9

Manipulasi Genetik

Gen telah dimanipulasi oleh manusia untuk waktu yang sangat lama, yaitu, jika
perkembangbiakan selektif, yang telah dipraktikkan selama berabad-abad di bidang pertanian dan
di tempat lain untuk mengembangkan karakteristik yang diinginkan pada hewan dan tumbuhan
peliharaan, harus dianggap sebagai manipulasi, sebagaimana mestinya. . Bahkan sejak masa
awal Gregor Mendel, biarawan Moravia dan pelopor analisis genetika, tanaman dibiakkan untuk
menghasilkan sifat-sifat yang menarik, berguna, dan terkadang tidak biasa. Banyak dari ini
sekarang hilang dari pemulia tanaman klasik karena perbedaan strain yang mengarah ke hibrida
tidak subur. Salah satu kesenangan dari rekayasa genetika (GE) adalah bahwa dalam beberapa
kasus, gen purba dapat diselamatkan dari benih yang ditemukan dalam penggalian arkeologi,
misalnya dan diperkenalkan kembali melalui transfer ke strain modern. dkk., 2010) dan dapat
menjelaskan tingkat evolusi yang diamati. Pada bakteri, kandidat yang paling mungkin untuk
transfer genetik adalah plasmid dan bakteriofag, dan karena eukariota kekurangan plasmid,
vektor yang paling masuk akal adalah virus eukariotik. Ini, tentu saja, selain transfer DNA selama
reproduksi seksual. Pengetahuan yang ada akan menunjukkan bahwa pertukaran yang
melibatkan vektor membutuhkan kesesuaian antara organisme yang menyumbangkan materi
genetik, vektor yang terlibat, dan organisme penerima. Misalnya, dua bakteri harus dapat kawin
agar transfer plasmid berlangsung, atau jika virus dilibatkan sebagai vektor, ia harus dapat
menginfeksi sel atau organisme donor dan penerima. Namun, ada bukti yang menunjukkan
bahwa pandangan ini agak naif dan ada lebih banyak peluang untuk pertukaran genetik antara
semua sel, prokariotik dan eukariotik, daripada yang dikenal. Ide ini, yang dikemukakan oleh
Reanney (1976) dikembangkan dalam Bab 3.

Bakteri terkenal karena kemampuannya untuk mentransfer gen antara satu sama lain saat
dibutuhkan berkat lokasi di plasmid dari sebagian besar kelompok gen, atau operon, yang terlibat
dalam pemecahan molekul organik. Bukti kuat untuk 'genomic pools' yang sangat luas ini berasal
dari analisis sedimen laut (Cook dkk., 2001). Di sepanjang buku ini, telah dikemukakan bahwa
mikroorganisme yang terlibat dalam remediasi melakukannya dalam keadaan 'alami' mereka
terutama karena mereka asli di lokasi kontaminasi dan telah mengembangkan kemampuan yang
sesuai tanpa campur tangan eksternal. Namun, terkadang setelahnya

Bioteknologi Lingkungan: Teori dan Aplikasi, Edisi Kedua Gareth M.Evans dan Judith C. Furlong © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. ISBN:
978-0-470-68418-4
214 Bioteknologi Lingkungan

kontaminasi mendadak seperti tumpahan, mikroba tidak mampu mengumpulkan mutasi yang berguna pada DNA mereka
dengan cukup cepat untuk mengembangkan jalur yang sesuai untuk meningkatkan kesesuaian mereka untuk lingkungan yang
berubah, dan karenanya mereka dapat 'dilatih' oleh ekspansi yang secara artifisial dipercepat dari pra- jalur yang ada. Pilihan
terakhir adalah mereka mungkin direkayasa secara genetik. Organisme yang mewakili 'norma', seringkali merupakan anggota
yang paling melimpah di alam, disebut sebagai 'tipe liar'. Mereka dengan DNA yang berbeda dari ini disebut sebagai mutan.
Perubahan dapat terjadi melalui proses normal evolusi yang terus-menerus menghasilkan mutan, suatu proses yang dapat
dipercepat secara artifisial, atau dengan rekonstruksi genom yang disengaja, seringkali dengan pengenalan novel gen ke
organisme tersebut. Rute terakhir ini adalah basis GE yang memiliki beberapa keunggulan dibandingkan teknik pemuliaan
atau seleksi tradisional. Prosesnya spesifik, di mana satu gen itu, atau sekelompok gen yang dipilih, ditransfer dan mutasinya
cukup tepat. Ada eksibilitas dalam sistem di mana, tergantung pada modifikasi yang dilakukan pada genom, produk baru
dapat diproduksi atau tingkat ekspresi produk atau produk yang ada dapat diubah dalam kuantitas atau proporsinya satu sama
lain. Seluruh subjek proteomik ini adalah disiplin ilmu tersendiri di mana volume diterbitkan. Keuntungan lain yang sering
dikutip adalah GE memungkinkan gen ditransfer antara organisme yang sama sekali tidak terkait. Pembahasan sebelumnya
menunjukkan bahwa ini bukanlah fenomena yang unik bagi GE, tetapi paling tidak didefinisikan dan spesifik. Prosesnya
spesifik, di mana satu gen itu, atau sekelompok gen yang dipilih, ditransfer dan mutasinya cukup tepat. Ada eksibilitas dalam
sistem di mana, tergantung pada modifikasi yang dilakukan pada genom, produk baru dapat diproduksi atau tingkat ekspresi
produk atau produk yang ada dapat diubah dalam kuantitas atau proporsinya satu sama lain. Seluruh subjek proteomik ini
adalah disiplin ilmu tersendiri di mana volume diterbitkan. Keuntungan lain yang sering dikutip adalah GE memungkinkan gen
ditransfer antara organisme yang sama sekali tidak terkait. Pembahasan sebelumnya menunjukkan bahwa ini bukanlah
fenomena yang unik bagi GE, tetapi paling tidak didefinisikan dan spesifik. Prosesnya spesifik, di mana satu gen itu, atau
sekelompok gen yang dipilih, ditransfer dan mutasinya cukup tepat. Ada eksibilitas dalam sistem di mana, tergantung pada modifikasi yang dilakukan pada genom

