BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Di Indonesia, terutama pada mahasiswa bioteknologi kajian mikrobiologi

merupakan kajian wajib dalam bentuk mata kuliah bagi mahasiswa prodi

biologi/bioteknologi. Kajian mikrobiologi di perguruan tinggi selalu disertai

dengan pelaksanaan praktikum untuk membekali mahasiswa untuk menguasai

softskill keterampilan kerja ilmiah yang biasa dilakukan di dalam laboratorium.

Pada saat melakukan praktikum mikrobiologi, tentu saja terlebih dahulu

kita perlu mengetahui jenis alat yang akan digunakan pada praktikum tersebut,

terutama alat-alat untuk sterilisasi. Secara umum sterilisasi merupakan proses

pemusnahan kehidupan khususnya mikroba dalam suatu wadah ataupun

peralatan laboratorium. Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam

sterilisasi yaitu menggunakan uap dari air yang mendidih selama beberapa

menit, yang kedua dengan menggunakan autoklave, atau yang ketiga dengan

penyaringan atau filtrasi.

Pada proses setrilisasi dan penyiapan media ini, kita harus memperhatikan

beberapa hal, tujuanya adalah agar bahan yang kita siapkan tidak

terkontaminasi oleh mikroba yang tidak kita kehendaki. Sterilisasi yang baik

dapat mencegah tumbuhnya mikroba lain yang tidak diharapkan dalam bahan

yang telah disterilisasi. Teknik sterilisasi yang digunakan berbeda antara satu

dengan lainnya, tergantung dari jenis material yang digunakan.

1
 Alat-alat yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi juga harus dalam

keadaan steril atau bebas dari kuman serta bakteri, virus dan jamur. Untuk

mensterilkannya diperlukan pula pengetahuan tentang cara-cara dan teknik

sterilisasi. Hal ini dilakukan karena alat- alat yang digunakan pada

laboratorium mikrobiologi memiliki teknik sterilisasi yang berbeda.

Lalu dalam mikrobiologi tentu saja kajiannya tidak jauh dengan

mikroorganisme. Kelangsungan hidup dan pertumbuhan mikroorganisme

dipengaruhi oleh adanya nutrisi dan factor lingkungan. Bahan nutrisi yang

tersedia dapat berupa bahan alami dan dapat pula bahan sintetis. Bahan nutrisi

yang digunakan mikroorganisme biasanya berupa senyawa sederhana yang

tersedia secara langsung atau berasal dari senyawa yang kompleks yang

kemudian dipecah oleh mikroorganisme menjadi senyawa yang sederhana

melalui proses enzimatik. Bahan nutrisi ini dapat berupa cairan atau padatan

setengah padat yang disebut sebagai media.

Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi pada media berupa molekul-

molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel-nya. Media

pertumbuhan juga bisa digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme,

identifikasi, dan membuat kultur murni. Media berfungsi sebagai tempat

tinggal, sumber makanan, dan penyedia nutrisi bagi mikroorganisme yang

akan dibiakan pada media, selain itu media juga berfungsi untuk membiakkan,

mengasingkan, mengirimkan dan meyimpan mikroorganisme dalam waktu

yang lama di laboratorium.

2
 Berdasarkan uraian permasalahan di atas, maka perlu dilakukannya

praktikum “Sterilisasi dan Pembuatan Medium Pertumbuhan Bakteri” agar

memberikan pemahaman kepada kita tentang hal-hal yang berkaitan dengan

sterilisasi dan pembuatan media serta menambah pengetahuan dan

keterampilan tentang teknik atau tata cara sterilisasi dan pembuatan media

dalam mikrobiologi.

1.2 Tujuan Praktikum

Berdasarkan latar belakang, tujuan yang ingin dicapai pada praktikum ini

adalah :

 Memahami alat-alat yang digunakan dalam praktikum sterilisasi dan

pembuatan medium pertumbuhan bakteri

 Memahami pembuatan media dan larutan pengencer

 Memahami cara sterilisasi terhadap alat, media dan larutan pengencer

1.3 Manfaat Praktikum

Berdasarkan tujuan praktikum, manfaat yang ingin dicapai pada praktikum

ini adalah :

 Mengetahui alat-alat yang digunakan dalam praktikum sterilisasi dan

pembuatan medium pertumbuhan bakteri

 Mengetahui pembuatan media dan larutan pengencer

 Mengetahui cara sterilisasi terhadap alat, media dan larutan pengencer

3
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Sterilisasi

Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organism yang

teradapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3

macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan;

penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida dan

glutaraldehida alkalin) (Mirsadiq, 2013).

