LAPORAN PRAKTIKUM VIRTUAL

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

OLEH:

KELOMPOK : 2

1. ANISA KURNIATI (1806050008)

2. ALFREDUS DARMO (1806050007)
3. CHARLIE JANICE (1806050003)
4. DITIA ADINDA ULY LENA (1806050006)
5. FLORENSIA PURNAWATI SETIA (1806050005)
6. YANREF RICARDO TALLAS (1806050002)

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNIK

UNIVERSITAS NUSA CENDANA

KUPANG

2020
 BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR),
merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro.
Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah
semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi
dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target.
Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada
urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.

Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan

biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus,
diagnosis dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and bio-diversity
applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of genes dan mRNA Quantitation di
sel ataupun jaringan.

 Teknik Dasar Amplifikasi PCR

Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing
dan ekstensi oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik
digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai DNA target dan
mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan. Dasar siklus PCR ada 30-35 siklus meliputi:

 Denaturasi untai ganda DNA

Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses PCR.
Temperatur yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA.
Temperatur pada tahap denaturasi pada kisaran 92-95ºC, suhu 94ºC merupakan pilihan
standar.

 Primer Annealing

Primer Annealing, pengenalan (annealing) suatu primer terhadap DNA target

tergantung pada panjang untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer itu sendiri.
Optimalisasi temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting Temperature (Tm)
dari ikatan primer dan DNA template. Cara termudah menghitung untuk mendapatkan
melting-temperatur yang tepat menggunakan rumus Tm = {(G+C)x4} +{ (A+T)x2}.

 DNA Polymerase extension

Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari
posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan bergerak dari
ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan
informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang
ditargetkan. Pada setiap satu kilobase (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1
menit.

 Komponen PCR

Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, ensim DNA polimerase
yang thermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, dan thermal cycler.

 Template DNA

Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp) atau 1KB,
Hasil amplifikasi yang efisien antara 100-400bp. Walaupun kemungkinan hasil amplifikasi
lebih dari 1 kB tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang panjang rentan terhadap
inhibitor yang mempengaruhi kerja ensim DNA polymerase dan waktu yang diperlukan lebih
lama. Hal ini dapat menyebabkan hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.

 Primers

Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini harus
mampu mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi sepasang
primer akan mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada tiap
primernya. Kandungan GC harus antara 45-60%. Annealing temperatur antara primer yang
digunakan harus berkisar antara 1°C. Ujung 3’ dari setiap primer harus G atau C, akan tetapi
hindari susunan nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC,
GGG, CCC, GCC. Pada penentuan atau penyusunan sepasang primer, penting diperhatikan
urutan primer tidak saling komplementer sehingga membentuk dimer-primers, berikatan satu
sama lain, atau membentuk hairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada daerah DNA
repetitif.

 Taq DNA polymerase

Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas
polimerisasi DNAnya dari ujung-5’ ke ujung-3’ dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu
paruh sekitar 40 menit pada 95ºC. Biasanya untuk setiap 100μl volume reaksi ditambahkan
2.0-2.5 unit.

 PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan
1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan
primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain.
Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2. Konsentrasi
ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena
kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA
template, dan produk PCR.

 Nucleotides (dNTPs)
 Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 μM. Pada
konsentrasi ini penting untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada titik estimasi Km
untuk setiap dNTP. 50mM, harus selalu diatur pH7.0. Konsentrasi yang tinggi akan
menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polymerase. Sedang pada konsentrasi rendah
akan memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total
konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas.

 PCR Thermal Cycler

PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaan PerkinElmer sebagai
pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR thermal
cycler ini dari berbagai perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi. Walaupun nama
masing-masing alat itu berbeda tetapi prinsip kerjanya sama.

1.2 Tujuan
- Untuk Memperbanyak DNA Secara In Vitro
- Untuk Mengetahui Tahapan-Tahapan PCR
 BAB II

METODE
2.1 ALAT DAN BAHAN
- Tip - Mikropipet
- PCR Tube - Kertas Label
- Alkohol 70 % UV - UV-Transiluminator
- Larutan Pcr (Primer RAPD, Isolate DNA, ddH20, dan PCR Mix)