Pelatihan: Manipulasi Bakteri Tanpa Rekayasa Genetik

Prosedur umum adalah mengambil sampel bakteri dari, pada, atau dekat, tempat kontaminasi dari mana kultur murni
diperoleh di laboratorium dan diidentifikasi, menggunakan teknik mikrobiologi standar. 'Pelatihan' mungkin diperlukan baik
untuk meningkatkan toleransi bakteri terhadap polutan atau untuk meningkatkan kemampuan jalur yang sudah ada dalam
bakteri untuk memasukkan kemampuan mendegradasi polutan, atau kombinasi keduanya. Toleransi dapat ditingkatkan
dengan membudidayakan dalam media pertumbuhan yang mengandung konsentrasi polutan yang semakin meningkat
sehingga, selama beberapa generasi, mikroba menjadi lebih mampu menahan efek racun dari kontaminan. Reintroduksi
bakteri ini ke situs yang tercemar harus memberi mereka keuntungan dibandingkan bakteri asli karena mereka akan lebih
cocok untuk bertahan hidup dan memulihkan kontaminasi. Meningkatkan kemampuan mikroba untuk mendegradasi
kontaminan, kadang-kadang disebut sebagai ekspansi katabolik, dapat ditingkatkan dengan membudidayakan bakteri dalam
media pertumbuhan di mana kontaminan memasok bagian penting dari nutrisi, seperti menjadi satu-satunya sumber karbon.
Hanya bakteri yang telah mengalami mutasi yang memungkinkan mereka untuk memanfaatkan sumber makanan ini yang
akan dapat bertahan sehingga metode ini secara efektif memilih mikroba yang diinginkan; segala sesuatu yang lain telah mati.
Telah diperdebatkan bahwa dalam kondisi laboratorium di mana kultur bakteri diisolasi satu sama lain untuk mencegah
kontaminasi silang, mutasi paling banyak terjadi. Meningkatkan kemampuan mikroba untuk mendegradasi kontaminan,
kadang-kadang disebut sebagai ekspansi katabolik, dapat ditingkatkan dengan membudidayakan bakteri dalam media
pertumbuhan di mana kontaminan memasok bagian penting dari nutrisi, seperti menjadi satu-satunya sumber karbon. Hanya
bakteri yang telah mengalami mutasi yang memungkinkan mereka untuk memanfaatkan sumber makanan ini yang akan
dapat bertahan sehingga metode ini secara efektif memilih mikroba yang diinginkan; segala sesuatu yang lain telah mati.
Telah diperdebatkan bahwa dalam kondisi laboratorium di mana kultur bakteri diisolasi satu sama lain untuk mencegah kontaminasi silang, mutasi paling banyak
 Manipulasi Genetik 215

kemungkinan terjadi sebagai akibat dari kesalahan dalam replikasi DNA. Ini jauh lebih kecil
kemungkinannya untuk menjadi sumber mutasi yang paling menonjol di alam, karena mikroba
terus-menerus berada di dekat organisme lain dan, akibatnya, peluang untuk pertukaran
materi genetik sangat besar. Nyatanya, proses replikasi DNA memiliki tingkat kejelasan yang
sangat tinggi, alasannya jelas. Tingkat kesalahan yang meningkat dapat dipaksakan pada
organisme, mempercepat laju mutasi, dengan memasukkan mutagen dalam media
pertumbuhan. Mutagen adalah bahan kimia yang meningkatkan tingkat kesalahan dalam
replikasi DNA, seringkali dengan menyebabkan kerusakan yang sangat terbatas pada DNA
sehingga DNA polimerase, enzim yang bertanggung jawab untuk sintesis DNA, tidak dapat
menentukan basa yang benar untuk ditambahkan ke dalamnya. rantai nukleotida yang
tumbuh.

Manipulasi Bakteri dengan Rekayasa Genetika

Manipulasi genetik dengan pengenalan sengaja dari gen yang didefinisikan ke dalam organisme tertentu
adalah teknik yang sangat kuat dan mapan dalam perkembangan konstan, terkadang dengan tingkat
kemajuan yang fenomenal. Teknik tersebut telah menghasilkan beberapa hibrida yang menarik di semua
bidang penelitian, baik mikroskopis; bakteri dan jamur, biasanya digambarkan sebagai rekombinan, dan
makroskopik; terutama tumbuhan dan hewan tingkat tinggi, biasanya digambarkan sebagai transgenik.
Istilah terakhir mengacu pada prinsip pemindahan gen yang disengaja dari satu organisme ke organisme
lain yang biasanya bukan penduduknya. Ini membuat gen yang masuk diberi gelar 'asing'. Beberapa contoh
yang relevan dengan bioteknologi lingkungan akan dibahas nanti dalam bab ini.

Beberapa pengembangan memiliki potensi minat yang besar dan mewakili beberapa karya yang menarik
dan inovatif. Namun, harus dikatakan bahwa, dalam praktiknya, sebagian kecil dari semua usaha atas nama
bioteknologi lingkungan memiliki, atau kemungkinan besar akan memiliki, ketergantungan langsung untuk
efektivitasnya pada jenis rekombinan dan transgenik yang saat ini sedang berlangsung. dikembangkan. Ini
bukan karena keterbatasan GE, yang pada prinsipnya hampir tidak terbatas, dengan sumber daya yang
mencukupi, tetapi karena biaya. Ini adalah faktor utama karena teknologi dan penelitian untuk menghasilkan
organisme transgenik menarik harga yang sangat tinggi. Sementara situasi seperti itu mungkin berkelanjutan
oleh perusahaan farmasi dan mungkin pada tingkat yang lebih rendah, perusahaan agribioteknologi mungkin
dapat memperoleh laba atas penjualan produk yang tinggi, itu jarang berkelanjutan dalam penerapan teknologi
lingkungan. Beberapa organisasi komersial bersemangat dengan prospek menghabiskan sebagian besar
pendapatan mereka untuk pembuangan limbah, misalnya dan biasanya hanya akan melakukannya jika
benar-benar diperlukan.

Ada faktor lain yang mempengaruhi kesesuaian organisme transgenik dalam ilmu ini karena
persyaratan penahanan saat ini. Selain itu, cara rekombinan tersebut digunakan dapat
menyebabkan masalah tersendiri. Misalnya, rekombinan adalah mikroorganisme yang
terstruktur untuk meningkatkan laju
216 Bioteknologi Lingkungan

degradasi polutan, kinerjanya mungkin patut dicontoh dalam kondisi laboratorium tetapi bila
diterapkan dalam bio augmentasi, hal itu bersaing dengan spesies asli yang dapat melampaui
rekombinan. Bakteri baru juga dapat kehilangan kemampuan barunya yang direkayasa dengan
hati-hati melalui transfer gen yang normal mengingat tingginya tingkat pergaulan antar bakteri.
Lingkungan yang sangat terkontrol dan terkendali seperti bioreaktor dapat menghindari beberapa
keberatan ini, tetapi tidak selalu praktis untuk memindahkan kontaminasi ke solusi daripada solusi
ke kontaminasi. Sekali lagi ini melibatkan pertimbangan biaya dan praktis, paling tidak adalah
masalah keamanan yang terkait dengan pengangkutan bahan yang terkontaminasi.