Prinsip dasar sterilisasi yaitu memperpanjang umur simpan bahan

pangan dengan cara membunuh mikroorganisme yang ada di dalamnya.

Mikroorganisme pembusuk tersebut bisa berupa bakteri, khamir (yeast) dan

kapang (jamur) .

Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & pemijaran :

1. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung,

contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L dan lain-lain.

2. Sterilisasi panas kering : sterilisasi dengan oven umumnya pada suhu 160-

1700C selama 1-2 jam. Sterilisasi panas kering cocok untuk sterilisasi

serbuk yang tidak stabil terhadap uap air, alat yang terbuat dari kaca.

3. Sterilisasi uap panas: konsep ini mirip dengan mengukus, menggunakan

uap panas dibawah tekanan dengan menggunakan autoklaf.

Sterilisasi kimia, biasanya sterilisasi secara kimiawi menggunakan

senyawa desinfektan antara lain alkohol. Proses sterilisasi antiseptik kimia ini

4
 biasanya dilakukan dengan cara langsung memberikan pada alat atau media

yang akan disterilisasi. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu

saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga

mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi

bahan yang peka panas, misalnya larutan serum, enzim, toksin kuman, ekstrak

sel dan lain-lain. (Fauzi, 2013)

2.2 Medium

Medium adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrisi untuk

menumbuhkan mikroorganisme. Selain untuk menumbuhkan mikroorganisme,

medium dapat digunakan untuk isolasi, pengujian sifat-sifat fisiologi, dan

perhitungan jumlah mikroorganisme. (Anna Rakhmawati , 2012). Media

berdasarkan sifat terbagi menjadi 3 yaitu media padat, media semi padat semi

cair, media cair. Media berdasarkan susunannya terdiri atas media sintesis,

semi sintesis, dan media non sintesis. Berdasarkan tujuan yaitu media selektif

atau penghambat dan media diperkaya. Jenis Media yang sering digunakan,

yaitu Nutrient Agar, Nutrient Broth (NB), PDA (Potato Dextrose Agar),

Salmonella Shigella (SS) Agar, Eosin Methylene Blue Agar(EMBA).

Nutrient Broth (NB) adalah medium yang berbentuk cair dengan bahan

dasar adalah ekstrak beef dan peptone. Perbedaan konsentris antara Nutrient

Agar dengan Nutrient Broth yaitu nutrient agar berbentuk padat dan Nutrient

Broth berbentuk cair. PDA adalah medium umum pertumbuhan yang

digunakan dalam mikrobiologi, yang terbuat dari kentang (Potato infusion)

5
dan dekstrosa. Berdasarkan komposisinya PDA termasuk dalam media semi

sintetik karena tersusun atas bahan alami (kentang) dan bahan sintesis

(dextrose dan agar). Berdasarkan kegunaanya media NA (Nutrient Agar)

termasuk kedalam jenis media umum, karena media ini merupakan media

yang paling umum digunakan untuk pertumbuhan sebagian besar bakteri.

Bedasarkan bentuknya media ini berbentuk padat, karena mengandung agar

sebagai bahan pemadatnya. Media padat biasanya digunakan untuk

mengamati penampilan atau morfologi koloni bakteri (Munandar, 2016:84).

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri

dari campuran zat-zat makanan atau nutrisi yang diperlukan oleh

mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan

nutrisi di dalam media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk

menyusun komponen sel. Dengan media, pertumbuhan dapat dilakukan

dengan isolasi mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi

komposisi media pertumbuhannya. Bahan dasar adalah air (H2O) sebagai

pelarut dari agar-agar (rumput laut) dimana agar-agar tersebut berfungsi

sebagai pemadat media (Suhardi, 2008). Media biakan yang mampu

mendukung optimalisasi pertumbuhan milroorganisme harus dapat memenuhi

persyaratan nutrisi bagi mikroorganisme. unsur tersebut berupa garam organik,

sumber energy (karbon), vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT). Selain itu

dapat pula ditambahkan komponen lain seperti senyawa organik dan senyawa

kompleks lainnya (Suardana dkk, 2014).

