Makalah Prinsip Bioteknonlogi

Dosen Pengampu : Dr. Yudhi Nugraha, S.Si, M.Biomed

Oleh Kelompok 3 Kelas 5C

- Jilan Nuriah Hasanati (11180950000102)

- Adelia Nur Kholifah (11180950000112)

METODE MUTASI IN VITRO.

Mutasi dalam Kamus Besar Bahasa Indonesia artinya “Perubahan”. Sedangkan

dalam genetika, mutasi berarti perubahan yang terjadi pada gen baik DNA maupun RNA.
Perubahan-perubahan ini dapat meliputi perubahan urutan gen, jenis basa nukleotida
ataupun perubahan pada kromosom (Girija dan Dhanavel, 2009). Mutasi dapat terjadi
karena paparan mutagen baik alami maupun buatan, paparan mutagen seperti bahan
radioaktif, zat-zat karsinogenik, sinar-X, sinar ultraviolet dari matahari ataupun petir
yang terdapat di alam dapat menyebabkan mutasi secara spontan. Individu yang
mengalami perubahan karena terkena paparan tersebut disebut mutan, sedangkan yang
tidak mengalami perubahan disebut tipe liar (wild type) (Arumningtyas, 2019)

In vitro secara bahasa berarti di dalam kaca, hal ini mengacu pada suatu proses
atau perlakuan yang dilakukan menggunakan alat-alat kaca di dalam laboratorium atau
dapat juga dikatakan sebagai perlakuan yang dilakukan di luar sel. Metode mutasi in vitro
dapat diartikan sebagai sebuah metode untuk melakukan perubahan pada target mutasi
yang prosesnya di lakukan di luar sel organisme tersebut. Proses terjadinya mutasi
disebut mutagenesis.

1. Mutagenesis in vitro
Bila mutasi merupakan perubahan yang terjadi pada suatu gen, maka mutagenesis
adalah proses dimana mutagen menyebabkan sekuen DNA atau informasi genetik
mengalami perubahan yang mengakibatkan terjadinya mutasi. Mutagenesis dapat terjadi
di alam secara spontan atau dapat juga terjadi di laboratorium (in vitro).
 Mutagenesis in vitro merupakan suatu perkembangan yang penting dalam biologi
molekuler karena dapat membuat mutasi pada suatu gen dan menganalisis protein yang
dihasilkan dengan ekspresi in vitro. Hal ini dapat biasa disebut sebagai ‘Protein
engineering’ atau rekayasa protein. Rekayasa protein dapat dilakukan dengan Site-
Directed Mutagenesis.

2. Sejarah Singkat Site-Directed Mutagenesis.

Sebelumnya metode mutagenesis hanya dilakukan secara acak, tetapi karena
penelitian terus berkembang didapatilah metode mutagenesis yang terarah, metode ini
diperkenalkan pada tahun 1974 oleh Charless Weissman untuk pertama kalinya.
Kemudian dilanjutkan oleh Clyde Hutchison dan Michael Smith Tahun 1978 sehingga
menyempurnakan metode SDM sehingga lebih fleksibel dengan menggunakan DNA
polimerase dan penambahan oligonukleotida pada primer (Hutschison et. al., 1978).
Untuk perannya dalam pengembangan proses ini, Michael Smith kemudian
berbagi Hadiah Nobel di bidang Kimia pada Oktober 1993 bersama Kary B. Mullis ,
yang menemukan PCR.