Pada kenyataannya, jarang ada kebutuhan untuk menggunakan rekombinan atau transgenik dan
kemungkinan besar kemampuan metabolisme yang dibutuhkan akan disediakan oleh organisme asli,
atau organisme yang telah dilatih untuk tugas tersebut. Namun, ada beberapa penerapan yang eksotis
dan cerdik, dan sebagai ilustrasi, beberapa contoh diberikan di sini. Tujuannya adalah untuk memberikan
gambaran umum dari beberapa teknologi yang lebih sering digunakan bersama dengan contoh-contoh
spesifik. Ada sangat banyak buku teks yang sangat baik dan publikasi khusus yang harus dirujuk jika
diperlukan pengetahuan yang lebih rinci dan bekerja. Namun, gambaran prinsip GE diberikan di sini
untuk kepentingan mereka yang tidak terbiasa dengan teknologi tersebut.

Prinsip Dasar Rekayasa Genetika

Ada banyak permutasi dari prosedur kloning dasar tetapi semuanya memiliki beberapa persyaratan
mendasar. Ini adalah: enzim, larutan dan peralatan yang diperlukan untuk menjalankan prosedur;
potongan DNA yang diinginkan untuk ditransfer; vektor kloning; dan sel penerima yang mungkin
merupakan organisme utuh. Agar proses memiliki nilai yang dapat diukur, penting juga untuk
memiliki beberapa cara untuk menentukan apakah transfer telah berhasil atau tidak. Ini dicapai
dengan penggunaan gen penanda. Persyaratan yang dirujuk di atas dijelaskan di bagian berikut.

Enzim, larutan dan peralatan

Ada banyak langkah dalam isolasi DNA yang sekarang telah menjadi teknik laboratorium standar.
Setelah DNA diisolasi dari suatu organisme, DNA dimurnikan dari bahan yang mengkontaminasi
seperti protein dan diendapkan dari larutan air dengan penambahan alkohol, misalnya etanol,
hingga sekitar 70%. DNA muncul sebagai bahan putih semi transparan, melingkar keluar dari
larutan pada penambahan alkohol. Ini dapat dikumpulkan dengan sentrifugasi dan dikeringkan
siap untuk tahap berikutnya yang biasanya pencernaan enzim. Tujuan dari tahap selanjutnya
adalah untuk memasukkan DNA ke dalam vektor, dimana ujung DNA dan vektor harus disiapkan.
Hal ini dapat dilakukan dengan restriksi endonuklease yang mengenali urutan spesifik dalam DNA
dan memotongnya
 Manipulasi Genetik 217

Gambar 9.1 Enzim restriksi

situs itu, baik menghasilkan flush atau ujung terhuyung-huyung, Gambar 9.1, atau dengan inkubasi selama
periode waktu yang sangat terbatas dengan eksonuklease yang mencerna ujung DNA dan diikuti oleh
pencernaan lebih lanjut dengan nuklease lain yang merapikan ujungnya untuk menghasilkan fl ush ujung .
Ada nuklease restriksi lain yang mengenali sebuah situs dalam DNA tetapi dipotong agak jauh darinya, tetapi
ini jarang berguna dalam prosedur kloning.

Persiapan vektor ditentukan oleh jenis ujung yang disiapkan untuk DNA sisipan; fl ush atau
'lengket'. Jika fl ush, tidak masalah bagaimana itu dicapai selama vektor menerimanya juga fl
ush, tetapi jika lengket, ujung lengket yang sesuai harus disiapkan pada vektor dengan
endonuklease pembatasan yang sesuai. Ada banyak metode preparasi DNA dan vektor, yang
semuanya memiliki kelebihan dan kekurangan dan, meskipun menarik, berada di luar cakupan
buku ini.

Setelah menyiapkan ujung-ujungnya, langkah selanjutnya adalah merekatkan potongan-potongan itu.

Sisipan yang telah disiapkan, atau DNA 'asing' diinkubasi dengan vektor yang telah disiapkan dalam larutan
berair yang mengandung berbagai garam yang dibutuhkan oleh enzim, dan ligase yang merupakan enzim
yang fungsinya untuk membuat ikatan antara fosfat bebas pada basa nukleotida dan gula ribosa yang
berdekatan dengan demikian 'memperbaiki' DNA untuk membuat rantai yang lengkap secara kovalen.
Molekul DNA rekombinan ini dapat ditransfer ke dalam sel di mana ia mengalami replikasi dengan cara biasa.
Jika DNA bukan virus, pengenalan akan melalui masuk langsung melalui membran sel dicapai dengan salah
satu dari sejumlah teknik standar semuanya.
218 Bioteknologi Lingkungan

berdasarkan pembuatan membran permeabel ke molekul DNA. Namun, jika DNA 'asing' adalah bagian dari
virus rekombinan, ia harus dikemas menjadi partikel, dan kemudian ditransfer ke dalam sel melalui infeksi.
Pemeriksaan dapat dilakukan pada produk dengan melakukan analisis yang dijelaskan kemudian.

DNA untuk transfer

Paling umum, ini adalah potongan DNA beruntai ganda yang berisi urutan pengkodean untuk
suatu gen. Ini mungkin diperoleh dari sejumlah sumber, misalnya DNA genom, perpustakaan
DNA pelengkap (cDNA), produk dari polymerase chain reaction (PCR) atau sepotong DNA yang
diproduksi secara kimiawi pada mesin penyintesis DNA. Sumber lain adalah dari salinan DNA
virus RNA seperti dalam bentuk replikasi virus RNA.

Perpustakaan genomik

DNA genom dalam konteks ini adalah bahan yang diisolasi langsung dari suatu organisme, dimurnikan
dan dipotong-potong dengan ukuran yang sesuai untuk dimasukkan ke dalam vektor kloning. Potongan
ini dapat diikat sebagai campuran total, menjadi vektor yang sesuai untuk menghasilkan perpustakaan
genom, atau bagian tertentu dapat diisolasi dan disiapkan seperti dijelaskan di atas. Perpustakaan genom
sangat berguna, karena dapat diamplifikasi, dan diakses hampir tanpa batas, untuk mencari urutan DNA
tertentu sehingga mengurangi jumlah pekerjaan yang terlibat dalam satu percobaan. Kerugiannya adalah
bahwa jika perpustakaan genom berasal dari eukariotik, yang hampir secara eksklusif terjadi, gen akan
mengandung daerah, atau intron, yang biasanya dimasukkan sepanjang panjangnya dan diproses dari
salinan RNA selama pematangan sebelum sintesis protein. Ini menjadi masalah jika gen akan
diekspresikan, dengan kata lain, jika protein akan dibuat dari cetak biru DNA. Prokariotik tidak
mengandung intron dalam gennya sehingga tidak memiliki mekanisme untuk menghilangkannya. Lebih
jauh, intron tidak selalu diproses dengan benar bahkan jika sistem ekspresinya eukariotik. Masalah ini
dapat dihindari dengan menggunakan cDNA sebagai pengganti perpustakaan genom.

