In vitro secara bahasa berarti di dalam kaca, hal ini mengacu pada suatu proses
atau perlakuan yang dilakukan menggunakan alat-alat kaca di dalam laboratorium atau
dapat juga dikatakan sebagai perlakuan yang dilakukan di luar sel. Metode mutasi in vitro
dapat diartikan sebagai sebuah metode untuk melakukan perubahan pada target mutasi
yang prosesnya di lakukan di luar sel organisme tersebut. Proses terjadinya mutasi
disebut mutagenesis.
1. Mutagenesis in vitro
Bila mutasi merupakan perubahan yang terjadi pada suatu gen, maka mutagenesis
adalah proses dimana mutagen menyebabkan sekuen DNA atau informasi genetik
mengalami perubahan yang mengakibatkan terjadinya mutasi. Mutagenesis dapat terjadi
di alam secara spontan atau dapat juga terjadi di laboratorium (in vitro).
Mutagenesis in vitro merupakan suatu perkembangan yang penting dalam biologi
molekuler karena dapat membuat mutasi pada suatu gen dan menganalisis protein yang
dihasilkan dengan ekspresi in vitro. Hal ini dapat biasa disebut sebagai ‘Protein
engineering’ atau rekayasa protein. Rekayasa protein dapat dilakukan dengan Site-
Directed Mutagenesis.
Komponen protein Cas9 tersusun atas empat yakni terdiri dari dua protein utama
REC dan RuvC. REC dan RuvC yang dihubungkan oleh daerah kaya akan asam amino
arginine. Dua komponen berikutnya yakni HNH dan PAM (ProtosapecerAdjacent Motif)
yang merupakan urutan DNA yang terdiri atas 2-6 bp. Fungsi semasing-masing
komponen Cas9 yakni REC dan NHN berfungsi sebagai enzim endonuklease yaitu
memotong DNA), RuvC berfungsi sebagai area sisi pengenalan (recognition site)
sedangkan PAM berfungsi untuk menyisipi urutan DNA target, ketika Cas9 mengenali
DNA asing yang dijadikan target. PAM juga sebagai pengunci saat proses sistem
CRISPR/Cas9. Sistem CRISPR-Cas9 adalah dua komponen penting yang bekerjasama
untuk menghancurkan materi genetik asing. Secara alami terdapat 3 mekanisme utama
CRISPR-Cas9 yakni akuisisi DNA, pemrosesan crRNA, dan interferensi (Kartiko, dkk.
2017).
Tahapan akuisi DNA ditandai dengan proses masuknya DNA asing ke dalam sel,
maka dengan segera fragmen DNA asing tersebut akan ditagkap sebagai memori genetik
dan disimpan dalam DNA spacer. Ketika ada virus dengan fragmen DNA yang sudah
pernah direkam sebelumnya, langkah berikutnya Gen CRISPR akan melakukan
transkripsi menghasilkan CRISPR RNA (crRNA) sedangan gen Cas9 akan menghasilkan
protein Cas9. Kemudian tracrRA juga disintesis. crRNA dan tracrRNA akan bergabung.
Dan gabungan kedua RNA tersebut dinamakan guide RNA (gRNA) atau RNA Pemandu.
Selanjutnya RNA pemandu akan bergabung dengan Cas9 membentuk kompleks. RNA
Pemandu/Cas9 akan mengikat DNA asing dan memotongannya menjadi DNA inaktif.
RNA pemandu yang mengandung DNA target pada daerah spacer dialah yang nantinya
akan menentukkan titik DNA target yang akan dipotong dan diinaktifkan sedangkan
protein cas 9 berfungsi untuk memotong DNA target dalam hal ini adalah DNA virus.