2.2 PROSEDUR KERJA

1. Melakukan isolasi DNA

2. Pastikan kondisi ruangan kerja bersih dari kontaminasi
3. Pastikan harus menggunakkan sarung tangan dan masker
4. Semprotkan alkohol 70% pada area meja kerja dan bersihkan dengan tisu.
5. Setelah mendapat isolat DNA siapkan tube PCR terdiri dari bahan primer RAPD,
DNA template, PCR mix dan ddH2O dengan label masing-masing tube sesuai kode
sampel.
6. Kemudian membuat larutan PCR dari komponen-komponen tersebut.
7. Atur volume larutan pada mikropipet dengan cara menurunkan bagian kepala pipet
hingga mencapai angka yang dikehendaki.
8. Pasang tip sesuai dengan ukuran mikropipet kemudian ambil primer rap menggunakan
mikropipet 1 lalu tutup dahulu primer primer tube
9. Kemudian keluarkan primer dalam PCR tube baru dan dan dikeluarkan pada bagian
dasar PCR tube, setelah itu lepaskan tip dari mikropipet dan ganti dengan tip yang
baru bila akan melakukan dengan larutan jenis lain
10. Mengulang langkah sebelumnya dengan mencampur larutan ddh2o, primer RAPD,
PCR mix ke dalam tube
11. Homogenkan sampai dengan mix perlahan menggunakan jari pada ujung tube sampel
diberi label dan PCR tube dimasukkan ke dalam mesin PCR tutup mesin PCR dengan
benar dan tekan tombol on untuk menghidupkan
12. Atur siklus PCR dengan pengatur sebagai berikut untuk pre-denaturasi atur suhu 940C
selama 5 menit, denaturasi pada suhu 940C selama 1 menit, annealing pada suhu 470C
dalam waktu 30 detik dan elongasi pada suhu 720C selama 1 menit kemudian atur
siklus denaturasi sampai Anne Aling dengan mengulang sebanyak 35 kali dan untuk
tahap Post elongasi atur suhu 720C selama 5 menit
13. Jalankan PCR dan tunggu hingga selesai setelah itu itu mati kan mesin PCR dan cek
hasilnya pada UV-Transilluminator.
 BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

Setelah selesai melakukan PCR, produk PCR bisa dilihat dengan cara pemuatan pada
DNA Elektroforesis. Namun sebelum itu, kita harus membuat gel (agarose) yang
mengandung Ethidium bromide (EtBr) berdasar cetakan yang tersedia dalam perangkat
tersebut. Untuk kebutuhan deteksi, biasanya cukup menggunakan 3-5 ul saja dari total produk
PCR 50 ul. Jadi, sampel pipet sebanyak volume tersebut, campurkan dengan buffer loading ,
dan berjalan selama kira-kira 15 menit.

Setelah itu angkat gel dari tangki , dan tempatkan pada UV Transilluminators.
Visualisasi hasil PCR Pada gambar tersebut ada no. 1 sampai 4 yang terletak pada sumur
( well ) gel agarose. Nomer 1 ( baris 1) yang merupakan hasil PCR, namun sebuah penanda
( marker ). Marker DNA tersebut memiliki ukuran yang telah diketahui yang kisarannya
antara 100 bp sampai 21 kilo bp. Pada gambar tersebut tampak ukurannya yaitu 100, 200,
sampai 500 bp. Baris 2 adalah kontrol negatif, yaitu hanya menggunakan buffer pemuatan ,
sedangkan baris 3 dan 4 adalah produk PCR. Dari gambar tersebut kita bisa menyimpulkan
bahwa produk PCR tersebut berukuran 400 bp.
 BAB IV

PENUTUP
4.1 Simpulan

Dari pembahasan di atas dapat di simpulkan bahwa:

1. Untuk memperbanyak DNA secara in vitro dapa6t di lakukan dengan teknik

Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk
mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah
urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali.
Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya.
Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target.
2. Dalam proses polymerase chain reaction (PCR) terdapat tiga tahapan yaitu tahap
denaturation (95°C), 30 detik, annealing (55–60°C), 30 detik, extension (72°C), waktu
tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai produk
amplifikasi.

4.2 Saran

Semoga kedepannya untuk praktikum tentang polymerase chain reaction (PCR) dapat di
lakukan lebih baik lagi sesuai dengan kriteria yang ada untuk mendapatkan hasil DNA yang
lebih baik sesuai yang di inginkan.
 DAFTAR PUSTAKA
 https://youtu.be/AHBo9xnBbL8.Demonstrasi-PCR-dan-Elektroforesis-DNA-Manusia
 https://youtu.be/t7hiaa31F4w.Pahami-Cara-Memperbanyak-atau-Coppy-DNA-
dengan-Metode-PCR(polymerase-chain-reaction)
 https://youtu.be/matsiHSuoOw.Tutorial-PCR(Reaksi-Rantai-Polimerase)