6
 BAB III
METODE PRAKTIKUM

3.1 Lokasi dan Waktu Praktikum

Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi di Universitas

Esa Unggul pada tanggal 26 September 2019 pukul 14.40 - selesai.

3.2 Alat dan Bahan

Pembuatan Media

Alat : 11. Kaki tiga, kassa asbes, lampu

1. Erlenmeyer 100 ml,250 ml. spiritus, lap tangan.
2. Gelas ukur 100 ml 12. Timbangan listrik.
3. Timbangan dan kertas timbang
Bahan:
4. Hotplate dan Stirrer Bar/
1. Media biakan padat (NA =
microwave
Nutrient Agar, PDA=Potato
5. Spatula
Dextro Agar, NaCl atau
6. Kaca Arloji
lainnya)
7. Tabung Reaksi
2. Media biakan broth (Sukrosa
8. Cawan Petri
broth atau lainnya)
9. Labu ukur
3. Akuades
10. Aluminium foil, kapas
4. Aluminium Foil
berlemak, tali, kertas label dan
5. Kapas
gunting
6. Kain Kassa

3.3 Prosedur Praktikum

Medium umum untuk bakteri (Nutrient Agar/NA dan Nutrien Broth/NB) dan
PDA instant

a. NB instant @200 ml NB ························ 2,6 gram

7
Aquades ················· 200 ml
c. NA instan @150ml
b. NA manual @250 ml NA ...............................4,2 gram
Yeast………………….0,375 gram Aquades ......................150 ml
Peptone ·················· .1,25 gram
Ioudium Chloride ······ 1,25 gram d. PDA Instan @250 ml
Agar-agar ················ ..3,75 gram PDA…………………...9,75 gr
Aquades ...................... 1000 ml Aquadest……………… 250 ml

Langkah kerja:

1. Masukkan yeast, peptone, agar-agar, iodium chloride dan aquades ke dalam

beaker glass 500 ml dan NA/NB instan dan aquades ke dalam beaker glass

250 ml lalu panaskan di atas kompor pemanas, aduk hingga homogen atau

hampir mendidih

2. Masukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing 10 ml untuk media

tegak dan 5-7 ml untuk media miring, dan tabung Erlenmeyer masing-

masing 50 ml lalu semua tabung medium ditutup dengan kapas yang telah

dibungkus dengan kain kassa dan aluminium foil.

3. Sterilkan dengan autoklaf. Setelah disterilkan untuk media tegak biarkan

tabung dalam keadaan berdiri dan untuk media miring tabung dimiringkan

dengan catatan media tidak sampai menyentuh tutup tabung.

4. Media kemudian di simpan di dalam lemari pendingin dan nantinya akan

dipergunakan pada praktikum.

Sterilisasi Cara Kimia

1. Semprotkan alkohol 70 % pada tangan dan meja yang akan digunakan untuk

pengamatan lalu bersihkan meja dengan lap bersih.

8
 Sterilisasi Cara Fisika

Cawan petri, tabung reaksi, erlenmeyer, , kertas hvs, plastik tahan panas karet,

autoklaf, oven, dan aluminium foil, kapas berlemak, tali kasur, kertas label dan

gunting.

Langkah kerja:
1. Bungkus masing-masing cawan petri dan alat lainnya dengan kertas HVS

kemudian masukkan ke dalam plastik tahan panas.

2. Isilah autoklaf dengan aquades setinggi batas sarangan.

3. Aturlah suhu sebesar 121 oC, dengan tekanan 2 atm dan aturlah waktu yang

akan digunakan sampai pada angka 15-20 menit.

4. Pastikan lubang uap dalam keadaan tertutup (CLOSE)

5. Tarik tuas power sampai ketitik ON lalu tekan tombol ON, apabila lampu

hijau menyala maka dapat dipastikan autoklaf dalam keadaan bekerja.

6. Setelah alarm berbunyi maka tarik tuas power hingga ke titik OFF kemudian

bukalah lubang uap dengan cara memutarnya kearah OPEN.

7. Diamkan autoklaf selama 15 menit untuk memastikan bahwa uap keluar dan

autoklaf dalam keadaan tidak panas.

8. Bukalah tutup autoklaf dan keluarkan alat-alat yang telah steril. Cawan petri

dan tabung reaksi dimasukkan ke dalam oven untuk dikeringkan.