8. Aplikasi CRISPR/Cas 9
Banyak para peneliti yang telah melakukan percobaan atau pengujian dengan
teknologi ini dengan melihat kemampuan pengeditan genom yang cepat dan presisi pada
CRISPR / Cas 9, menghasilkan produk mutasi genetic pada tanaman, buah yang bisa
dimanfaatkan, dan memiliki peluang besar dalam mengaaplikasikannya ke semua
organisme, termasuk hewan dan manusia. CRISPR/Cas 9 juga dapat digunakan untuk
pengobatan terapi gen dalam penyembuhan penyakit, seperti HIV, sel-sel kanker dan lain
sebagainya, baik penyakit genetik maupun non-genetik. Penelitian terdahulu yang
dilakukan oleh (Zhen, dkk. 2014 dan Kneddy, dkk. 2014 di dalam Damara, 2017) telah
menguji dengan melakukan delesi pada gen E6 dan E7 pada virus HPV16 secara terpisah
dengan menggunakan CRISPR/Cas9. Hasil penelitian tersebut menunjukkan tidak hanya
terhambatnya proses pertumbuhan sel kanker, namun ukuran sel kanker serviks juga
berkurang akibat peningkatan dari aktivitas apoptosis dari efek yang diberikan oleh p53
dan pRB yang tidak lagi dihambat oleh gen E6 dan E7. Pada penelitian tersebut
menyatakan bahwa CRISPR/Cas9 dapat dilakukan dengan bantuan vektor virus
Adenovirus (AAV) dan dilakukan dengan cara injeksi intravena dengan dosis yang sesuai
pada pasien. Akan tetapi dalam penerapannya seacra umum terapi gen pada manusia
perlu adanya pemastian bahwa pengobatan akan menyembuhkan orang tersebut dan tanpa
menyebabkan kondisi lain yang tidak diinginkan, namun para peneliti mencoba
melakukan metode-metode tertentu sehingga bahaya yang ditimbulkan bisa dihindari atau
diminimalkan. Teknologi CRISPR-Cas9 juga dapat digunakan untuk mengubah DNA di
inti sel reproduksi yang mengirimkan informasi dari satu generasi ke generasi berikutnya
(“germline” organisme). Dengan demikian, modifikasi genom dapat dilakukan pada telur
atau embrio hewan yang telah dibuahi, sehingga merubah susunan genetik dari setiap sel,
dan perubahan tersebut akan diteruskan ke keturunan organismnya, Akan tetapi
penggunaan CRISPR-Cas-pada germline manusia, perlu dipastikan keamanannya ,
beberapa pihak yang tidak setuju dalam memodifikasi germline manusia (sel telur dan
sperma), dengan alasan karena tidak akan bisa menjamin jika embrio mosaik yang
dibuat, germline-nya dapat membawa perubahan genetik atau tidak (Wijaya, dkk. 2017).
Dengan demikian perlu adanya pengujian klinis terhadap masalah ini, berhubung
teknologi ini memiliki peluang yang besar dalam memberikan manfaat bagi kehidupan
makhluk hidup,
Daftar Pustaka
Arumningtyas, Estri Laras. 2019. MUTASI: Prinsip Dasar dan Konsekuensi. Malang: UB Press.
Afidah, Siti Nurul. 2017. Identifikasi Sisi Aktif Rekombinan Sucrose Phospate Synthase
Menggunakan Metode Site-Directed Mutagenesis. Skripsi. Universitas Jember, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Bronzino, Joshep D. 2000. The Biomedical Engineering Handbook Second Edition Volume II.
USA: CLC Press LLC.
Chen, Minjiang, Aiwu Mao, dkk. (2019). CRISPR-Cas9 for Cancer Therapy: Opportunities and
Challenges. Cancer Letters. Vol.447 : 48-55
Damara, Fachreza. 2017. CRISPR/Cas9 Dengan Dual-Sgrnas Bertarget Gen E6 Dan E7 Virus
HPV 16 Sebagai Inovasi Terapi Gen Upaya Menurunkan Angka Kanker Serviks Global.
Jurnal Scientific Pinisi. Vol(3). 2 : 98-103.
Kartiko, dkk. 2017. Aplikasi Teknologi Crispr/Cas9 Dalam Anti-Aging Medicine. Vol. 1 (2) :
50-56.
Wijaya, dkk. 2017. Genome Editing With CRISPR-Cas9 Systems: Basic Research And Clinical
Applications. The Indonesian Biomedical Journal. Vol. 9(1) : 1-16.
Wikantika, Ketut. 2018. Bunga Rampai Forum Peneliti Muda 2018. Bandung: ITB Press.