perpustakaan cDNA

Pada eukariota, produk pertama transkripsi dari DNA bukanlah messenger RNA (mRNA) tetapi RNA inti
heterogen (hnRNA). Ini adalah mRNA sebelum penghapusan semua bagian non-coding, atau intron,
yang dibuang selama pemrosesan untuk menghasilkan mRNA yang matang. cDNA adalah DNA yang
dibuat secara artifisial dengan menggunakan mRNA yang sudah matang sebagai template, yang
kemudian digunakan sebagai template untai kedua. Jadi produk DNA sintetis hanyalah versi DNA dari
mRNA dan dengan demikian harus mengatasi masalah ekspresi yang diuraikan di atas.
 Manipulasi Genetik 219

Reaksi berantai polimerase

PCR adalah teknik ampuh yang memperkuat sepotong DNA yang hanya tersedia sedikit salinannya.
Potongan tersebut harus dibingkai oleh DNA yang urutannya diketahui atau setidaknya dapat ditebak
dengan perkiraan yang mendekati. Hal ini memungkinkan sekuens pendek DNA disintesis dari hanya
beberapa nukleotida yang panjang, untuk mengikat secara spesifik ke akhir sekuens dan bertindak
sebagai primer bagi DNA polimerase untuk membuat satu salinan dari seluruh bagian DNA. Probe
kedua digunakan untuk ujung yang lain untuk memungkinkan untai kedua disintesis. Proses ini
diulangi dengan siklus konstan denaturasi DNA untai ganda pada suhu tinggi hingga sekitar 95 ◦ C,
diikuti dengan pendinginan hingga kurang lebih 60 ◦ C untuk memungkinkan anil probe dan sintesis
untai komplementer. Teknik ini membutuhkan penggunaan DNA polimerase yang mampu menahan
perlakuan tersebut. Dua bakteri dari mana polimerase telah diisolasi untuk tujuan ini adalah Thermococcus
litoralis dan Thermus aquaticus. Ekstremofil terakhir ini telah dibahas dalam Bab 3.

Kloning vektor

Vektor kloning sering kali berupa plasmid atau bakteriofag (virus bakteri) yang harus berukuran cukup
kecil dan sekuens penuh, mampu menggandakan dirinya sendiri saat dimasukkan kembali ke dalam
sel inang, sehingga menghasilkan DNA rekombinan dalam jumlah besar untuk manipulasi lebih lanjut.
Juga harus membawa gen 'penanda pemilih'. Ini berbeda dari gen reporter yang dijelaskan di bawah
ini yang merupakan indikator integritas dan aktivitas genom. Desain umum dari vektor kloning adalah
vektor yang membawa dua gen yang mengkode resistensi antibiotik. Gen 'asing' dimasukkan ke
dalam salah satu gen sehingga tidak lagi berfungsi sehingga dimungkinkan untuk membedakan
dengan teknik mikrobiologi standar, bakteri mana yang membawa plasmid yang mengandung DNA
rekombinan dan mana yang tidak. Gen selektor dapat beroperasi setidaknya pada dua tingkat, Escherichia
coli , di mana manipulasi dilakukan seperti yang dijelaskan di atas dan yang kedua pada tingkat
produk akhir, misalnya pabrik yang lebih tinggi. Dalam hal ini, gen pemilih seperti itu dapat menjadi
salah satu yang memberikan resistensi terhadap antibiotik seperti kanamisin atau higromisin.

Vektor kloning standar biasanya hanya membawa gen penanda pemilih yang diperlukan untuk
konstruksi plasmid. Untuk mempermudah manipulasi, gen ini biasanya mengandung multi cloning site
(MCS) yang merupakan sekumpulan situs untuk enzim restriksi yang dibangun sedemikian rupa untuk
mempertahankan fungsi gen tersebut. Gangguan dengan kloning ke salah satu situs ini akan kehilangan
fungsi gen tersebut dan karenanya, misalnya jika kode untuk resistensi antibiotik, tidak akan lagi
melindungi bakteri dari antibiotik tersebut. Contohnya ditunjukkan pada Gambar 9.2. Ini pGEM ® ( Promega,
1996) yang memiliki MCS di β- gal gen. Kode ini untuk

β- galaktosidase dari E. coli lac operon, yang memiliki kapasitas untuk menghidrolisis
220 Bioteknologi Lingkungan

contoh- pGEM ®- T

Gambar 9.2 Kloning vektor

x-gal, cairan tak bewarna, untuk menghasilkan galaktosa bebas dan 'x' yang menghasilkan pigmen biru ke
koloni. Jadi pemeriksaan untuk penyisipan yang berhasil ke dalam MCS adalah penilaian sederhana dari
koloni biru (negatif) atau putih (mungkin positif). Keberhasilan percobaan dapat ditentukan dengan cepat
karena vektor kloning ini juga memiliki urutan di kedua sisi MCS yang memungkinkan pengurutan DNA
dengan cepat. Selain itu, beberapa virus eukariotik dapat digunakan sebagai vektor tetapi ini cenderung
sangat besar sehingga sulit untuk melakukan kloning langsung ke dalamnya. Solusi untuk ini adalah
dengan melakukan manipulasi pada fragmen DNA yang diinginkan yang diklon ke dalam plasmid bakteri
dan kemudian mentransfer potongan yang direkayasa ke dalam virus sehingga membuat virus eukariotik
rekombinan. Salah satu virus tersebut sekarang digunakan secara luas di GE, baik sebagai kendaraan
kloning dan sebagai vektor ekspresi yang sangat baik,
 Manipulasi Genetik 221

Gambar 9.3 Baculovirus rekombinan

Vektor ekspresi

Ini mirip dengan vektor yang dijelaskan di atas tetapi sebagai tambahan memiliki sinyal yang diperlukan
yang terletak sebelum dan sesudah gen 'asing' yang mengarahkan sel inang untuk menerjemahkan produk
transkripsi menjadi protein. Kadang-kadang merupakan prosedur yang sulit, mahal atau memakan waktu
untuk menganalisis produk dari gen 'asing' dan oleh karena itu, selain gen pemilih yang dijelaskan di atas,
sering kali ada gen pelapor untuk menunjukkan apakah sinyal 'diaktifkan' atau tidak memungkinkan DNA
'asing' diekspresikan. Ada banyak alasan yang sulit untuk diprediksi, mengapa gen yang dibangun dengan
sempurna pun mungkin tidak berfungsi, seperti konsekuensi dari tempat tepatnya penyisipan dalam genom;
karena itu diperlukan kontrol yang terintegrasi.

