Ada beberapa tahapan utama dalam rekayasa genetika, yaitu:

1. Kloning gen
Menurut Winaningsih et al (2014), Kloning gen terdiri atas beberapa tahapan,
yaitu:
a. Memotong DNA  menjadi fragmen-fragmen dengan ukuran beberapa ratus hingga
ribuan kb (kilobase)
b. Selanjutnya dimasukkan ke dalam vektor bakteri untuk cloning (setiap vector hanya
mengandung 1 fragmen DNA)
c. Kemudian dimasukkan ke dalam bakteri yang kemudian teramplifikasi dan
membentuk suatu klon
d. Sejumlah besar setiap fragmen DNA kemudian diisolasi dari setiap klon. Ekspresi
kloning gen telah disimpan dengan perbanyakan kloning yang dilakukan pada bakteri
yang mengandung fragmen DNA tersebut.
(Anwar 2010).
2. Sequensing DNA
Sekuensing DNA terdiri atas penentuan urutan basa suatu fragmen DNA. Selama
bertahun-tahun  sekuensing dilakukan dengan teknik yang butuh waktu dan proses lama.
Sekarang proses ini bersifat automatis dan dilakukan dalam skala industri dan
memungkinkan mensekuensing beberapa ribu kilobasa per hari (Winaningsih et al,
2014).
3. Amplifikasi gen secara in-vitro atau PCR
Menurut Budiani et al (2016), PCR adalah teknik atau metode penggandaan
(replikasi) DNA secara in-vitro. Melalui teknik ini, dapat membantu pekerjaan peneliti
atau bidang lainnya terkait dengan penggunaan DNA sebagai objek kajian. Misalnya
untuk penentuan strain atau spesies organisme tertentu, deteksi penyakit, deteksi atau
kajian gen, terapi gen, serta di bidang forensik.
Reagen yang digunakan :
a. DNA target hasil ekstraksi. Berdasarkan pengalaman penulis, DNA tersebut
dapat diencerkan 5-10X, sesuai kebutuhan.
b. Sepasang primer yang komplementer dengan DNA target. Primer merupakan
fragmen DNA berukuran pendek dengan panjang 10-25 basa yang akan
 dijadikan sebagai mengawali proses replikasi DNA sekaligus membatasi
daerah DNA yang akan diamplifikasi,
c. DNA polymerase. Enzim ini berperan dalam mengamplifikasi DNA sesuai
dengan urutannya.
d. dNTP, terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa DNA, yaitu dATP,dGTP,
dTTP, dan dCTP. Berfungsi sebagai building block DNA yang baru dibentuk.
e. Buffer PC R (KCl, Tris-HCL, MgCl2). Buffer ini berfungsi untuk menjaga
kestabilan reaksi agar berjalan secara optimum.
f. ddH2O atau  nuclease free water (merk dagang).Berfungsi sebagai pelarut.

Pada saat  ini  sudah tersedia berbagai macam kit-PCR yang sudah mengandung
reagen-reagen tersebut, kecuali primer dan DNA target tentunya, sehingga kita tidak
perlu mencampurkanya satu persatu.

Prinsip Kerja :

a. Tahap denaturasi (melting), pada suhu 94-96°C.

Pada tahap ini, ikatan hidrogen terputus dan DNA untai ganda masing-
masing terpisah menjadi untai tunggal. Pada proses replikasi DNA secara in-
vivo, proses ini dibantu oleh sejumlah enzim seperti enzim helikase dan
girase. Pemisahan ini memungkinkan penempelan primer yang komplemen
dengan DNA target pada sekuen yang sesuai.
b. Tahap penempelan (annealing), pada suhu 45-60°C
Setelah DNA terdenaturasi, kemudian suhu diturunkan sehingga primer
dapat menempel pada bagian DNA yang komplementer dengan urutan
basanya. Suhu annealing yang tidak cocok menyebabkan kegagalan dalam
replikasi DNA yang benar.
c. Tahap pemanjangan (elongasi), pada suhu 72°C (opsional).
Enzim DNA polymerase melakukan sintesis DNA dengan menambahkan
pasangan basa yang tepat, satu demi satu secara cepat,  pada sisi 3’ primer
yang telah menempel pada DNA cetakan. Suhu untuk tahap ini tergantung
pada jenis enzim polimerase yang digunakan, biasanya 72°C.

Deteksi Produk Hasil PCR :

 Salah satu teknik yang banyak digunakan untuk visualisasi DNA adalah dengan
elektroforesin dengan menggunakan gel atau poliakrilamid, sehingga menunjukkan
apakah produk PCR yang dihasilkan adalah benar dan sesuai dengan yang diinginkan.

4. Konstruksi Gen
Menurut Budiani et al (2016), Konstruksi gen dapat membantu identifikasi daerah
regulator yang mengontrol ekspresi gen. Daerah koding atau coding region mungkin
mengandung struktur aslinya. Konstruk gen bisa digunakan untuk mengkaji pengaruh gen
pada sel atau organisme secara menyeluruh. Daerah transkrip mungkin mengandung
suatu gen reporter yang menyandi protein yang bisa dengan mudah divisualisasi atau
dikuantifikasi berdasarkan aktifitas spesifik enzimnya.
5. Transfer gen ke dalam sel
Menurut Kusrini (2012), untuk dikodekan secara efektif dan ditranslasikan
menjadi protein, suatu gen harus ditransfer ke dalam sel, yang secara alami mungkin
mengandung semua faktor-faktor yang diper.lkan dalam proses transkripsi dan translasi.
Ada berbagai teknik yang bisa digunakan untuk proses transfer gen, yaitu fusi sel,
penggunaan senyawa kimia, elektroporasi, injeksi menggunakan vektor virus,
mikroinjeksi.

Anwar, A. (2010). Penerapan Bioteknologi Rekayasa Genetika Dibidang Medis Ditinjau Dari
Perspektif Filsafat Pancasila, Ham Dan Hukum Kesehatan Di Indonesia. Jurnal
Sasi Vol, 17(4).

Budiani, A., Putranto, R. A., Minarsih, H., Fitranti, N., & Santoso, D. (2016). Kloning gen
penyandi β-1, 6-glukanase kapang secara cepat dengan teknik RT-PCR
menggunakan primer spesifik Rapid cloning for gene encoding fungal β-1, 6-
glucanase by means of RT-PCR using specific primers. E-Journal Menara
Perkebunan, 77(1).

Kusrini, E. (2012). Perkembangan Rekayasa Genetika Dalam Budidaya Ikan Hias Di

Indonesia. Media Akuakultur, 7(2), 59-64.
Winangsih, F., Bintang, M., & Priyatno, T. P. (2014). Kloning Gen β-1, 4 Glukanase dari
Burkholderia cepaciake dalam Escherichia coli dan Karakterisasi
Sekuennya. Current Biochemistry, 1(3), 116-125.