ACARA 1.

PENAPISAN BAKTERI RIZOSFIR YANG BERPERAN

DALAM MENINGKATKAN PERTUMBUHAN TANAMAN

Tujuan
Mahasiswa mengetahui cara penapisan isolat bakteri rizosfir yang mampu
menambat nitrogen bebas dari udara, melarutkan pospat organik, memproduksi
HCN dan hormon IAA yang berperan dalam meningkatkan pertumbuhan
tanaman.

Landasan Teori
Rizosfir adalah bagian tanah sekitar perakaran yang masih mendapatkan
pengaruh langsung dari akar karena adanya eksudat akar, sehingga pertumbuhan
bakteri sangat tinggi di daerah tersebut. Rizoplane merupakan daerah sekitar
perakaran yang tidak mendapatkan pengaruh langsung dari akar tanaman,
populasi bakteri tidak terlalu tinggi karena nutrisinya tidak sebanyak daerah
rizosfir.
Rizosfir merupakan daerah yang ideal bagi tumbuh dan berkembangnya
mikroorganisme tanah yang dikenal juga dengan istilah rizobakteri.Beberapa
bakteri rizosfir diketahui berperan dalam menghasilkan senyawa pemacu
pertumbuhan tanaman (Plant Growth Promoting Substance / PGPS), sehingga
disebut sebagai bakteri rizosfir penghasil senyawa pemacu pertumbuhan tanaman
(Plant Growth Promoting Rhizobacteria / PGPR).PGPR memiliki peranan
penting bagi tumbuhan, misalnya sebagai pengendali biologi melalui kompetisi,
produksi antibiotik, induksi resistensi tanaman, produksi fitohormon, dan
peningkatan ketersediaan hara melalui fiksasi nitrogen dan melarutkan fosfat.

Bakteri Penambat Nitrogen

Unsur N adalah komponen utama protoplasma, terdapat dalam jumlah besar
dalam bentuk teroksidasi. Bahan yang mengandung N dapat mengalami
amonifikasi, nitrifikasi, dan denitrifikasi, tergantung bentuk senyawa N dan
lingkungannya. Tanaman tidak memiliki enzim nitrogenase sehingga tidak
mampu memanfaatkan N2 bebas di udara secara langsung.Kandungan N2 di udara
sangat besar sehingga peranan Bakteri Penambat Nitrogen (BPN) penting bagi
tanaman. Peranan utamanya adalah menambat N2 bebas pada atmosfer untuk
diubah menjadi ammonia melalui proses metabolismenya dengan bantuan enzim
nitrogenase. Selain itu, BPN berperan penting terhadap keseimbangan unsur N
dalam tanah. Aktivitas penambatan ini penting dan vital bagi ketersediaan N di
tanah karena akan memudahkan untuk diserap oleh tanaman. Bakteri ini ada yang
bersifat simbiotik maupun non-simbiotik.
BPN yang bersimbiosis dengan suatu tanaman umumnya membentuk
semacam bagian yang membengkak seperti bintil pada bagian akar yang
terinfeksi.Beberapa contoh spesies BPN Simbiotik (BPNS) adalah Rhizobium
leguminosarum, Bradyrhizobium japonicum, Allorhizobium undicola,
Azorhizobium caulinodans dan Sinorhizobium meliloti.BPN yang tidak
bersimbiosis langsung dengan tanaman (non-simbiotik) umumnya banyak
terdapat pada daerah rizosfer atau tanah daerah sekitar perakaran yang masih
mendapat pengaruh langsung dari akar suatu tanaman. Beberapa contoh spesies
bakteri BPN Non-Simbiotik adalah Azospirillum brasilense, Azospirillum
halopraeferens, Azospirillum lipoferum, Azospirillum amazonese, Azotobacter
chroococcum, Azotobacter armeniacus, Azotobacter paspali, Azotobacter
vinelandii, Beijerinckia sp., dan Clostridium sp.

