Kromatografi

Definisi
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik
pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas
ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Kromatografi
memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran berdasarkan perbedaan sifat fisik dan
kimia komponen dalam campuran.

Konsep Polaritas dalam Kromatografi

Di dalam kromatografi, berlaku suatu prinsip umum : LIKE DISSOLVE LIKE, artinya polar
menyukai yang polar dan tak polar menyukai yang tak polar. Dalam hal fasa diam, fasa diam
yang polar akan mengikat lebih kuat komponen yang relatif polar, sedangkan fasa diam yang tak
polar akan mengikat lebih kuat komponen-komponen yang juga tak polar. Hal yang sama
berlaku bagi fasa gerak; fasa gerak yang polar akan melarutkan lebih baik komponen yang juga
polar, sebaliknya fasa gerak yang tak polar akan melarutkan relatif lebih baik komponen yang
juga tak polar.

Hubungan polaritas antara fasa diam, fasa gerak dan molekul inilah yang memegang peranan
penting pada kromatografi.

Pengertian Polar dan Tak Polar

Molekul terbentuk dari beberapa atom. Atom terdiri atas suatu inti bermuatan positif yang sangat
kecil dan rapat, yang terletak jauh di dalam atom, dan dikelilingi oleh semacam awan elektron.
Elektron sendiri bermuatan negatif. Atom dapat bergabung dengan atom lain, membentuk suatu
molekul melalui suatu ikatan yang disebut ikatan kimia. Pada penggabungan atom, tidak terjadi
perubahan pada susunan inti atom. Perubahan terjadi hanya pada susunan awan elektron.
Sebaliknya molekul yang terbentuk dari jenis atom yang berbeda umumnya bersifat polar. Oleh
karena itu dengan mudah dapat dipahami bahwa hidrogen (H2) dan klorida (Cl2) bersifat tak
polar, sedangkan hidrogenklorida (HCl) bersifat polar.
Dengan demikian antara dua unsur sejenis hanya mungkin terbentuk ikatan kovalen, karena daya
tarik elektron dari kedua unsur pembentuk ikatan adalah sama sehinggga elektron ikatan tersebar
rata diantara kedua atom. Keadaan sebaliknya terjadi bila daya tarik antara kedua unsur tak
seimbang. Dalam hal ini elektron dapat berpindah dari unsur yang satu ke unsur yang lain,
sehingga ikatan yang terjadi adalah ikatan ion. Keadaan yang umumnya ditemukan terletak
diantara kedua kemungkinan yang ekstrim tersebut.

Pembentukan ikatan umumnya terjadi antara dua unsur yang tak sama tetapi perbedaan daya
tarik terhadap elektron dari kedua untur tersebut tidak terlalu besar. Dalam keadaan ini ikatan
yang terjadi masih ikatan kovalen tetapi titik berat muatan negatif agak bergeser kearah atom
yang mempunyai daya tarik terhadap elektron relatif besar. Dalam hal ini atom menjadi bersifat
relatif lebih negatif (titik berat muatan negatif bergeser kearah atom tersebut) dan sebagai
akibatnya, sepanjang ikatan terdapat dua kutub muatan yang berlawanan tanda dan terpisah satu
sama lain dengan jarak tertentu. Ikatan semacam ini disebut ikatan polar. Berbeda dengan ikatan
polar, pada ikatan kovalen murni, titik berat muatan positif dan negatif saling impit.

Dengan demikian suatu molekul dikatakan tak polar apabila titik berat muatan (+) dan (-) berada
bersama-sama pada pusat molekut tersebut. Sebaliknya suatu molekul dikatakan polar, jika
molekul tersebut merupakan dwi kutub (dipole), dimana titik berat muatan positif (+) dan negatif
(-) tidak saling berimpit. Molekul polar terbentuk apabila elektronegativitas dari atom-atom yang
menyusun molekul cukup berbeda satu sama lain.

Elektronegativitas
Seperti telah diketahui, kepolaran suatu ikatan antara dua atom ditentukan oleh perbedaan daya
tarik elektron dari kedua atom tersebut. Bila daya tariknya sama, maka akan terbentuk ikatan
kovalen, sedangkan bila berbeda, akan terbuntuk ikatan polar dimana kepolarannya akan
sebanding dengan perbedaan tersebut. Untuk dapat menyatakan apakah suatu ikatan bersifat
kovalen atau polar diperlukan pengetahuan tentang daya tarik elektron dari suatu atom. Suatu
besaran yang dapat digunakan untuk mengukur daya tarik elektron adalah afinitas elektron.
Kesulitan dari penggunaan afinitas elektron adalah bahwa besaran ini menggambarkan daya tarik
elektron dari atom yang bebas, sedangkan yang diperlukan adalah daya tariknya dalam suatu
ikatan. Karena itu dikembangkan konsep elektronegativitas dari suatu unsur, yang secara
langsung menggambarkan daya tarik elektron dalam ikatan. Elektronegativitas menunjukkan
besarnya kecenderungan (tendensi) suatu ataom untuk menarik elektron (yang digunakan
bersama), dari atom tetangganya. Terdapat berbagai cara untuk mengembangkan konsep
elektronegativitas, salah satu diantaranya adalah skala elektronegativitas yang dikembangkan
oleh Pauling.