Gen reporter

Ada banyak gen yang umum digunakan dan ini biasanya merupakan kode untuk enzim. Yang paling umum
adalah β- galaktosidase, disebutkan di atas. Enzim ini, yang disuplai dengan reagen yang sesuai, juga dapat
mengkatalisasi perubahan warna melalui aktivitasnya pada berbagai senyawa kimia yang ditandai oleh
orthonitrophenolgalactoside (ONPG)
222 Bioteknologi Lingkungan

yang berubah dari tidak berwarna menjadi kuning pada hidrolisis dengan cara yang hampir sama seperti
penapisan biru / putih yang dijelaskan di atas untuk vektor kloning, pGEM ®. Gen reporter lainnya
menghasilkan enzim yang dapat menyebabkan emisi cahaya seperti luciferase diisolasi dari api, atau yang
aktivitasnya mudah dan cepat diuji seperti bakteri β- glukuronidase (GUS) yang mungkin merupakan gen
reporter yang paling sering digunakan pada tanaman transgenik. Gen pelapor hanya dapat menjadi panduan
untuk proses transkripsi dan terjemahan yang terjadi di dalam sel dan telah diakui selama beberapa waktu
bahwa kehati-hatian harus dilakukan untuk menghindari kesalahan interpretasi data (Pessi, Blumer dan Haas,
2002).

Seperti halnya gen pemilih, gen pelapor tidak memiliki tujuan yang berguna setelah prosedur
kloning berhasil diselesaikan untuk menghasilkan produk jadi. Pada masa-masa awal teknologi ini,
gen-gen ini biasanya akan ditinggalkan in situ untuk menghindari kerja ekstra untuk menghilangkannya
yang mungkin juga mengganggu struktur genom rekombinan sehingga menurunkan kualitas
organisme yang direkayasa dengan cermat. Namun demikian, terdapat argumen untuk menghapus
semua gen yang diperlukan untuk tujuan konstruksi tetapi tidak lagi melayani tujuan yang berguna,
untuk mengurangi potensi risiko yang tanpa disadari meningkatkan penyebaran gen ke seluruh
lingkungan. Kekhawatiran ini dibahas di Bab 10.

Analisis Rekombinan

Desain plasmid sedemikian rupa sehingga penyisipan DNA 'asing' memungkinkan

dilakukannya uji warna, atau menyebabkan perubahan sensitivitas antibiotik, baik terhadap
resistansi (seleksi positif) atau sensitivitas (seleksi negatif). Ini merupakan langkah pertama
dalam penyaringan. Tahap kedua biasanya untuk menyelidiki gen yang diinginkan
menggunakan molekul yang akan mengenalinya dan yang ditempelkan semacam tanda,
biasanya radioaktif atau yang mampu menghasilkan perubahan warna. Tahap berikutnya
biasanya menganalisis DNA yang diisolasi dari kemungkinan rekombinan, pertama dengan
memeriksa ukuran molekul atau potongannya, atau dengan mengurutkan DNA. Ini adalah
pendekatan yang paling informatif tetapi dulunya sangat melelahkan. Dengan protokol
otomatis saat ini dan yang terus berkembang, pengurutan DNA telah menjadi bagian standar
dari prosedur analisis rekombinan. Namun,

Dalam prosedur ini, DNA disebarkan melalui elektroforesis pada gel yang kemudian diselidiki oleh
sepotong DNA yang melengkapi urutan yang diinginkan. Jika pita muncul pada autoradiografi maka probe
telah menemukan pasangan dan urutan yang diperlukan sudah ada, setidaknya sebagian. Pengurutan
DNA kemudian diperlukan untuk memastikan secara tepat apa yang telah terjadi selama prosedur kloning
tetapi keuntungannya adalah bahwa hanya sampel yang sangat mungkin berisi sisipan yang diperlukan
yang diurutkan, sehingga menghemat waktu dan biaya.

Dari teknik ini, Northern blot telah berkembang, yang merupakan gagasan yang kurang lebih sama kecuali
bahwa bahan yang disebarkan pada gel adalah RNA daripada DNA, dan
 Manipulasi Genetik 223

Western blot yang sedikit berbeda karena material yang dielektroforesis adalah protein, yang
diselidiki dengan antibodi terhadap protein yang diantisipasi, bukan asam nukleat, seperti yang terjadi
di Southern dan Northern blots.

Bakteri Rekombinan

GE mikroorganisme untuk digunakan dalam bioteknologi lingkungan cenderung berfokus pada

perluasan jalur metabolisme baik untuk memodifikasi kemampuan metabolisme yang ada atau
untuk memperkenalkan jalur baru. Ini memiliki berbagai aplikasi, mulai dari degradasi kontaminan
yang lebih baik, hingga produksi enzim untuk industri, sehingga prosesnya tidak terlalu merusak
lingkungan. Salah satu contoh eksperimental yang diambil dari 'teknologi bersih' dengan potensi
industri manufaktur, adalah strain Escherichia coli ke mana direkayasa sekitar 15 gen yang berasal
Pseudomonas. Ini diperkenalkan untuk membangun jalur yang mampu menghasilkan indigo untuk
pewarnaan denim, dikomentari oleh Bialy (1997). Metode tradisional membutuhkan penggunaan
bahan kimia beracun dengan tindakan keamanan terkait dan masalah polusi yang melekat.
Teknologi serupa diteliti pada awal 1980-an, oleh Amgen di AS dan Zeneca di Inggris, tetapi tidak
digunakan karena profitabilitas yang dipertanyakan. Apakah jalur ini pada akhirnya akan diambil
oleh industri masih harus dilihat (BMB, 1995).

Ragi rekombinan

Ragi, menjadi eukariota uniseluler, telah menjadi populer untuk kloning dan mengekspresikan gen
eukariotik. Perbanyakannya cukup mudah, beberapa spesies dapat dibudidayakan dengan cara yang
sama seperti bakteri. Sel jamur dikelilingi oleh dinding sel tebal yang harus dihilangkan untuk
memungkinkan masuknya DNA ke dalam sel. Ada beberapa jenis vektor plasmid yang tersedia untuk
GE, beberapa di antaranya telah dikonstruksi untuk memungkinkan replikasi pada bakteri dan ragi
(Beggs, 1981). Semua memiliki wilayah yang memungkinkan integrasi ke dalam genom ragi inang
melalui rekombinasi. Ini terjadi dengan penyelarasan sekuens yang saling melengkapi antara genom
inang dan DNA plasmid yang masuk. Dua peristiwa persilangan kemudian terjadi yang secara efektif
menukar sepotong DNA inang dengan DNA plasmid. Proses serupa terjadi dalam pembangunan
Baculovirus rekombinan.

Virus Rekombinan

Virus serangga, Baculovirus, telah terbukti menjadi metode pilihan untuk ekspresi gen yang
berlebihan dalam banyak aplikasi biologi molekuler. Genom virus relatif besar dibandingkan dengan
plasmid bakteri sehingga manipulasi DNA biasanya dilakukan pada plasmid yang dipertahankan di Escherichia
coli . pengantar
224 Bioteknologi Lingkungan

dari gen yang direkonstruksi, atau sekelompok gen, ke DNA Baculovirus terjadi melalui rekombinasi dengan
cara yang hampir sama seperti yang dijelaskan untuk pembentukan ragi rekombinan. Salah satu contoh
yang menarik untuk bioteknologi lingkungan adalah penggantian p10, salah satu dari dua protein utama
Baculovirus, polyhedrin menjadi yang lainnya, oleh gen untuk racun saraf kalajengking, dengan maksud
untuk meningkatkan kualitas insektisida dari virus, digambarkan pada Gambar 9.3 (Stewart dkk., 1991).
'Promotor' pada awal gen, yang dirujuk dalam gambar, adalah daerah RNA yang mengatur sintesis protein,
dari tidak ada sama sekali, hingga ekspresi maksimum.