3. Pengertian dan Mekanisme SDM (Site directed mutagenesis)

SDM adalah sebuah metode yang dilakukan untuk mengubah sekuen nukleotida
DNA. Pengubahan sekuen nukleotida DNA dapat meliputi penghilangan nukleotida
(delesi), penggantian nukleotida (subtitusi) ataupun penyisipan nukleotida (insersi) dari
sumber manapun (Afidah, 2017).
Pada dasarnya untuk melakukan Site-Directed Mutagenesis melibatkan cloning
gen dari protein yang ingin dianalisis kemudian disisipkan pada satu vektor. Kemudian
dilakukan pembuatan desain oligonucleotide untuk melengkapi gen tersebut,
oligonucleotide didesain khusus dengan menempatkan mutasi yang diinginkan kemudian
diapit oleh urutan gen yang sesuai dengan pasangan dari gen template. Mutasi
diperkenalkan dengan menyilangkan single strand template dengan oligonucleotide yang
sudah didesain. Pembentukan second strand dapat berlangsung dengan adanya
oligonucleotide sebagai primer dan DNA polimerase (Bronzino, 2000).
 Ada beberapa metode site-directed mutagenesis baik yang sudah ditinggalkan
maupun yang masih digunakan sampai saat ini. Contoh kit Site-Directed Mutagenesis
yang masih digunakan antara lain metode Q5 site-directed mutagenesis dan
QuickChange. Kedua metode ini dibedakan dari primernya, dimana primer yang
digunakan untuk Q5 site-directed mutagenesis adalah primer dengan desain berlawanan
arah (back-to-back orientation), sebaliknya metode QuickChange menggunakan desain
primer yang saling tumpang tindih (overlapping) (Wikantika, 2018).

4. Pengguaan Site-Directed Mutagenesis untuk penelitian

Dalam suatu penelitian Site-Directed Mutagenesis dapat digunakan untuk
mengidentifikasi sisi aktif enzim yang bekerja pada tanaman. Tanaman menghasilkan
sukrosa sebagai gula transportasi pada mekanisme pertumbuhannya. Fungsi lain
sukrosa juga dapat menjadi simpanan fotosintetis pada tanaman. SPS merupakan
salah satu enzim tanaman yang berperan dalam metabolisme sukrosa. Penelitian
untuk mengidentifikasi sisi aktif enzim yang berperan dalam metabolisme sukrosa
diharapkan dapat menjadi bahan apabila kedepannya akan dilakukan rekayasa protein
pada sisi aktif enzim dengan tujuan meningkatkan proses sintesis sukrosa. SDM pada
penelitian ini digunakan untuk memutasi asam amino target dengan alanin. Proses
nya dilakukan menggunakan PCR dengan kit SDM Quick Change Lighting Site-
Directed Mutagenesis termasuk di dalamnya DNA polimerase, oligonucleotide
primer, plasmid dan lain-lain. Untuk mengetahui sisi aktif enzim proses masih harus
melalui beberapa tahap lagi setelah didapatkan gen hasil mutasi (Afidah, 2017).

5. Sejarah Perkembangan CRISPR / Cas9

CRISPR adalah proses fisiologis pada bakteri, yang merupakan salah satu sistem
kekebalan (imunitas) pada bakteri. Para peneliti berusaha mempelajari CRISPR ini
karena keunikan prosesnya. Metode CRISPR yang unik ini awalnya ada pada bakteri
mampu menggabungkan DNA asing kedalam DNA bakteri. Kumpulan pengulangan yang
merupakan cara kerja CRISPR ini pertama kali ditemukan oleh Yoshizumi Is hino pada
tahun 1987 pada bakteri Escherichia coli. Namun pada saat itu belum diketahui fungsi
dan manfaatnya. Di tahun 2000, proses pengulangan serupa diidentifikasi terjadi pada
bakteri lain dan archaea. Kemudian peristiwa pengulangan ini diberi istilah SRSR atau
Short Regularly Spaced Repeats dan kemudian dirubah istilahnya menjadi CRISPR di
tahun 2002 ((Doudna & Charpentier 2014; Sander & Joung 2014 di dalam Kartiko, dkk.
2017). Pada awalnya para ahli menduga bahwa sekuen itu hanya merupakan sekuen
biasa, tetapi pada tahun 2005, tiga grup ahli bioinformatika melaporkan adanya
kesesuaian DNA bakteri dengan DNA pada sekuens virus Bakterioage yang
menunjukkan adanya kemungkinan cara kerja CRISPR dalam mekanisme imunitas
mikroba (Supatmi, 2016). Pada tahun 2007, fungsi CRISPR sebagai sistem imun untuk
melawan serangan infeksi virus ini dibuktikan oleh Barrangou dan Horvath serta
Moineau’s group di Universitas Laval Canada yang menggunakan spacer DNA untuk
mengubah Streptococcus thermophilus untuk menyerang Bakteriofag. Penelitian lain juga
dilakukan oleh Gilles Vergnaud di Perancis  di bidang mikrobiologi forensik yang
mengembangkan metode untuk menulusuri sumber penyebab penyakit berdasarkan
perbedaan genetik di antara sejumlah strain patogen, dan juga penelitian Alexander
Bolotin di Rusia yang mengangkat isu spekulasi CRISPR yang merupakan suatu bentuk
imunitas, Kemudian peneliti independen Doudna dan Charpentier mempelajari protein
CRISPR terkait bagaimana suatu bakteri menggunakan spacer sebagai pertahanan
kekebalan tubuh mereka. Mereka mempelajari sistem CRISPR sederhana yang
bergantung pada protein yang disebut Cas9 Mereka juga menemukan bahwa bakteri
merespon suatu fag yang akan menyerang dengan cara menyalin spacer dan DNA
palindromic menjadi molekul RNA lama. Kemudian sel akan menggunakan tracrRNA
dan Cas9 untuk memotong molekul RNA lama menjadi potongan-potongan yang disebut
crRNAs (Qi et al. 2013; Doudna & Charpentier 2014). Mereka juga pernah melakukan
eksperimen dengan mengubah DNA tikus hitam dan dihasilkan tikus yang lahir berwarna
putih. Hal ini menjadi petunjuk yang menarik dalam perkembangan CRISPR selanjutnya.

