Genomic adalah ilmu yang mempelajari tentang genom

Genom adalah dna yang terdapat di sel.

Kenapa genomic jadi penting? Karna ada project yaitu human genome project, dimana semua
ilmuan, berusaha untuk mengidentifikasi semua gen yang dimiliki manusia, yang dilihat dari gen tsb
yaitu fungsinya, lokasi, kromosom terletak dimana. Project ini banyak negara. Jadi ada keilmuan
baru yang berasal dari genomic.

Kemunculan ilmu genomic, menyebabkan adanya keilmuan lainnya

1. Proteomics: bealajar semua protein pada sel

2. Metabolomics: mempelajari protein dan jalur enzimatis yang terlibat dalam metabolisme sel
3. Metabonomics: mengukur produk metabolic yang diproduksi oleh sel di dalam respons
untuk stimuli (contohnya treatment obat) dan manipulasi genetic
4. Glycomics: mempelajari karbohidat sel
5. Transcriptomics : mempelajari semua gen yang terekspresi (transkripsi) dalam sel
6. Metagenomics: analisis dari genom (organisme) yang terkumpul dari lingkungan
7. Nutrigenomics : focus kepada pemahaman interaksi antara diet dan gen
8. Pharmacogenomics: mengkostumisasi obat berdasarkan genetic profile pada seseorang
untuk kondisi particular

Teknik umum dalam genomic

1. Isolasi DNA, dibutuhkan untuk penelitian dalam genom

2. PCR, untuk memperbanyak DNA, mendetekssi
3. Elektroforesis : Teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya di medan listrik. Isolasi DNA dapat dilihat hasilnya menggunakan elektroforesis
4. Sekuensing: proses atau teknik penetuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA.
Hasilnya adalah data (file); berupa sekuens DNA (basa komplementer)

Isolasi DNA

1. Siapkan Sample
2. Lisis. Menghancurkan selnya, yang ingin kita dapatkan yaitu DNA. Penghancuran sel,
bergantung pada apa yang akan diisolasi. Untuk bakteri, ditambahkan buffer dan
dipanaskan. Sampel dari tanaman atau sampel jaringan hewan yang keras mis. Tulang,
lisisnya itu penghancurannya dengan nitrogen cair
3. Protein Removal, ditambahkan dnegan kloroform atau fenol atau bisa dicampurkan
4. Jika memakai kit, terdapat kolum alatnya bernama microchip. Dimasukkan garam supaya
DNA pengotor kebawah lalu DNA nempel di filter
5. Kemudian dicuci dengan etanol
6. Kemudian dilarutkan dengan buffer (DNA Elution)
7. Hasil akhir disimpan di suhu dingin -20 derajat celcius

Elektroforesis
 Menggunakan sumber listrik, terdapat elektroda negative dan positif. Sampel DNA diberi
pewarna lalu dimasukkan ke sumur. Setelah listrik dinyalakan, DNA akan bermigrasi di agar
(agarros). Nanti yang ukurannya besar karna agar terdapat banyak serat, ia akan tertahan di
atas. Ukuran kecil tertahan di bawah. Nanti dari marker tersebut, bisa diketahui ukuran
DNAnya.
Prinsip: memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya
Alat yang digunakan untuk elektroforesis:
1. Cetakan
2. Agar: agaros, lebih padat
3. Comb (sisir), cetakan untuk membuat bolongan di agarnya
4. Supply elektrik
5. DNA sampel
6. Pewarna

Cara:

1. Agar ditaro di cetakan masih dalam bentuk cair

2. Terdapat electrode negative dan positif. well (sumur terbentuk) yang dibuat oleh comb.
3. Ketika power supply dinyalakan, elektroda berjalan akan melalukan molekul dari
negative ke positif. Dna bermuatan negative karna terdapat fosfat.
4. DNA yang sudah diisolasi ditambah dengan pewarna terlebih dahulu, lalu teteskan ke
sumur menggunakan mikropipet.
5. Nyalakan supply listriknya, yang terjadi pewarna akan menandakan pada agar supaya
tidak lewat dari agar. Pewarna bergerak lebih cepat dibanding sampel DNAnya. Saat
sudah sampai ujung power supply dimatikan.
6. DNA tidak terlihat, tetapi yang terlihat pada agar adalah pewarnanya
7. Agar direndam dengan etidium bromide dan disinari sinar UV.

Note: Jika pada hasil akhir sampel terdapat dua atau lebih garis yang sama pada marker,
karena hasil restriksi oleh enzim. Menjadi dua atau lebih fragmen.