Tanaman Transgenik

Saat ini GE di bidang agribioteknologi sedang memfokuskan pada modifikasi genetik untuk
memperbaiki tanaman dengan memperhatikan kualitas, nilai gizi dan ketahanan terhadap kerusakan
oleh hama dan penyakit. Cara lain yang sedang diselidiki bertujuan untuk meningkatkan toleransi
terhadap kondisi lingkungan yang ekstrim, untuk membuat tanaman lebih sesuai untuk peran mereka
dalam asimilasi polutan, degradasi atau dispersi melalui fitoremediasi, atau untuk memodifikasi
tanaman untuk menghasilkan bahan yang mengarah pada pengurangan pencemaran lingkungan.
Perbaikan kualitas tanaman seperti pengendalian pematangan buah (Grierson dan Schuch, 1993),
contohnya adalah yang sering dikutip, tomat Flavr-Savr, dan produksi sereal dengan nilai gizi yang
lebih baik, tidak dibahas di sini karena, meskipun minat yang besar untuk industri makanan, mereka
memiliki relevansi yang lebih perifer dengan bioteknologi lingkungan. Banyak tanaman transgenik,
contohnya diberikan nanti dalam bab ini, telah diproduksi dengan menggunakan sistem transfer
plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens dan sering digunakan bersama dengan promotor 35S CaMV.
Kedua alat ini dijelaskan dari sudut pandang teknik GE di bab ini dan dari sudut pandang biologis di
Bab 10.

Transformasi tanaman

Ada dua masalah praktis yang terkait dengan RG tanaman yang membuatnya lebih sulit untuk dimanipulasi
daripada bakteri. Pertama mereka memiliki dinding sel yang kaku dan kedua mereka tidak memiliki plasmid
yang menyederhanakan GE pada prokariota. Masalah pertama diatasi dengan penggunaan teknik khusus
untuk transformasi, dan yang kedua dengan melakukan semua manipulasi pada bakteri dan kemudian
mentransfer produk akhir ke dalam tanaman. Konstruksi DNA berisi daerah DNA yang melengkapi DNA
tumbuhan untuk memungkinkan potongan yang disisipkan bergabung kembali ke dalam genom tumbuhan.

Metode yang paling populer untuk mentransformasi tanaman adalah dengan plasmid Ti tetapi setidaknya
ada dua metode lain yang juga digunakan. Yang pertama adalah metode langsung di mana DNA terikat
pada peluru mikroskopis yang ditembakkan langsung ke jaringan tanaman. Contoh dari teknologi ini adalah
pengenalan gen tebu yang mampu menonaktifkan racun yang dihasilkan oleh bakteri, Xanthomonas
albilineans,
menyebabkan penyakit lepuh daun (Zhang, Xu dan Birch, 1999). Metode biolistik ini
 Manipulasi Genetik 225

bombardir, dapat meningkatkan popularitas sejalan dengan perbaikan transformasi plastik. Sekarang dimungkinkan
untuk menghasilkan transgenik subur yang mengekspresikan protein asing dalam buahnya yang dapat dimakan (Ruf dkk.,
2001).
Yang kedua adalah dengan fusi protoplas yang merupakan proses dimana dinding sel tumbuhan
dihilangkan meninggalkan sel yang hanya dikelilingi oleh membran yang jauh lebih rapuh. Ini dibuat
permeabel ke fragmen kecil DNA dan kemudian sel dibiarkan pulih dan tumbuh menjadi tanaman.
Metode ini bisa saja tidak berhasil karena kesulitan dalam pemulihan sel dari perawatan yang agak
traumatis dan juga karena DNA yang dimasukkan memiliki kecenderungan untuk disisipkan secara
acak ke dalam genom, bukan di tempat yang ditentukan. Namun, kedua metode menikmati keuntungan
bahwa DNA memasuki sel persis seperti yang dibangun dan tidak melewati vektor perantara yang
memberikan kesempatan untuk penyusunan ulang gen. Transformasi oleh plasmid Ti dari Agrobacterium
tumefaciens, ditunjukkan diagram pada Gambar 9.4, menderita beberapa kerugian selain keterbatasan
yang tidak segera menginfeksi beberapa tanaman sereal. Masalah potensial ini

Gambar 9.4 Ti plasmid dari Agrobacterium tumefaciens

226 Bioteknologi Lingkungan

telah ditangani dengan mencoba meningkatkan jangkauan inangnya (Godwin, Fordlloyd dan Newbury,
1992) yang telah berhasil, yang mengarah pada prosedur transformasi yang lebih baik (Le dkk., 2001).
Intinya, plasmid tipe liar mengandung gen yang menyebabkan transfer sepotong DNA, 'T-DNA', ke dalam
sel tumbuhan. Potongan ini dibatasi oleh urutan 24 pasang basa panjangnya yang berulang satu sama
lain. Struktur ini cukup umum dalam DNA dan digambarkan sebagai pengulangan langsung. T-DNA
terdiri dari gen yang menyebabkan penyakit empedu mahkota. Gen-gen ini dapat dipotong dan diganti
dengan DNA yang mengandung gen pilihan untuk dimasukkan ke dalam tanaman. Ada banyak elemen
tambahan yang mungkin dimasukkan dalam konstruksi. Misalnya, jika tujuannya adalah untuk
mengekspresikan gen, ia didahului oleh promotor yang kuat, paling umum promotor '35S' dari Cauli fl
ower Mosaic Virus.

Selain hal di atas, penting untuk mengetahui apakah gen 'asing' sedang diekspresikan dan begitu
seringnya gen 'reporter' yang dijelaskan pada bagian di atas juga disertakan yang terletak dekat dengan
gen yang diinginkan. Rekombinasi tidak 100% efisien, oleh karena itu metode seleksi diperlukan sehingga
hanya tanaman yang mengandung DNA baru yang tumbuh. Ini sering merupakan kode gen untuk
pembunuh gulma atau resistensi antibiotik. Atas dasar ukuran, ini biasanya lebih berhasil dimasukkan
pada plasmid Ti kedua selama koinfeksi Agrobacterium membawa plasmid yang mengandung gen yang
diinginkan. Percobaan bisa menjadi agak rumit pada tahap ini, karena gen selektor lain dimasukkan ke
dalam plasmid untuk memastikan bahwa pertumbuhan hanya mungkin jika semua elemen yang
diinginkan ada di dalam sel tumbuhan. Ini dapat melibatkan infeksi dengan dua atau tiga kultur Agrobacterium

masing-masing mengandung plasmid Ti yang direkayasa sendiri. Penjelasan yang sangat rinci tentang plasmid Ti

dipublikasikan di tempat lain (Hughes, 1996).