6. Pengertian dan Mekanisme Kerja CRISPR-Cas 9.

CRISPR adalah singkatan dari Clustered regularly interspaced short palindromic
repeats, merupakan suatu sekuens DNA dengan repitisi pendek dan setiap repitisi
tersebut diikuti dengan segmen pendek lainnya yakni DNA Spacer sehingga terususun
secara selang-seling yang dimiliki oleh genom bakteri dan archaebacteria. Sedangkan Cas
yang biasa disebut CRISPR associated proteins adalah enzim endonuklease yang
dihasilkan oleh gen dari "cas operon", Gen cas terdapat dua kelas, yakni kelas 1 yang
merupakan sistem kompleks untuk memotong materi genetik asing, sedangkan kelas 2
menggunakan protein tunggal namun memiliki fungsi yang sama dengan kelas 1.
Masing-masing kelas tersebut dibagi lagi menjadi tipe cas. Tetapi yang lebih dikenal
adalah Cas 9. CRISPR/Cas9 merupakan suatu sistem alami yang dimiliki oleh organisme
prokariotik dan archaebacter sebagai perlindungan dirinya sendiri dari serangan virus
dengan memotong DNA virus yang diinjeksi (Damara, 2017).

Komponen protein Cas9 tersusun atas empat yakni terdiri dari dua protein utama
REC dan RuvC. REC dan RuvC yang dihubungkan oleh daerah kaya akan asam amino
arginine. Dua komponen berikutnya yakni HNH dan PAM (ProtosapecerAdjacent Motif)
yang merupakan urutan DNA yang terdiri atas 2-6 bp. Fungsi semasing-masing
komponen Cas9 yakni REC dan NHN berfungsi sebagai enzim endonuklease yaitu
memotong DNA), RuvC berfungsi sebagai area sisi pengenalan (recognition site)
sedangkan PAM berfungsi untuk menyisipi urutan DNA target, ketika Cas9 mengenali
DNA asing yang dijadikan target. PAM juga sebagai pengunci saat proses sistem
CRISPR/Cas9. Sistem CRISPR-Cas9 adalah dua komponen penting yang bekerjasama
untuk menghancurkan materi genetik asing. Secara alami terdapat 3 mekanisme utama
CRISPR-Cas9 yakni akuisisi DNA, pemrosesan crRNA, dan interferensi (Kartiko, dkk.
2017).

Tahapan akuisi DNA ditandai dengan proses masuknya DNA asing ke dalam sel,
maka dengan segera fragmen DNA asing tersebut akan ditagkap sebagai memori genetik
dan disimpan dalam DNA spacer. Ketika ada virus dengan fragmen DNA yang sudah
pernah direkam sebelumnya, langkah berikutnya Gen CRISPR akan melakukan
transkripsi menghasilkan CRISPR RNA (crRNA) sedangan gen Cas9 akan menghasilkan
protein Cas9. Kemudian tracrRA juga disintesis. crRNA dan tracrRNA akan bergabung.
Dan gabungan kedua RNA tersebut dinamakan guide RNA (gRNA) atau  RNA Pemandu.
Selanjutnya  RNA pemandu akan bergabung dengan Cas9 membentuk kompleks. RNA
Pemandu/Cas9 akan mengikat DNA asing dan memotongannya menjadi DNA inaktif.
RNA pemandu yang mengandung DNA target pada daerah spacer dialah yang nantinya
akan menentukkan titik DNA target yang akan dipotong dan diinaktifkan sedangkan
protein cas 9 berfungsi untuk memotong DNA target dalam hal ini adalah DNA virus.