Bakteri Pelarut Fosfat

Unsur fosfor (P) adalah makronutrien yangberperan penting dalam
pertumbuhan tanaman, yaitu dalam perkembangan akar, kekuatan batang dan
tangkai, pembentukan bunga dan biji, ketahanan terhadap penyakit,
dll.Ketersediaan P dalam tanah terdapat dalam bentuk ortopospat atau terikat
dengan oksida Al dan Fe. Bakteri pelarut pospat berperan menyediakan P bagi
tanaman dengan menariknya dari sumber P organik dan anorganik melalui proses
solubisasi dan mineralisasi.
Aktivitas pelarutan P oleh bakteri ditentukan oleh kemampuan bakteri
menghasilkan metabolit seperti asam-asam organik, terutama asam-asam glukonat
dan ketoglukonat. Gugus karboksil dan hidroksil asam organik mengkhelat kation
(Al atau Fe) yang terikat pada fosfat, kemudian merubahnya menjadi bentuk
terlarut. Mekanisme ini menyebabkan pH tanah rizosfir menjadi turun (asam)
karena adanya produksi proton/pelepasan bikarbonat (keseimbangan anion/kation)
dan perubahan gas (O2/CO2). Pelepasan proton menyebabkan meningkatnya sisi
permukaan bermuatan negatif tempat terikatnya ion fosfat. Selain itu, gugus
karboksil akan melarutkan ikatan Al-P atau Fe-P melalui disolusi langsung
mineral fosfat, atau dengan mengkhelat Al atau Fe yang terikat pada fosfat. Pada
kolonisasi oleh pseudomonad, digunakan siderofor dalam mengkhelat
Fe3+.Sebagai hasil dari aktivitas asam organik dan khelasi ini, dilepasnya fosfat
yang dapat digunakan oleh tanaman.
Mekanisme mineralisasi P organik (4-90% dari total P tanah) dalam tanah
melibatkan enzim fosfatase asam dan basa yang dihasilkan oleh bakteri pelarut
fosfat. Fosfatase akan menggunakan P organik sebagai substrat, terjadi hidrolisis,
sehingga dihasilkan fosfat anorganik yang dapat digunakan oleh tanaman.
Mikroorganisme yang termasuk dalam kelompok bakteri pelarut fosfat
antara lain kelompok Pseudomonas, Bacillus, dan Enterobacter yang mampu
bekerja sama dengan bakteri pengikat N udara Azotobacter, Azospirillum dan
Rhizobium.

Bakteri peningkat pertumbuhan tanaman lainnya

Bakteri yang berperan dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman yang
lainnya adalah bakteri pembentuk siderofor, enzim khitinase, antagonis
fungitanaman, asam sianida (HCN) dan hormon IAA.Bakteri dengan sifat-sifat
tersebut berperan dalam pengendalian hayati (sebagai agensia biokontrol) yang
bermanfaat dalam mengendalikan mikroba patogen dan pada akhirnya
meningkatkan pertumbuhan tanaman.
Siderofor adalah senyawa yang dihasilkan oleh bakteri aerob dan fakultatif
anaerob, mampu mengkelat dan mengangkut ion feri, dihasilkan pada kondisi Fe
terbatas.Peran siderofor dalam pengendalian hayati sehingga meningkatkan
pertumbuhan tanaman adalah menghilangkan ketersediaan ion feri bagi patogen
tanaman.Contoh bakteri yang menghasilkan siderofor yaitu Pseudomonas
fluorescens dalam bentuk pyoverdin dan pseudobaktin. Fungsi lain siderofor yaitu
sebagai faktor tumbuh. Deteksi adanya siderofor dilakukan dengan penambahan
klorida feri, perklorat feri, reagen folin, dan reagen nitrimolibdat yang akan
menunjukkan pendar warna.
Enzim khitinase adalah enzim yang mampu mendegradasi khitin yang
umumnya terdapat pada dinding sel fungi dan nematode. Bakteri yang memiliki
kemampuan degradasi ini membuatnya berperan sebagai agensia biokontrol
pengendali fungi dan nematode patogen tanaman.
Bakteri antagonis fungi tanaman pada dasarnya karena memiliki
kemampuan-kemampuan tersebut di atas, yaitu mampu menghasilkan senyawa
antibiotik atau enzim khitinase, sehingga mampu menghambat pertumbuhan fungi
patogen.
HCN merupakan suatu inhibitor potensial terhadap sitokrom c oksidase
dan beberapa metaloenzim yang lainnya, sehingga patogen dapat mengalami
kematian akibat efek merusak dari HCN.Uji HCN dilakukan untuk mengetahui
adanya asam sianida yang dihasilkan mikroorganisme untuk menghambat
pertumbuhan patogen.Interpretasi positif pada uji HCN yaitu adanya perubahan
warna pada kertas Whatmann dari kuning hingga coklat gelap.
Bakteri penghasil IAA mampu menghasilkan fitohormon yang dapat
mempercepat pertumbuhan tanaman. Hormon IAA adalah auksin endogen yang
berperan dalam pembesaran sel, menghambat pertumbuhan tunas samping,
merangsang terjadinya absisi, berperan dalam pembentukkan jaringan xilem dan
floem, dan juga berpengaruh terhadap perkembangan dan pemanjangan akar.
Hormon IAA disintesis sebagai metabolit sekunder yang dihasilkan dalam kondisi
pertumbuhan bakteri suboptimal atau saat tersedia prekursor asam amino
triptofan. Biosintesis IAA oleh bakteri dapat ditingkatkan dengan penambahan L-
triptofan sebagai prekusor ke dalam media tumbuh bakteri. Konsentrasi IAA yang
dihasilkan oleh bakteri dapat berbeda-beda tergantung pada jenis dan asal bakteri.