9
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil

Gambar 1. Persiapan Sterilisasi

Setelah dilapisi HVS, hasil akhir dari proses sterilisasi adalah alat dan

bahan tersebut menjadi steril (matinya mikroorganisme yang terdapat pada alat

dan bahan). Sesuai dengan petunjuk praktikum yang kita dapatkan setelah

menginkubasi alat dan bahan ke dalam autoklaf pada suhu 121℃ selama 15 menit.

No 1 2

NA instant, setelah itu dibuat media NA manual, PDA instant, NB

miring dan tegak dalam tabung instant. Lalu ditutup dengan tutup
reaksi kurang lebih sebanyak 5-7 yang telah dibuat.
ml. Lalu ditutup dengan tutup yang
telah dibuat.
Tabel 1. Hasil Media 10
4.2 Pembahasan

Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan

mikroorganisme di atas atau di dalamnya, medium tersebut harus memenuhi

syarat-syarat, antara lain adalah harus mengandung semua zat hara yang

mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan

permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan

ditumbuhkan, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat

pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan,

agar mikroba yang di tumbuhkan dapat tumbuh dengan. Percobaan kali ini

yaitu pembuatan medium NA instant, NA manual, NB instant dan PDA

instant .

NA (nutrient agar) digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri.

Pembuatan medium percobaan ini dengan menggunakan NA (nutrient agar),

dimana dalam pembuatan NA instant terlebih dahulu dengan cara menimbang

bahan yang sudah tersedia dan diproduksi secara paten kedalam neraca

analitik sesuai dengan jumlah yang diperlukan kemudian memasukkan bahan

kedalam erlenmeyer 250 ml, dimana bahan tersebut adalah aquades 150 ml,

NA 4,2 gram menggunakan microwave dan sesekali diaduk, tujuan dari

pemanasan dan pengadukan ini adalah untuk menghomogenkan NA dengan

aquades, dimana dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari NA

dan aquades. Setelah dipanaskan beberapa menit larutan berubah warna dari

keruh menjadi kuning kecoklatan hal ini menandakan larutan telah homogen.

11
Sama halnya dengan pembuatan NA manual, yaitu dengan menimbang

bahannya tersendiri, yaitu iodium chloride, yeast, peptone dan agar dan

terakhir ditambahkan aquadest. Lalu dibuat media miring dan tegak yang

selanjutnya akan diautoklaf. NB (Natrium Brost) pun sama, yang digunakan

pada praktikum kali ini menggunakan yang instant, dimana sudah ada dalam

bentuk sediaan yang sudah dibuat oleh pabrik. Kemudian dimasukkan

kedalam autoklaf dengan mulut erlenmeyer disumbat dengan kapas dan

dilapisi kertas aluminium diluarnya.

PDA (Potato Dextrose Agar) digunakan untuk menumbuhkan fungi

atau jamur. Pembuatan medium pada percobaan ini dengan menggunakan

PDA (Potato Dextrose Agar) instant dimana dalam pembuatannya terlebih

dahulu dengan cara memasukkan 9,75 gram PDA instant lalu 250 ml aquades

, kemudian dipanaskan menggunakan microwave dan sesekali diaduk, diikuti

oleh pengadukan dengan tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini untuk

menghomogenkan PDA dengan aquades. Setelah dipanaskan beberapa menit

larutan berubah warna dari keruh menjadi kuning tua. Setelah itu dimasukkan

kedalam autoklaf tetapi sebelum dimasukkan mulut erlenmeyer ditutup

dengan kapas dan kemudian dibungkus dengan kertas, hal ini bertujuan agar

meminimalkan kontaminasi.

Jika terjadi kesalahan, faktor yang menyebabkan kesalahan pada

praktikum ini ialah saat menuangkan ekstrak tidak hati-hati akan

menyebabkan ekstrak tumpah, tidak tepat saat menimbang komposisi media

akan menyebabkan tidak homogennya media yang dibuat.

12
 Autoklaf menggunakan suhu dan tekanan tinggi sehingga memberikan

kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibandingkan dengan udara

panas biasa. Autoklaf memiliki kelebihan yaitu alat perebus yang bertekanan

tinggi. (Permatasari, et all, 2013). Alat ini sering digunakan dalam teknik

pensterilan karena tingkat koefisien dan sifat alat yang tidak merusak

kandungan dalam media pertumbuhan yang dipakai yaitu NA, NB, PDA.

Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi,

yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sterilisasi merupakan

suatu proses (kimia dan fisika) yang membunuh semua bentuk hidup terutama

mikroorganisme. Sterilisasi yang digunakan dalam percobaan ini adalah

secara fisika yaitu menggunakan panas, dimana panas yang digunakan adalah

bersama uap air yang biasanya disebut sterilisasi basah.

Pada praktikum perlu dilakukan sterilisasi sebelum menggunakan alat

dan bahan. Peralatan seperti lumpang dan alu, cawan petri, media, tabung

reaksi, alat yang digunakan dalam penanaman bakteri terlebih dahulu

disterilisasikan menggunakan autoklaf. Cara sterilisasi yang tepat tergantung

pada jenis dan sifat bahan yang disterilkan dan yang kita praktikumkan kali

ini adalah metode pemanasan dengan uap air dan pengaruh tekanan

(autoklaf). Benda yang akan disuci hamakan diletakkan di atas lempengan

saringan dan tidak lagsung mengenai air di bawahnya. Pemanasan dilakukan

hingga air mendidih (diperkirakan pada suhu 100˚C) pada tekanan 15 lb

temperatur121˚C

13
 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dalam praktikum ini diperoleh kesimpulan bahwa

1. Peralatan dan bahan dalam praktikum sterilisasi dan pembuatan medium

pertumbuhan bakteri. Erlenmeyer 100 ml, 250 ml, gelas ukur 100 ml,

timbangan, kertas timbang, hotplate / microwave, spatula, tabung reaksi, cawan

petri, labu ukur, aluminium foil, kapas berlemak, tali, kertas label, gunting, lap

tangan. timbangan listrik. Lalu untuk bahan: media biakan padat Nutrient Agar,

PDA= potato dextro agar, nacl atau lainnya), media biakan broth (sukrosa

broth atau lainnya), akuades , aluminium foil, kapas, kain kassa

2. Metode sterilisasi yang dilakukan adalah dengan menggunakan autoklaf untuk

menghilangkan mikroorganisme pada alat dan bahan yang akan digunakan

dalam praktikum selanjutnya.

3. Media NA instant dan manual, NB instant dan PDA dibuat berdasarkan

perhitungan yang sesuai dengan aturannya. Media NA berfungsi sebagai

penumbuhan bakteri/mikroba dalam bentuk padat, media NB berfungsi sebagai

penumbuhan bakteri/mikroba dalam bentuk cair sedangkan media PDA

berfungsi untuk menumbuhan jamur

5.2 Saran

Diharapkan semua praktikan dalam praktikum pembuatan media dan

sterilisasi lebih memperhatikan arahan dari asisten sehingga pada saat praktikum

tidak terjadi kesalahan

14
 DAFTAR PUSTAKA

R, Anna. 2012. Penyiapan Media Mikroorganisme. Pelatihan Laboratorium Guru

SMA Kab. Purworejo

Fauzi, Hikmah . 2013. “Sterilisasi dan Macam-macamnya ”. Lembaga Sumber

Daya Informasi, IPB, Bogor.

Munandar,K. 2016. Pengenalan Laboratorium IPA-BIOLOGI Sekolah. Bandung:

Refika Aditama.

Permatasi, et all, 2013. Uji Pembuatan Marning Jagung dengan Menggunakan

Autoclave. Jurnal Keteknikan Pertanian Tropis dan Biosistem. Vol. I. No.1

Suardani, Dkk. 2014. Identifikasi E Colli 0157:H7 dari Feses Ayam dan Uji Profil

Hemolisisinya Pada Media Agar Darah. Jurnal kedokteran hewan. Vol 8. No.

1.

Suhardi, S.H., Koesnandar, D. K. Indriani, H. Arnaldo 2015. Biosafety: Pedoman

Keselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. PT.

Multazam Mitra Prima.

15
 LAMPIRAN

Penimbangan NA, NB, Pencampuran bahan Pemanasan dan pengadukan bahan

dan PDA media dengan air media dengan air untuk homogenisasi

Pembuatan tutup khusus untuk menghindari kontaminasi

Pembuatan media tegak dan miring yang selanjutnya akan disteriliasi

16