimetilaminiazobe nzen-4-sulfinil (Dabsil-Cl)

Fluoresamin o- ftalaldehid (OPA) 7-kloro-4- nitrobenzo- 2-oksa-1,3- diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-
nitrobenzo- 2-oksa-1,3- diazol (NBD-F)

Page 23

Cara modifikasi kimiawi lainnya adalah denaturasi. Hal ini dilakukan khusus untuk protein dengan
beberapa tujuan, yaitu (1) memutus ikatan-ikatan tertentu yang bersifat nonkovalen sehingga
struktur protein menjadi membuka dan (2) memutuskan ikatan S-S yang bersifat kovalen yang
terdapat pada protein terutama protein quaterner. Denaturasi juga bertujuan menginaktifkan enzim
atau peptida bioaktif lainnya.Hidrolisis kimiawi juga merupakan modifikasi kimiawi.Hidrolisis
kimiawi dapat berlangsung jika ada air. Perlakuan panas pada hidrolisis ditujukan untuk
mempercepat berlangsungnya proses.

Modifikasi enzimatik urnumnya bertujuan memecah makromolekul menjadi fraksi-fraksi kecil atau
penyusunnya. Hal ini dapat dilakukan dengan cara hidrolisis enzimatik, misalnya protein dipecah
menjadi peptida dan asam-asam amino dengan menggunakan protease seperti pepsin, tripsin,
kimotripsin, dll, lemak dipecah oleh lipase menjadi gliserol dan asam-asam lemak, dan karbohidrat
dipecah menjadi penyusun-penyusunnya oleh amilase atau selulase, atau oleh karbohidrase yang
lain.

F. Metode Analisis

1. Analisis kualitatif
Proses terbawanya solut dari puncak kolom sampai akhir kolom disebut

elusi. Apabila detektor ditempatkan pada ujung akhir kolom, maka akan diperoleh sinyal yang
digambarkan sebagai fungsi waktu, yang disebut kromatogram. Kromatogram akan memperlihatkan
bahwa setiap senyawa meninggalkan kolom sebagai puncak simetri, sehingga sinyal detektor yang
tercatat berbentuk kurva Gauss pada waktu yang khas untuk setiap senyawa. Oleh karena itu,
kromatogram dapat menunjukkan waktu yang diperlukan untuk elusi. Waktu yang menunjukkan
puncak signal disebut waktu retensi (tR), yang tidak lain adalah waktu yang dibutuhkan analit mulai
saat

Page 24

diinjeksikan hingga terelusi dan keluar dari kolom pada konsentrasi maksimumnya. Tiap senyawa
memiliki waktu retensi yang spesifik pada kondisi tertentu, antara lain kondisi kolom, tekanan,
suhu, laju aliran fase gerak, dll, sehingga dapat digunakan sebagai salah satu dasar untuk analisis
kualitatif. Beberapa senyawa memiliki waktu retensi yang berdekatan, namun tiap senyawa hanya
memiliki satu waktu retensi saja. Dengan membandingkan waktu retensi analit dengan waktu
retensi senyawa baku maka analit dapat diidentifikasi

G.

2. Analisis kuantitaif
Beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisis kuantitatif:

  Analit harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen- komponen lain
dalam kromatogram.

  Baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus tersedia

  Prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan Metode Pengolahan Data Hasil
Analisis

a. Metoda Persentase Tinggi / Lebar Puncak

Metoda ini disebut juga Metoda Normalisasi Internal. Untuk

analisis kuantitatif diasumsikan bahwa lebar atau tinggi Puncak (Peak) sebanding (proportional)
dengan kadar / konsentrasi zat yang menghasil puncak. Dalam metoda yang paling sederhana
diukur lebar atau tinggi Puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini berarti bahwa setiap lebar atau
tinggi Puncak diekspresikan sebagai suatu persentase dari total).Hasil normalisasi dari lebar atau
tinggi puncak memberikan komposisi dari campuran yang dianalisis.

Ada dua masalah dengan pendekatan ini, yaitu:

Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang tiap-tiap komponen muncul
sebagai suatu puncak yang terpisah pada

Page 25

kromatogram. Komponen-komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di dalam kolom, atau ,terelusi
tanpa terdeteksi. Kita harus mengasumsi bahwa kita memperoleh respons detektor yang sama untuk
setiap komponen Untuk mengatasi kesulitan ini, maka kalibrasi detektor diperlukan.

a. Metoda Baku Luar (External Standard Method)

Pada metoda ini kita membuat suatu Baku/ Standard yang mengandung senyawa /senyawa-senyawa
yang akan ditetapkan kadarnya, idealnya jumlah baku sama dengan jumlah bahan yang akan
dianalisis, dan kita membandingkan kromatogram baku dengan kromatogram sampel. Dan
kromatogram baku dapat dihitung suatu respons faktor untuk setiap Puncak yang diinginkan,
respons faktor memberi intormasi tentang konsentrasi komponen yang dihasilkan oleh satuan
respons detektor (unit detector respons) :

KonsentrasiKomponen
Responsiraktor = --------------------------------

................................. (b) LebaratauTinggiPuncak

Kemudian untuk kromatogram sampel kita dapat menghitung konsentrasi dari setiap komponen
yang diinginkan dengan cara mengalikan (multiplikasi) tinggi atau lebar puncak dengan respons
faktor. Bila bekerja dengan metoda ini, respons detektor harus tinier untuk setiap senyawa pada
kisaran (range) konsentrasi yang digunakan, dan juga kita harus menginjeksikan (bila secara
manual) jumlah yang sama untuk setiap komponen pada kedua kromatografi, sehingga berhasilnya
operasi dari metoda ini tergantung pada kemampuan menginjeksi sampel dengan presisi yang
bagus.

