DNA

Rekombinan
Presented by
Evi Fitriany
 Pendahuluan

• Teknologi DNA rekombinan berkembang pada tahun 1970-an

• DNA rekombinan memungkinkan bagi kita untuk:
1. Mengisolasi DNA dari berbagai organisme
2. Menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang
berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan
3. Memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme
prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat
bereplikasi dan dapat diekspresikan.
 Pendahuluan

• Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang

terdapat pada bakteri.
• Lederberg dan Tatum : bakteri mempunyai mekanisme seksual.
• Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat
melalui tiga cara yaitu:
1. Konjugasi
2. Transformasi
3. Transduksi.
Sejarah DNA rekombinan
• Pertama kali di usulkan oleh Peter Lobban, seorang mahasiswa pasca sarjana.
Eksploitasi teknologi DNA rekombinan di fasilitasi oleh isolasi, penemuan dan
penerapan endonuklease restriksi oleh Werner Arber, Daniel Nathans, dan
Hamilton Smith, yang mereka terima tahun 1978 dalam penghargaan nobel
dalam bidang kedokteran.
• Sebuah terobosan dalam penerapan teknologi DNA rekombinan terjadi pada
tahun 1977 ketika Herbert Boyer di produksi biosintetik manusia insulin di
laboratorium.
• Urutan gen tertentu atau polinukleotida yang mengkode produksi insulin pada
manusia diperkenalkan ke koloni sampel yang E.coli bakteri.
• Humulin merupakan obat yang pertama kali dibuat melalui teknologi DNA
rekombinan
Pengertian rekombinasi DNA (rDNA)
• Rekombinasi DNA ( rDNA ) adalah suatu upaya meletakkan DNA dari suatu
organisme kedalam DNA bakteri dengan menggabungkan dua atau lebih
sekuens yang biasanya tidak akan terjadi bersama-sama melalui
penyambungan gen.
• Secara modifikasi genetik, itu diciptakan melalui pengenalan yang relevan DNA
ke dalam DNA organisme yang ada seperti plasmid dan bakteri, untuk kode
atau mengubah ciri yang berbeda dengan tujuan tertentu, contohnya resistensi
antibiotik.
• Ini berbeda dari rekombinasi genetika dalam hal itu tidak terjadi melalui dalam
sel, tetapi di rekayasa.
• Protein rekombinan adalah suatu protein yang dihasilkan dari DNA
rekombinan.
 Proses rekombinasi DNA
1. Metode Transformasi DNA
• Merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri.
• Transformasi pertama kali dikembangkan untuk memindahkan sifat-sifat genetika,
DNA adalah bahan genetika.
• metode ini sekarang secara luas dipakai untuk mentransfer plasmid-plasmid kecil dari
satu galur bakteri ke galur lainnya.
• Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian
dicampur dengan sel resipien yang telah dibuat rentan terhadap masuknya molekul
DNA melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel. Bila molekul DNA yang
masuk berupa plasmid, maka replikasi plasmid dapat dimungkinkan dengan genom
inang yang baru selama transformasi.
• Butuh 3 elemen kunci dari metode transformasi:
1. Inang yang bersifat stabil
2. Membutuhkan vector untuk mereplikasikan sendiri
3. Membutuhkan seleksi dari sel inang yang bisa di insersikan/ disisipkan dengan gen
Proses rekombinasi DNA
2. Metode transduksi DNA
Merupakan suatu proses tranfeksi gen dengan menyisipkan fage (turunan dari bakterio
fag lamda yang terdapat didalam virus) atau hampir sama dengan proses transformasi
3. Metode konjugasi DNA
• Merupakan suatu metode untuk menyatukan gen asing kedalam DNA inang atau
Bacterial Artificial Cromosom (BAC).
• Dasar dari plasmid konjugasi adalah:
1. Merupakan bagian yang kecil dari episomal bacterial DNA yang memberikan suatu
bakteri untuk mampu mengawali proses penyatuan dengan bakteri target.
2. Batas kloning-nya = 75 – 300 kb.
Pengertian teknologi DNA rekombinan
dan manfaatnya
• Teknologi DNA rekombinan, atau rekayasa genetika
melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu
sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan
sebagai kloning gen.
• Teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi
materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul
DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya
untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam
suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.
Manfaat teknologi DNA rekombinan

1. Dengan mengisolasi dan mempelajari masing masing gen

dapat memperoleh pengetahuan tentang fungsi dan
mekanisme kontrolnya.
2. Memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam
waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi
secara konvensional.
 Tahapan DNA rekombinan
• Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang
akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen
dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA
ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan,
transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi
molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.
• Teknologi DNA rekombinan telah mungkinkan bagi kita untuk:
mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang
berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk DNA
rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme
prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat berepilkasi
dan bahkan dapat diekspresikan.
• Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda
yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung
reaksi.
Teknik Teknik pada DNA rekombinan
• Teknik-teknik tersebut meliputi:
1. Teknik untuk mengisolasi DNA
2. Teknik untuk memotong DNA
3. Teknik untuk menggabung atu menyambung DNA
4. Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup
• Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah
perangkat-perangkat yang ada pada bakteri.
• Perangkat tersebut antara lain : enzim restriksi, enzim DNA ligase,
plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak
DNA/RNA.
• Vektor,berupa plasmid bakteri atau viral ADN virus
• Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui perbanyakan bakteri.
Enzim terdiri dari
• enzim RESTRIKSI (pemotong plasmid/ADN)
• enzim Ligase (penyambung ptongan-potongan ADN)
Tahapan rekomendasi DNA