Contoh terpilih dari perkembangan GE pabrik

Tujuan dari contoh-contoh ini adalah untuk mengilustrasikan tanaman potensial yang dapat dimiliki GE untuk aplikasi
praktis di bidang bioteknologi lingkungan. Dalam beberapa kasus, tujuannya adalah untuk mengurangi jumlah
herbisida dan pestisida, atau bahan kimia pertanian lainnya yang diperlukan untuk menghasilkan hasil panen
tertentu, dalam kasus lain untuk meningkatkan toleransi terhadap kondisi yang keras atau untuk melindungi tanaman
dari serangan sehingga mengurangi pemborosan. Tujuannya adalah untuk mencatat detail teknis di sini, sementara
efek perkembangan semacam itu terhadap lingkungan secara keseluruhan, ditampilkan di bagian lain dalam buku
ini.

Perlindungan jarak jauh

Sebuah strategi umum untuk melindungi tanaman dari berbagai virus, jamur dan kerusakan oksidatif oleh berbagai
agen, telah diusulkan dengan menggunakan tanaman tembakau sebagai model. Transgenik mengekspresikan
protein pengikat besi, ferritin, dalam sel mereka yang tampaknya memberi mereka perlindungan yang luas (Deák dkk.,
1999).
 Manipulasi Genetik 227

Resistensi terhadap herbisida

'Glifosat', salah satu herbisida yang paling banyak digunakan, merupakan analog dari fosfoenol piruvat
dan menunjukkan aktivitas herbisida karena menghambat enzim.
5-enolpyruvylshikimate-3-fosfat sintase. Gen yang mengkode enzim ini telah diidentifikasi, diisolasi dan
disisipkan ke sejumlah tanaman termasuk petunia. Dalam kasus ini, gen diekspresikan di belakang
promotor CaMV dan diperkenalkan menggunakan A. tumefaciens, mengarah ke tingkat ekspresi enzim
yang sangat tinggi. Akibatnya, tanaman rekombinan menunjukkan ketahanan yang signifikan terhadap
efek glifosat (Shah dkk., 1986). Perkembangan dalam strategi ini meliputi pembentukan chimaeric sintase
enzim, analisis yang seharusnya mengarah pada peningkatan resistensi herbisida pada tanaman
transgenik menggunakan strategi ini (He dkk.,

2001).
Pendekatan alternatif tetapi tetap menggunakan A. tumefaciens, telah mentransfer gen untuk
mamalia cytochrome P450 monooxygenases, yang diketahui terlibat dalam detoksifikasi (dan aktivasi)
banyak xenobiotik termasuk pestisida, ke dalam tanaman tembakau. Transgenik ini menunjukkan
ketahanan terhadap dua herbisida,
chlortoluron.dll dan chlorsulphuron ( Yordanova, Gorinova dan Atanassov, 2001).

Peningkatan ketahanan terhadap hama

Tanaman memiliki mekanisme pertahanan bawaan yang melindunginya dari serangan serangga, tetapi
kerusakan yang disebabkan oleh hama mungkin masih cukup untuk mengurangi potensi komersial tanaman
tersebut. Prosedur yang biasa dilakukan adalah menyemprot tanaman dengan insektisida tetapi dalam upaya
mengurangi jumlah insektisida kimia yang digunakan, tanaman sedang direkayasa untuk meningkatkan
pertahanan diri terhadap hama. Serangan serangga tidak hanya menyebabkan kerusakan pada tanaman
tetapi juga memberikan jalur infeksi bakteri atau jamur selain berperan dalam penyebaran virus tanaman.
Dengan maksud untuk meningkatkan ketahanan terhadap serangan berkelanjutan, gen yang mengkode δ- endotoksin
dari bakteri, Bacillus thuringiensis, dijelaskan sedikit lebih lengkap di Bab 10, telah dipindahkan ke tanaman.
Contohnya adalah sintetis B. thuringiensis δ- endotoksin gen ditransfer, dalam kasus pertama, oleh A.
tumefaciens menjadi kubis Cina (Cho dkk., 2001) dan yang kedua, dengan pemboman biolistik ke dalam
jagung (Koziel dkk., 1993). Dalam kedua kasus tersebut, tanaman transgenik menunjukkan ketahanan yang
meningkat pesat terhadap serangan hama. Namun demikian, beberapa masalah dengan kinerja tanaman dari
beberapa tanaman rekayasa genetika yang disorot di Magg dkk. ( 2001). Serangga mampu mengembangkan
resistensi terhadap produk Bt yang merupakan masalah yang diatasi dengan penyisipan δ- endotoksin gen ke
dalam genom kloroplas dan bukan ke dalam inti tanaman, dengan hasil yang menjanjikan (Kota dkk., 1999;
Daniell dan Moar, 2007).

Perlu diingat bahwa untuk setiap asam amino yang dimasukkan ke dalam protein biasanya terdapat pilihan
tiga atau empat kodon yang semuanya mengkode asam amino yang sama. Organisme yang berbeda memiliki
preferensi yang berbeda untuk kodon tertentu
Bacillus thuringiensis cenderung menggunakan kodon yang lebih kaya timidin dan adenin daripada sel
tumbuhan tempat gen ditempatkan. Ada juga sinyal yang mengendalikan ekspresi gen ini yang relevan dengan
bakteri, bukan eukariota, yang akan melakukannya
228 Bioteknologi Lingkungan

tidak berfungsi dengan baik, jika sama sekali, di dalam sel tumbuhan. Untuk alasan ini, ekspresi dapat
memperoleh manfaat dari modifikasi urutan DNA untuk mengkompensasi perbedaan ini sambil
mempertahankan informasi dan instruksi. Hal ini mungkin menjelaskan sebagian dari tingkat ekspresi dan
stabilitas yang sangat tinggi dari protein Bt yang gennya telah dimasukkan, oleh pembombardiran mikro
(biolistik), ke dalam kloroplas (De Cosa dkk., 2001) yang, karena keturunan prokariotik mereka, memiliki
'mesin sintesis protein' lebih sesuai dengan prokariota daripada sel eukariotik tempat mereka hidup
bersama.

Upaya untuk meningkatkan resistensi virus telah mengarah pada pengenalan, oleh A. tumefaciens, dari gen
yang mengekspresikan antibodi terhadap protein mantel dari Tobacco Mosaic Virus (TMV). Ekspresi ini di
tanaman menyebabkan kekebalan penuh terhadap TMV (Bajrovic dkk., 2001).