Mengenal Polaritas Fasa Diam dalam Kromatografi

Fasa diam pada kromatografi (gas) ada yang bersifat polar, semipolar dan tak polar yang dapat
dikenali berdasarkan prinsip dasar diatas. Berdasarkan gugus fungsionil yang dimiliki oleh setiap
jenis fasa diam tersebut, dapat disusun urutan polaritas dari beberapa jenis fasa diam yang umum
digunakan pada kromatografi (gas). Disamping keenam jenis fasa diam tersebut, masih terdapat
banyak lagi jenis fasa diam lainnya.

Fasa diam (adsorben) yang paling banyak digunakan pada TLC dan HPLC adalah silika dan
alumina. Adsorben silika dan alumina dapat mengadsorpsi senyawa yang bersifat polar. Silika
gel bersifat asam dan berfungsi untuk memisahkan senyawa yang bersifat asam. Silika gel
banyak digunakan untuk kromatografi lapis tipis (KLT). Sedangkan alumina bersifat basa dan
berfungsi untuk memisahkan senyawa yang bersifat basa. Alumina banyak digunakan dalam
kromatografi kolom.
Berbagai pemisahan pada selulosa dan poliamida juga telah banyak dipublikasikan, hanya saja
pemakaiannya tidak seluas silika dan alumina. Karena tidak semua pemisahan dapat dilakukan
pada silika maka dikembangkan fasa terikat (bonded phase) seperti RP – 2, RP – 8, RP – 18,
diol, amina dan siano. Susunan fasa diam yang umum digunakan pada TLC dan HPLC, dimulai
dari yang paling polar (C18) diberikan di bawah ini : 
Bagaimana halnya dengan urutan polaritas fasa gerak?. Fasa gerak yang umum digunakan pada
TLC dan HPLC terdiri dari campuran berbagai pelarut organik. Polaritas pelarut dapat disusun
menurut ukuran kekuatan teradopsinya pelarut tersebut pada adsorben (yang banyak digunakan
alumina) dan susunan yang terbentuk dikenal sebagai deret eluotropik pelarut.
Suatu pelarut bersifat relatif polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannya
dengan alumina. Dalam deret eluotropik menurut Trappe, Wren dan Strain, pelarut-pelarut
disusun menurut besarnya kekuatan pelarut (solvent strength) eo, berangkat dari yang tak polar
menuju ke yang sifatnya polar (makin ke bawah makin polar).

Jenis-jenis Kromatografi
Kromatografi lapis tipis (KLT)
merupakan kromatografi adsorpsi dan adsorben bertindak sebagai fasa diam atau fasa stasioner.
KLT dipergunakan untuk memisahkan ion-ion organik, kompleks senyawa organik dengan
anorganik, dan senyawa organik alami dan sintetis. Jenis adsorben yang banyak dipergunakan
dalam KLT adalah silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), Kieselguhr dan
selulosa.

Kromatografi padatan cair (LSC)

Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar seperti silika gel
atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT
kolom dipadati atau dipak dengan partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular
(berkulit tipis 37 -44 μ).Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-
partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ . Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat
yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat
untuk pemisahan isomer-isomer.

Kromatografi partisi
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur
salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada
keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti
pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu
pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui
kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC)
Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah
dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert.
Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase
Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT.
Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal (normal phase)" bila fase diam lebih
polar dari fase gerak dan "fase terbalik (reversed phase)" bila fase gerak lebih polar daripada fase
diam.

Kromatografi penukar ion (IEC)

Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan tempat-tempat
berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren
dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan
jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan.
Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam
amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion.

Kromatografi eksklusi
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat.
Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert.
Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang
menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk
kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.
Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC)
dan filtrasi gel. Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex,
suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan semi
keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT. Dextran gel lunak tidak dapat
menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-
polimer dan bahan-bahan biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.

Kromatografi pasangan ion (IPC)

Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk baru, pemakaian
pertama sekali pada pertengahan tahun 1970. Diterimanya IPC sebagai metode baru KCKT
merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik.
Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan
penukar ion dan paired ion chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar
yang sama.
Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari sukanya menangani
sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC lainnya (seperti senyawa yang sangat polar,
senyawa yang terionisasi secara kompleks dan senyawa basa kuat).
IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase balik. Fase diam dari rase
balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak silika yang disilanisasi (misalnya C8 atau C18
Bonded Phase) atau dari suatu pengepak yang diperoleh secara mekanik, fase organik yang tidak
dapat bercampur dengan air seperti 1 pentanol. Fase diam yang dipakai adalah Cs atau CIS BPC
Packing. Fase gerak terdiri dari suatu larutan bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti
metanol atau asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding,yang
muatannya berlawanan dengan molekul sampel.