• Langkah – langkah pembuatan DNA rekombinan menurut

Moeljopawiro adalah sebagai berikut:
1. Isolasi sumber DNA
2. Pemotongan gen
3. Penggabungan gen
4. Penyisipan gen kedalam bakteri
5. Memasukkan DNA rekombinan ke sel target
Isolasi DNA
• Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari
campuran fragmen-fragmen DNA pengotornya.
• Hal ini penting dalam rekayasa genetik karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak
dalam mendeteksi gen DNA lain dan dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya.
• Fragmen DNA yang tidak tercampur dengan fragmen DNA lainnya diperoleh melalui beberapa
tahap.
1. Pemisahan fragmen yang ingin diisolasi dari fragmen lainnya dengan pemotongan
menggunakan enzim restriksi atau hasil PCR, yang dilanjutkan dengan elektroforesis
menggunakan gel agarose.
2. Mendeteksi fragmen yang akan diisolasi dan memotong gel agarose yang mengandung
fragment tersebut.
3. Mengisolasi fragmen DNA dari gel agarose dengan cara melewatkannya pada membran
Hybon N netral dan memberi larutan buffer elusi yang berisi Tris buffer dan Sodium Dodesil
Sulfat.
 Pemotongan gen
• Restriksi plasmid merupakan proses pemotongan fragmen DNA pada tempat tertentu sesuai
yang diinginkan dengan menggunakan enzim restriksi.
• Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa adanya dua jenis enzim,
yaitu: enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai “gunting” untuk memotong DNA
pada situs spesifik.
• Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempat-tempat tertentu
dari urutan basa tersebut. Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus
ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari
deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya.
• Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end).
• Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama,
bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan.
• Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak
sama sehingga salah satu utas (5’ atau 3’) menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran
single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa pasangannya
sehingga disebut “sticky” (mudah lengket) atau kohesif.
 Penggabungan gen
• Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan fragmen DNA
lainnya.
• Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector pengklonan.
• Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector untuk bakteri adalah plasmid,
phage dan cosmid, serta beberapa vector lain yang digunakan untuk organisme selain
bakteri, yaitu Yeast Artificial Chromosomes (YAC), Bacterial Artificial Chromosomes
(BAC), Plant Cloning Vectors dan Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005).
• Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase.
• Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan disambungkan berkomplemen. Kecocokan
yang sangat spesifik dibutuhkan bila fragmen DNA yang akan disambungkan
mempunyai ujung tidak rata (sticky end), karena penyambungannya harus mengikuti
kaidah Chargaff, yaitu T berpasangan dengan A dan G berpasangan dengan C.
Sedangkan fragmen DNA yang mempunyai ujung rata (blunt end) dapat
disambungkan dengan sembarang fragmen DNA lain yang berujung rata.
• Oleh karena itu untuk mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik menggunakan ujung
tidak rata sedangkan pengklonan DNA yang tidak memerlukan spesifikasi tertentu
menggunakan ujung rata (Suharsono, 2000).
Proses rekombinasi DNA dari pemotongan hingga penggabungan
 Penyisipan gen kedalam bakteri
• Penyisipan gen dapat dilakukan melalui 3 cara yaitu:
1. Konjugasi : perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam
sel bakteri lainnya(sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel
2. Transformasi : pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di
sekelilingnya.
3. Transduksi : cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel
lainnya melalui
perantara phage.
• DNA yang masuk ke dalam bakteri dapat berintegrasi dengan
DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan
atau kromosom rekombinan
Memasukkan DNA rekombiann ke sel
target
• Memasukkan DNA Rekombinan ke Sel Target / Sel Hidup dapat
dilakukan dengan tiga cara yaitu:
1. Transformasi : pengambilan DNA rekombinan dari lingkungan di
sekelilingnya.
2. DNA-packaging : memasukkan molekul DNA-phage ke dalam
partikel phage.
3. Mikroinjection : memakai jarum super kecil untuk
menginjekasikan DNA rekombinan langsung ke inti sel yang
ditransformasi.
Proses memasukkan DNA rekombinan ke sel
target
 Aplikasi dan Manfaat DNA rekombinan

1. Bidang Kesehatan
a. Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri
E.coli dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetes.
b . Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis.
Telah diproduksi secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala
industry
c. Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan
digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan
d . Therapi gen untuk penyakit dilakukan dengan menggantikan gen yang
mengalami kerusakan dengan gen yang normal, digunakan untuk
mengobati penyakit- penyakit keturunan (genetic disorders) dan penyakit
lain yang disebabkan oleh kerusakan gen (misal: kanker)
Aplikasi dan manfaat DNA rekombinan
2. Bidang Pertanian
a. Bakteri Ice- (ice minus): bakteri yang telah direkayasa sehingga tidak membeku
pada suhu rendah. Digunakan (disemprotkan) pada tanaman agar tanaman tidak
membeku di musim dingin.
b. mikroba pendegradasi limbah.
c. Tanaman tahan hama, misal kapas Bt, tomat Bt
d. Tanaman tahan herbisida.
3. Bidang Kelautan :
penggunaan hormon pertumbuhan untuk meningkatkan ukuran ikan
4. Bidang Hukum
• a. Pelaku kejahatan dapat diidentifikasi dengan menggunakan analisis Sidik Jari
DNA misalnya: kasus perkosaan
• b. Untuk menentukan keturunan dan keluarga berdasarkan DNA fingerprint.
Aplikasi dan manfaat DNA rekombinan

5. Bidang Ilmu Pengetahuan

a. Membantu upaya memahami terjadinya kelainan pada
manusia (penyakit genetik) misalnya kanker payudara
b. Kemajuan Teknologi DNA telah mendorong para ilmuwan
(konsorsium ilmuwan internasional) untuk mewujudkan proyek
genom manusia dan genom organisme lainnya.
Terimakasih