7. Mekanisme Kerja CRISPR-Cas9 untuk Edit Gen

CRISPR-Cas9 bekerja secara tertarget dan presisi. Berbeda dengan teknik
transgenik dimana proses rekayasa genetika dilakukan dengan acak dalam suatu genom,
Dengan demikian CRISPR-cas 9 memiliki keunggulan yang lebih, sistem Cas9 pada
CRISPR ibaratnya adalah gunting pemotong DNA yang mampu bekerja jika ada
pemandu. Protein Cas 9 berbeda dengan enzim restriksi yang bekerja
berdasarkan restriction sites yang spesifik. Cas9 dapat bekerja jika bergabung
membentuk kompleks dengan RNA Pemandu (sgRNA). Dari sinilah kunci untuk
menargetkan memotong DNA dibagian tertentu diantara jutaan DNA, bagian sgRNA
dapat dibuat secara artifisial untuk memotong bagian DNA tertentu secara tertarget,
sgRNA ini bersifat programmable artinya dapat diprogram disesuaikan dengan
nukleotida-nukleotida yang ada pada DNA target, dan bagian inilah yang menjadi
keunikan dari metode ini bagian sgRNA bisa diedit sesuai dengan DNA target. ketika
sgRNA telah sesuai dengan DNA target, maka target akan ditemukan dengan bantuan
dari sgRNA, sgRNA akan menempel sesuai dengan urutan DNA target, akhirnya
Kompleks Cas9 bertemu dengan DNA target. Selain itu agar kompleks sgRNA dan Cas9
berhenti pada sekuens DNA yang sesuai, maka dibutuhkan sebuah “penanda” yang
menjadi daerah pemberhentian mereka guna melakukan pemotongan yakni Protospacer
Adjacent Motif (PAM). Setelah kompleks menempel pada sekuens DNA yang tepat,
maka dari enzim endonuclease yang yang pada protein cas 9 akan memotong DNA target
memotong pada 17 hingga 23 pasangan nukleotida setelah PAM yang kemudian
menggunakan enzim-enzimnya untuk membuka untaian dan memotong DNA tersebut.
Setelah DNA berhasil terpotong maka tinggal ditempelkan gen yang ingin disisipkan
sesuai dengan tujuan yang diinginkan, Perbaikan gen bisa dilakukan dua cara yaitu
dengan Error-prone dengan mekanisme Non-Homologous End Joining (NHEJ),
atau homology-directed repair (HDR)). HDR berfungsi dalam menggunakan cetakan
DNA donor yang secara tepat memperbaiki DSB (double strand break) untuk
memodifikasi gen dengan efisiensi rendah, sedangkan NHEJ berfungsi dalam penyisipan
atau penghapusan genom untuk gangguan gen dengan efisiensi tinggi . Pada CRISPR-
Cas9, efisiensi pengeditan genom dipengaruhi oleh NHEJ dan HDR. NHEJ dan HDR
memiliki efisiensi yang berbeda. NHEJ aktif pada seluruh siklus sel, sementara HDR
hanya bekerja selama fase S / G2 saja. Maka dari itu, NHEJ umumnya memiliki
fleksibilitas den efisien yang lebih dalam menghasilkan penyisipan atau penghapusan
genom contoh kasus yakni saat mengalahkan kanker dibandingkan HDR.