Elektroforesis: Melakukan pemisahan molekul berdasarkan ukuran fragmennya dengan medium

agarros.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

 Suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro

 Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari
jumlah semula
 Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya
 Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya
pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non target
 Amplifikasi adalah perbanyakan
 Hubungan PCR dengan deteksi COVID-19: DNA sangat Panjang, haanya gen target saja
yang diarahkannya. Yang dipakai yaitu primer, sehingga jika tidak ada tidak ada yang bisa
di amplifikasi. Primer hanya bisa menempel pada gen yang khas pada virus SARS COV2

Prinsip Kerja PCR

  Menggandakan potongan DNA tertentu dari seluruh untaian DNA, baik yang berasal dari
DNA sel inti (nucleus) maupun organel sel seperti DNA mitokondria (mtDNA)
 Untuk mendapatkan potongan DNA, diperlukan primer yang berfungsi untuk menandai
dimana ujung DNA yang akan digandakan
 Primer biasanya berpasangan yaitu Primer forward untuk menandai ujung depan untai DNA
dan primer reverse untuk menandai dari ujung belakang.
 Karena DNA terdiri dari double strand, maka DNA primer forward bekerja pada strand yang
satu sementara primer reverse bekerja pada untai pilihan yang satunya

Reagen Khusus yang Dibutuhkan dalam PCR

 Pasangan primer oligonukleotida (forward dan reverse) sintetik mengapit urutan yang akan
diamplifikasi.
 Primer forward melekatkan ke kodon start dari DNA template ( rantai anti-sense), sementara
itu primer reverse melekatkan ke kodonstop dari untai komplementer DNA (rantai sense)
 Harus punya target sequence untuk yang mau di amplifikasi
 Basa Nukleotida (Basa nitrogen): Campuran dari empat dNTP (Deoxynucleoside
triphosphate) adenine, sitosin, timin dan guanine. Untuk proses pemanjangan DNA

DNA Polymerase

 Salah satu kunci PCR adalah jenis DNA polimerase yang digunakan dalam reaksi. Pemanasan
dan pendinginan berulang yang diperlukan untuk PCR akan mendenaturasi dan
menghancurkan sebagian besar polimerase DNA hanya setelah beberapa siklus. Beberapa
sumber DNA polimerase yang sesuai dengan PCR tersedia.
 Salah satu enzim pertama dan paling populer untuk PCR dikenal sebagai Taq DNA
Polymerase
 Taq diisolasi dari domain Archaea yang disebut Thermus aquaticus, spesies yang hidup di
sumber air panas.
 Karena T. aquaticus beradaptasi untuk hidup di air panas (pertama kali ditemukan di mata
air panas Taman Nasional Yellowstone), ia telah mengembangkan DNA polimerase yang
dapat menahan suhu tinggi.
 Karena Taq stabil pada suhu tinggi, Taq dapat menahan perubahan suhu yang diperlukan
untuk PCR tanpa didenaturasi
 Polimerase termostat seperti Taq sangat penting untuk PCR

Mekanisme PCR

1. Sampel DNA, primer dan basa nukleotida (basa nitrogen) dan enzim polymerase masukkan
ke dalam mesin PCR
2. Atur siklusnya
3. Yang terjadi pada mesin PCR, kita mengetahui target DNA. Atur pengaturan suhu pada
masing-masing proses (denaturasi, annealing dan extension). Pada suhu 95 derajat celcius
terjadi proses denaturasi kurang lebih 5 menit. Sehingga menjadi untai tunggal. Polimerase
yang digunakan yaitu Taq DNA polymerase. Pada tahap annealing (suhu 55-65 derajat
celcius) primer menentukan DNA target ada dimana, primer menempel pada DNA. Enzim
polymerase bekerja pada tahap extension (72 derajat celcius). Basa Nitrogen untuk
memperpanjang sekuens.
4. Siklus kedua mengulangi siklus pertama, terus berlanjut siklusnya.
 5. Terdapat rumus untuk menghitung berapa banyak copy yang didapatkan dari siklus yang
diinginkan. 2n-2n, dimana n merupakan total siklus.

Komponen Volume
10X Reddymix Buffer 2,5 mikroliter
2 mM dNTPs 2.5 mikroliter
Thermoprime Plus 0.2 mikroliter
18s 10 mM Forward primer 1.25 mikroliter
18s 10mM reverse primer 1.25 mikroliter
16s 10mM forward primer 1.25 mikroliter
16s 10 mM reverse primer 1.25 mikroliter
Nucleic acid template X mikroliter
ddH2O To 25 mikroliter

Tahapan-Tahapan Polymerase chain reaction (PCR)

1. Denaturasi : DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal
2. Penempelan primer / annealing : primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen
dengan urutan primer
3. Reaksi polimerisasi (extension): primer yang telah menempel tadi akan mengalami
perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan template
oleh DNA polymerase

Selain ketiga proses tersebut, PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut

1. Pradenaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan
mengaktivasi DNA polymerase
2. Final elongasi
Dilakukan pada suhu optimum enzim (70 derajat celcius- 72 derajat celcius) selama 5-15
menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara
sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.

PCR Apllications

1. Forensic DNA analysis

2. DNA cloning
3. Study gene expression
4. Amplification of rare dna
5. Human genetic testing and disease diagnosis
6. Diagnostics test for disease causing pathogens
7. Paternity testing and determining family relationships

Macam-macam PCR

1. Real-time PCR (quantitative real time PCR atau qPCR)

2. Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
RT-PCR biasanya digunakan untuk amplifikasi RNA target. Template RNA dikonversi ke
(c)DNA komplementer oleh enzim reverse transcriptase. cDNA nantinya berfungsi sebagai
template untuk amplifikasi eksponensial menggunakan PCR. Cara kerja enzim, RNA diubah
menjadi DNA (pasangan basa komplementernya dg mRNA).
RNA AGCU
cDNA TCGA
cDNA adalah DNA yang komplemen dengan mRNA. Template awal yang digunakan
merupakan RNA, jadi hanya terdapat exon saja tidak terdapat intron.