ACARA 2.

KARAKTERISASI BAKTERI ENTERON

Tujuan
Mahasiswa mengetahui langkah-langkah atau tahapan dalam karakterisasi bakteri, yaitu
secara morfologi, biokimia dan enzimatis.
Landasan Teori
Karakterisasi bakteri atau mikroorganisme pada umumnya merupakan langkah awal ketika
akan mempelajari bakteri atau mikroorganisme. Dengan melakukan karakterisasi maka akan
diketahui identitas bakteri atau mikroorganisme tersebut. Setelah mengenali identitas bakteri atau
mikroorganisme, maka akan mempermudah dalam mempelajari pada tahapan selanjutnya. 
Karakterisasi merupakan tahapan pengenalan ciri atau karakter suatu mikroorganisme dan
dibandingkan dengan isolat lain yang telah diketahui sebelumnya. Tahapan ini meliputi langkah
karakterisasi secara morfologi, fisiologi, biokimia/enzimatis.
Kelompok bakteri enteron (Enterobacteriaceae) adalah kelompok bakteri batang Gram
negatif yang bersifat fakultatif anaerob dengan berbagai sifat spesifik pada masing-masing
spesiesnya. Kelompok bakteri ini antara lain terdiri atas genus bakteri Escherichia ,Salmonella,
Shigella, Klebsiella, Serratia, dan Enterobacter.Untuk mengenali masing-masing genus maka
diperlukan serangkaian pengujian fisiologi, biokimia/enzimatis disamping pengujian morfologi.
Karakteristik bakteri enteron secara morfologi dapat diamati secara makroskopis dan
mikroskopis. Pengamatan secara makroskopis dapat dilakukan dengan mengamati karakteristik
koloni bakteri, meliputi bentuk koloni, elevasi, tepi, warna, konsistensi, tranparansi, dan
perkembangan koloni pada medium padat. Sedangkan pada pengamatan mikroskopis akan
diamati karakter sel yang meliputi bentuk sel dan rangkaian penataan sel, sifat dinding sel,
endospora, ukuran sel, dan motilitas. Pengamatan mikroskopis akan menggunakan mikroskop
dengan perbesaran sedang hingga kuat menggunakan minyak imersi. 
Sifat fisiologis bakteri enteron dapat diamati dengan menumbuhkannya pada pemberian
perlakuan pH dan suhu. Sedangkan karakteristik biokimia/enzimatis mengamati kemampuan
menggunakan substratnya pada berbagai media uji enzimatis.
Pengujian sifat-sifat fisiologis, biokimia/enzimatis dapat dilakukan secara konvensional
dengan preparasi media uji, dapat pula dilakukan dengan system uji yang lebih cepat, yaitu
dengan menggunakan sistem kit uji API 20E. Sistem kit uji ini melibatkan serangkaian media uji
pada suatu kit dengan volume rendah yang terdiri atas 20 jenis uji untuk bakteri
Enterobacteriaceae. Dengan inokulasi media uji dan inkubasi selama 24-48 jam, maka kemudian
akan diketahui karakter fisiologis, biokimia/enzimatis isolat setelah dicocokkan dengan pedoman
yang telah disediakan.
Pengujian fisiologis/biokimia/enzimatis bakteri enteron dapat juga dilakukan dengan uji
penggunaan gula pada medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA). Medium ini dapat membedakan
antar Enterobacteriaceae yang kesemuanya adalah bakteri Gram negatif yang mampu
memfermentasi glukosa, serta membedakannya dengan bakteri Enteron lainnya. Perbedaan
didasarkan pada kemampuan dalam memfermentasi gula dan adanya H S yang dihasilkan. 
2
 Medium TSIA mengandung tiga macam gula, yaitu glukosa, sukrosa, dan laktosa. Sukrosa
dan laktosa terdapat dalam konsentrasi 1% dan glukosa 0,1%. Kemampuan menggunakan gula
selain glukosa akan ditunjukkan oleh adanya perubahan warna. Indikator warna phenol red dapat
menunjukkan adanya fermentasi gula dengan perubahan warna dari merah menjadi kuning. Bila
H S dihasilkan, akan ditunjukkan oleh adanya endapan hitam. 
2

Materi dan Cara kerja 

A. Materi
Alat :
Mikroskop, inkubator, tabung reaksi, cawan petri, beaker glass 500 mL, beaker glass 100
ml, Erlenmeyer 250 mL, pipet ukur 1 mL, object glass, cover glass, jarum ose, lampu spiritus.
Bahan :
1. Kultur bakteri enteron
2. Medium Tripton Broth dan reagen Kovac
3. Medium MR-VP Broth dan reagen methyl red, α-naphtol, KOH 40%
4. Medium Simmon Citrate Agar
5. Medium Urea Broth dan phenol red
6. Medium Skim Milk Agar
7. Medium gula-gula dengan phenol red
8. Medium Nutrient Agar
9. Reagen NNNN-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (0,2%)
10. Larutan H O (1,5%):
2 2