8. Aplikasi CRISPR/Cas 9
Banyak para peneliti yang telah melakukan percobaan atau pengujian dengan
teknologi ini dengan melihat kemampuan pengeditan genom yang cepat dan presisi pada
CRISPR / Cas 9, menghasilkan produk mutasi genetic pada tanaman, buah yang bisa
dimanfaatkan, dan memiliki peluang besar dalam mengaaplikasikannya ke semua
organisme, termasuk hewan dan manusia. CRISPR/Cas 9 juga dapat digunakan untuk
pengobatan terapi gen dalam penyembuhan penyakit, seperti HIV, sel-sel kanker dan lain
sebagainya, baik penyakit genetik maupun non-genetik. Penelitian terdahulu yang
dilakukan oleh (Zhen, dkk. 2014 dan Kneddy, dkk. 2014 di dalam Damara, 2017) telah
menguji dengan melakukan delesi pada gen E6 dan E7 pada virus HPV16 secara terpisah
dengan menggunakan CRISPR/Cas9. Hasil penelitian tersebut menunjukkan tidak hanya
terhambatnya proses pertumbuhan sel kanker, namun ukuran sel kanker serviks juga
berkurang akibat peningkatan dari aktivitas apoptosis dari efek yang diberikan oleh p53
dan pRB yang tidak lagi dihambat oleh gen E6 dan E7. Pada penelitian tersebut
menyatakan bahwa CRISPR/Cas9 dapat dilakukan dengan bantuan vektor virus
Adenovirus (AAV) dan dilakukan dengan cara injeksi intravena dengan dosis yang sesuai
pada pasien. Akan tetapi dalam penerapannya seacra umum terapi gen pada manusia
perlu adanya pemastian bahwa pengobatan akan menyembuhkan orang tersebut dan tanpa
menyebabkan kondisi lain yang tidak diinginkan, namun para peneliti mencoba
melakukan metode-metode tertentu sehingga bahaya yang ditimbulkan bisa dihindari atau
diminimalkan. Teknologi CRISPR-Cas9 juga dapat digunakan untuk mengubah DNA di
inti sel reproduksi yang mengirimkan informasi dari satu generasi ke generasi berikutnya
(“germline” organisme). Dengan demikian, modifikasi genom dapat dilakukan pada telur
atau embrio hewan yang telah dibuahi, sehingga merubah susunan genetik dari setiap sel,
dan perubahan tersebut akan diteruskan ke keturunan organismnya, Akan tetapi
penggunaan CRISPR-Cas-pada germline manusia, perlu dipastikan keamanannya ,
beberapa pihak yang tidak setuju dalam memodifikasi germline manusia (sel telur dan
sperma), dengan alasan karena tidak akan bisa menjamin jika embrio mosaik yang
dibuat, germline-nya dapat membawa perubahan genetik atau tidak (Wijaya, dkk. 2017).
Dengan demikian perlu adanya pengujian klinis terhadap masalah ini, berhubung
teknologi ini memiliki peluang yang besar dalam memberikan manfaat bagi kehidupan
makhluk hidup,
 Daftar Pustaka

Arumningtyas, Estri Laras. 2019. MUTASI: Prinsip Dasar dan Konsekuensi. Malang: UB Press.

Afidah, Siti Nurul. 2017. Identifikasi Sisi Aktif Rekombinan Sucrose Phospate Synthase
Menggunakan Metode Site-Directed Mutagenesis. Skripsi. Universitas Jember, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Bronzino, Joshep D. 2000. The Biomedical Engineering Handbook Second Edition Volume II.
USA: CLC Press LLC.

Chen, Minjiang, Aiwu Mao, dkk. (2019). CRISPR-Cas9 for Cancer Therapy: Opportunities and
Challenges. Cancer Letters. Vol.447 : 48-55

Damara, Fachreza. 2017. CRISPR/Cas9 Dengan Dual-Sgrnas Bertarget Gen E6 Dan E7 Virus
HPV 16 Sebagai Inovasi Terapi Gen Upaya Menurunkan Angka Kanker Serviks Global.
Jurnal Scientific Pinisi. Vol(3). 2 : 98-103.

Kartiko, dkk. 2017. Aplikasi Teknologi Crispr/Cas9 Dalam Anti-Aging Medicine. Vol. 1 (2) :
50-56.

Supatmi, 2016. Bioteknologi Crispr/Cas9: Caraterbaruuntuk “Memukul Jatuh Gen". BioTrends.

Vo. 7 (2) : 31-36.

Wijaya, dkk. 2017. Genome Editing With CRISPR-Cas9 Systems: Basic Research And Clinical
Applications. The Indonesian Biomedical Journal. Vol. 9(1) : 1-16.

Wikantika, Ketut. 2018. Bunga Rampai Forum Peneliti Muda 2018. Bandung: ITB Press.