Materi dan Cara kerja

A. Materi
Alat : Cawan petri, tabung reaksi, object glass, jarum ose, lampu spiritus.

Bahan :
Medium semi solid Nitrogen free Bromothymol blue (NfB), medium
Pikovskaya, medium NA+glisin, medium NA, medium PDA, medium TSA, isolat
bakteri Streptomyces sp., isolat bakteri A, B,C isolat fungi Fusarium, isolat fungi
Sclerotium, Reagen Salkowsky, alkohol 70%, spiritus.

B. Cara kerja
B.1. Bakteri penambat N udara dan pelarut fosfat
1. Isolat A, B, dan C. diinokulasikan dengan cara ditusukkan ke medium
semi solid Nitrogen free Bromothymol blue dan secara gores pada medium
cawan Pikovskaya.
 2. Biakan diinkubasi pada suhu ruang selama 24-48 jam. Diamati adanya
cincin keruh pada bagian subsurface medium NfB sebagai terduga bakteri
penambat N dan adanya zona jernih di sekeliling koloni pada medium
Pikovskaya sebagai terduga bakteri pelarut fosfat.
B.2. Uji antagonisme terhadap fungi dan bakteri patogen
1. Disiapkan isolat fungi Fusarium sp., dan Sclerotium sp
2. Medium PDA disiapkan, kemudian isolat A, B, dan C. diinokulasikan
secara streak kontinyu diketiga medium tersebut
3. Setelah itu, diinokulasikan jamur Fusarium di salah satu sisi dan jamur
Sclerotium di sisi lainnya pada medium PDA.
4. Diinkubasi selama 3x24 jam untuk jamur.
5. Kemudian, diamati terbentuknya zona hambat jamur.
B.3. Uji produksi asam sianida (HCN)
1. Isolat bakteri A, B, dan C di streak pada medium NA+ glisin
2. Kertas Whatmann dicelupkan ke dalam larutan picric acid 0,5% dan
sodium carbonate 2% kemudian diletakkan diatas biakan bakteri
3. Dilakukan inkubasi selama 3x24 jam
4. Diamati perubahan warna pada kertas Whatmann. Interpretasi positif jika
ada perubahan warna dari kuning kecoklatan hingga coklat gelap.
B.4. Uji kemampuan bakteri menghasilkan IAA secara kualitatif
1. Isolat bakteri A, B, dan C diinokulasi pada medium TSA yang ditambah
Tryptophan 100 ppm.
2. Biakan diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu ruang
3. Biakan kemudian ditetesi reagen Salkowsky dan didiamkanselama 30
menit di ruang gelap.
4. Uji kualitatif positif apabila medium di sekitar koloni berubah warna
menjadi pink kemerahan