b. Metoda Baku Dalam (Internal Standard Method)

Dalam metoda ini kita menambahkan ke dalam sampel sejumlah tertentu (jumlah yang diketahui)
Zat standar (Baku

Page 26

Dalam).Kromatogram yang diperoleh dibandingkan dengan kromatogram sampel atau campuran

senyawa dalam sampel. Metoda ini mempunyai keuntungan dibanding dengan metoda baku luar
karena, ia mengkompensasi variasi volume injeksi dan juga untuk perubahan yang kecil dari
sensitivitas detektor atau perubahan krornatograti yang bisa terjadi. Karena kita tidak perlu
menginjeksi dalam jumlah yang sarna setiap waktu, maka metoda ini biasanya mempunyai presisi
yang lebih baik dari pada menggunakan baku luar. Dari kromatogram standar dapat dihitung
respons faktor relatif sebagai berikut :

𝑟=𝐴 𝐶𝑠

𝐴𝑠

r = respons faktor relatif

C = Konsentrasi Kornponen Sampel
A = Lebar atau Tinggi Puncak Komponen Sampel Cs = Konsentrasi Baku Dalam
As = Lebar atau Tinggi Baku Dalam

Di dalam campuran sampel digunakan rumus berikut :

 𝐶𝑠
𝐶𝑢=𝐴𝑢 ×𝑟 × 𝐴𝑠

Cu = Konsentrasi komponen sampel Au = Lebar atau Tinggi Puncak

C’s = Konsentrasi Baku Dalam

A’s = Lebar atau Tinggi Puncak Baku Dalam

Page 27

Pendekatan lain adalah mengkoreksi setiap lebar puncak pada campuran yang diketahui
denganmengalikannya dengan respons faktor relatif. Hal ini menghasilkan lebar Puncak yang
diperoleh dengan respons detektor yang samauntuk setiap komponen.Komposisi dari campuran
kemudian diperoleh dengan normalisasi lebar Puncak yang telah dikoreksi.Untuk bekerja dengan
metoda ini sekali lagi kita harus yakin bahwa kita telah melihat semua komponen di dalam
campuran sebagai sebagai Puncak-puncak yang terpisah pada kromatogram.

H. Resume Jurnal

Pada jurnal yang saya dapatkan dilakukan analisis terhadap bon cabe.Kapsaisinoid adalah kelompok
senyawa amida dari vanililamin dengan asam lemak rantai bercabang yang merupakan penyebab
rasa pedas dari cabai. Pengujian kandungan kapsaisin pada sampel dilakukan dengan tiga tahap,
yaitu penentuan kurva baku standar, preparasi sampel cabai dan analisissampel dengan istrumen
KCKT. Penentuan kurva baku standar kapsaisin dilakukan dengan cara mengencerkan standar
kapsaisin dari konsentrasi 200 ppm menjadi 40 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 5 ppm, 2 ppm, dan 1 ppm
menggunakan pelarut metanol: air (7 : 3). Sampel pengujian dipersiapkan dengan cara
mencampurkan bubuk cabai dan kloroform sebanyak 8 ml yang disentrifugasi selama 5 menit pada
kecepatan 3000 rpm, kemudian supernatan yang dihasilkan dalam proses sentrifugasi dimasukkan
kedalam vial dan dikeringkan hingga seluruh kloroform menguap. Sampel yang diperoleh diuji
dengan menggunakan KCKT. Berdasarkan kromatogram hasil pengujian dengan menggunakan
KCKT, didapatkan nilai AUC sebesar 40195 pada 227 nm dan 112344 pada 281 nm. Kadar
kapsaisin pada sampel bubuk cabe “Bon Cabe” (No Batch 8995899250143) yang ditentukan
melalui nilai AUC adalah 2,06

Page 28

ppm pada panjang gelombang 227 nm dan 16,8 ppm pada panjang gelombang 281 nm.

Sampel yang telah larut dalam metanol dimasukkan ke dalam tabung eppendorf sebanyak 10 μL,
lalu ditambahkan 990 μL metanol : air (7 : 3). Tabung eppendorf disentrifugasi selama 5 menit dan
sampel yang telah disentrifugasi dimasukkan ke dalam kolom KCKT sebanyak 1 mL untuk
diinjeksikan ke dalam instrumen. Di dalam instrumen telah disiapkan fase gerak berupa metanol :
air (7 : 3). Kemudian sampel dianalisis dengan cara kolom KCKT dimasukkan ke dalam wadah
sampel pada instrumen KCKT, instrumen dinyalakan dan dipilih metode analisis dengan waktu
running sekitar 10-15 menit. Kromatogram yang didapat kemudian dianalisis sehingga dapat
diketahui kadar kapsaisin pada sampel.

Page 29
Dapat disimpulan bahwa dalam sampel bubuk cabe “Bon Cabe” (No Batch 8995899250143)
memiliki kadar kapsaisin sebesar 2,06 ppm pada panjang gelombang 227 nm dan 16,8 ppm pada
panjang gelombang 281 nm. Selain itu, dapat diketahui pula bahwa pemisahan senyawa kapsaisin
pada panjang gelombnag 281 nm lebih baik dibandingkan pemisahan senyawa pada panjang
gelombang 227 nm.
http://sastigprasastie.blogspot.co.id/2012/11/sejarah-perkembangan-
kromatografi.html

https://www.academia.edu/9430074/JURNAL_ANALISIS_INSTRUMEN_PENETAPAN_KADA
R_THIAMIN_PADA_TABLET_VITAMIN_B1_DENGAN_HPLC

http://duniachemistry.blogspot.com/2016/01/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-kckt_53.html