11. Reagen pewarnaan Gram

12. Larutan FeCl (10%)
13. Minyak mineral dan akuades steril
B. Cara kerja 
B.1. Determinasi Enterobacteriaceae secara konvensional
Tahapan metode yang dilakukan sebagai berikut: 
1. Disediakan kultur bakteri enteron dalam tabung reaksi yang berumur 24 jam.  
2. Dilakukan pengamatan morfologi koloni : bentuk, ukuran, permukaan, tepi, elevasi,
warna, transparasi, konsistensi.
3. Bentuk koloni : bulat / circular, tidak teratur
4. Ukuran koloni : kecil (φ 1 mm), sedang (φ 2-3 mm), besar (φ > 3 mm)
5. Permukaan koloni : halus, mengkilap atau kusam
6. Tepi koloni diamati menggunakan mikroskop perbesaran rendah sehingga diketahui tepi
koloni : rata, bergelombang, undulates, lobatus, bergerigi, filament dan tidak beraturan
7. Elevasi koloni diamti dari pandangan samping : rata, cembung, umbonatus
8. Warna koloni : putih, krem atau warna lainnya
9. Transparansi koloni diamati dengan cara menerawang biakan cawan terhadap sumber
cahaya sehingga bersifat opaque, translucens, dan transparan.
 10. Konsistensi diamati dengan cara menempelkan jarum ose ke permukaan koloni,
kemudian ditarik ke atas, maka disebut berlendir atau butyrous.
11. Dilakukan pengamatan morfologi sel : sifat dinding sel (sifat Gram) dan bentuk sel
12. Pengamatan sifat dinding sel dilakukan dengan pewarnaan Gram : dibuat ulasan bakteri
pada object glass, difiksasi, ditetesi Gram A (crystal violet), dibiarkan selama 60”,
ditetesi Gram B (iodine) dan dibiarkan selama 60”, kemudian ditetesi peluntur Gram C
(alkohol) sampai tidak ada warna ungu menetes lagi, dicuci dengan air mengalir dan
dikeringanginkan. Kemudian ditetesi Gram D (safranin), dibiarkan selama 45”, kemudian
dibilas dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Preparat diamati di bawah mikroskop
dengan perbesaran kuat menggunakan minyak imersi. Sel bersifat Gram positif bila sel
tampak berwarna ungu atau biru dan bersifat Gram negatif bila sel tampak berwarna
merah atau pink.
13. Bentuk sel diamati bersamaan pengamatan hasil pewarnaan Gram, sehingga sel tampak
berbentuk bulat (coccus), batang (bacil), lengkung (spiril)
14. Dilakukan pengamatan sifat biokimia/enzimatis: katalase, oksidase, urease, indole, MR-
VP, citrate, pembentukan H S, hidrolisis protein, dan fermentasi gula-gula.
2

Pengujian dilakukan sesuai table berikut :

Pengujian Medium Reagen Hasil uji

Indol Tryptone Reagen Kovac + warna merah, - warna
Broth kuning
MR-VP MR-VP Broth MR : Methyl red VP : reagen MR-VP: + merah, - no
α-naphtholdan KOH 40% change
Citrat Simmon’s - + medium biru, - medium
citrate agar hijau
HS
2 SIM agar - Warna hitam
tube/TSIA
Urease Urea broth Phenol red + deep pink, - no deep pink
Katalase - HO 2 2 Gelembung gas atau busa
Oksidase - Tetramethyl-p- Warna biru tua/ ungu
phenylenediamine
dihydrochloride
Hidrolisis Skim Milk - Zona jernih di sekitar koloni
kasein Agar
Fermentasi NB + gula Phenol red Perubahan warna medium
gula-gula menjadi kuning dan
terbentuk gas

B.3. Determinasi bakteri Enterobacteriaceae dengan uji TSIA

1.Disiapkan isolat bakteri enteron.
 2.  Isolat bakteri diinokulasikan secara aseptis ke medium TSIA dengan cara tusukan pada
bagian tegak (stab) dan dengan cara gores pada bagian miring (slant)
3.  Biakan diinkubasi pada suhu ± 37 C selama 24 jam
o

4. Hasil diamati berupa terbentuknya perubahan warna pada bagian tegak dan miring serta
terbentuknya gas dan warna hitam karena adanya H S. Perubahan warna medium menjadi
2

kuning maka terjadi reaksi asam (A), perubahan warna menjadi merah maka terjadi reaksi
katalis (K), dan terbentuknya H S  ditandai oleh warna hitam di sekitar pertumbuhan bakteri.
2

Interpretasi hasil uji TSIA yaitu sebagai berikut: 

pppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppp
Bagian tegak merah, bagian miring merah (K/K) menunjukkan glukosa, sukrosa, dan
laktosa tidak difermentasi oleh bakteri.
qqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqqq
Bagian tegak kuning, bagian miring merah (A/K) dan timbul warna hitam, menunjukkan
hanya glukosa yang difermentasi oleh bakteri sedangkan laktosa dan sukrosa tidak difermentasi.
Timbulnya warna hitam dengan  bau khas menunjukkan bakteri menghasilkan H S. 2

rrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr
Bagian tegak kuning, bagian miring kuning (A/A), dan medium agar pecah, menunjukkan
glukosa, sukrosa, dan laktosa difermentasi oleh bakteri. Medium yang pecah menunjukkan
bakteri tersebut menghasilkan gas.
d. Bagian tegak kuning, bagian miring kuning (A/A), dan timbul warna hitam, menunjukkan
glukosa, sukrosa, dan laktosa difermentasi oleh bakteri bakteri tersebut menghasilkan
H S.
2

5. Hasil pengamatan yang diperoleh disimpulkan dengan mencocokkannya ke pedoman

berikut:
- Escherichia : bagian miring kuning/bagian tegak kuning/tidak ada H S 2

- Salmonella : bagian miring merah/bagian tegak kuning/H S dihasilkan

2

- Shigella : bagian miring merah/bagian tegak kuning/tidak ada H S 2

- Alcaligenes : bagian miring merah/bagian tegak merah atau tidak ada 

perubahan