Peningkatan ketahanan terhadap penyakit

Bakteri berkomunikasi satu sama lain melalui molekul kecil yang dapat berdifusi seperti
N-acylhomoserine lactones (AHLs) dari organisme Gram negatif. Dengan cara ini, yang digambarkan
sebagai 'penginderaan kuorum', mereka dapat mendeteksi ketika jumlah minimum organisme yang
kritis ada, sebelum bereaksi. Respon ini beragam dan termasuk pertukaran plasmid dan produksi
antibiotik dan molekul aktif biologis lainnya. Tanaman rentan terhadap bakteri patogen seperti Erwinia
carotovora, yang menghasilkan enzim yang mampu merusak dinding selnya. Sintesis enzim-enzim ini
berada di bawah kendali AHL sehingga mereka dibuat hanya setelah tingkat ambang batas yang sesuai
untuk bahan kimia ini telah tercapai. Alasan di balik penggunaan AHL untuk perlindungan tanaman
adalah untuk membuat tanaman transgenik, tembakau dalam hal ini, yang mengekspresikan sinyal ini
sendiri. Tingkat AHL yang tinggi akibat yang diberikan kepada bakteri patogen, secara keliru
menunjukkan jumlah organisme serupa yang sangat tinggi di sekitarnya, dan memicu bakteri tersebut
untuk merespons. Akibatnya, mereka menghasilkan enzim yang mampu merusak dinding sel tumbuhan
dan melanjutkan infeksi. Tanaman akan meningkatkan respons normalnya terhadap invasi tetapi dalam
skala yang jauh lebih besar daripada yang diperlukan untuk menghancurkan beberapa bakteri yang
sebenarnya menyebabkan infeksi, sehingga meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit. dkk.,
1999) pada akhirnya mengarah pada pengembangan dan pematenan alat yang berhasil untuk
mengendalikan infeksi bakteri (Zhang dkk., 2007).

Toleransi yang ditingkatkan

Interaksi tumbuhan-mikroba dibahas dalam Bab 10. Di antara contoh yang diberikan adalah interaksi Pseudomonas
syringae yang menempati permukaan daun. Contoh ini adalah modifikasi bakteri daripada tanaman tetapi
mempengaruhi interaksi antara keduanya. Pseudomonas syringae menghasilkan protein yang mendorong
pembentukan kristal es tepat di bawah 0 ◦ C sehingga meningkatkan risiko kerusakan akibat embun beku.
Lindow dkk. ( 1989) telah mengidentifikasi dan mengisolasi gen untuk protein ini. Mereka memindahkannya
ke bakteri Escherichia coli untuk menyederhanakan
 Manipulasi Genetik 229

manipulasi genetik. Ini membutuhkan penghapusan daerah yang cukup sehingga protein perantara es yang
terpotong, dan karena itu tidak berfungsi, diekspresikan. Mereka memperkenalkan kembali gen yang bermutasi ini
ke dalam Pseudomonas syringae dan dipilih untuk
Es - mutan yang tidak lagi mampu menghasilkan protein nukleasi es. Banyak rezim seperti itu gagal dalam
praktiknya karena sulit untuk mempertahankan populasi bakteri mutan dalam komunitas yang didominasi
oleh tipe liar sesering mungkin, yang terakhir akan segera mengalahkan mutan dengan persaingan untuk
mendapatkan nutrisi, karena biasanya lebih baik beradaptasi dengan spesies tertentu. lingkungan daripada
mutan. Namun, dalam hal ini, karena penerapan masif Es pseudomonas syringae - untuk tanaman stroberi,
mutan mampu bersaing dengan jenis liar dan melindungi tanaman yang sangat rentan ini dari kerusakan
akibat embun beku.

Toleransi garam pada tomat telah ditetapkan dengan memasukkan gen yang terlibat dalam antiport
Na + / H +, pengangkutan ion natrium dan hidrogen dalam arah yang berlawanan melintasi membran.
Kualitas buah dipertahankan berdasarkan fakta bahwa akumulasi natrium yang disebabkan oleh
antiport terjadi hanya pada daun dan bukan pada buah (Zhang dan Blumwald, 2001).

Peningkatan toleransi terhadap kekeringan, garam dan pembekuan Arabidopsis telah dicapai
dengan mengekspresikan protein secara berlebihan yang menginduksi gen respons stres. Namun, jika
terlalu banyak faktor ini yang diproduksi, yang merupakan kasus ketika 35S CaMV digunakan, maka
terjadi retardasi pertumbuhan yang parah. Tidak ada masalah seperti itu ketika ekspresi berlebih
berada di bawah kendali promotor yang hanya diaktifkan ketika kondisi stres ada (Kasuga

dkk., 1999).

Tanaman yang diperbaiki untuk fitoremediasi

Bab 7 menyebutkan modifikasi genetik poplar untuk memungkinkan merkuri dikeluarkan dari tanah dan diubah
menjadi bentuk yang dapat dilepaskan ke atmosfer. Proses ini disebut 'phytovolatilisation' (Rugh dkk., 1998).
Modifikasi membutuhkan gen yang akan dibangun, ditata pada bakteri mer A gen, dengan membuat salinan
yang mencerminkan bias kodon yang ditemukan pada tanaman menggunakan teknik PCR. Itu mer A gen
adalah salah satu dari sekumpulan gen yang terlibat dalam detoksifikasi bakteri merkuri, dan merupakan salah
satu pengkode untuk enzim, reduktase ion merkuri, yang mengubah merkuri dari bentuk ionik menjadi bentuk
yang mudah menguap. Awalnya dibangun mer A

gen diekspresikan dalam Arabidopsis thalia ( pemerkosaan) di mana resistensi terhadap merkuri diamati,
dan dalam penelitian ini, gen dipindahkan dengan pemboman mikroproyeksi ('senjata gen') ke pohon
poplar ( Liriodendron tulipifera) bahan embriogenik. Ketika planlet poplar kuning yang dihasilkan dibiarkan
berkembang, ditemukan menunjukkan toleransi terhadap merkuri dan menguap 10 kali lipat dari
kecepatan yang diamati pada planlet poplar kuning yang tidak ditransformasi. Studi ini menunjukkan
kemungkinan bahwa pohon dapat dimodifikasi menjadi alat yang berguna dalam detoksifikasi tanah yang
terkontaminasi merkuri. Studi-studi ini dilakukan di Arabidopsis thalia dimana diamati bahwa perbaikan
yang berhasil juga membutuhkan mer B pengkodean gen untuk a Lyase ( Bizily, Rugh dan Meagher,
2000).
230 Bioteknologi Lingkungan

Gen bakteri yang menyandi pentaerythritol tetranitrate reduktase, enzim yang terlibat dalam degradasi
bahan peledak, telah dipindahkan ke tanaman tembakau. Transgenik telah terbukti mengekspresikan enzim
yang benar dan uji coba yang dilakukan untuk menentukan sejauh mana kemampuannya untuk
mendegradasi TNT (Bahasa Prancis
dkk., 1999).
Perkembangan penggunaan tanaman transgenik untuk bioremediasi telah ditinjau
(Francova dkk., 2001; Eapen, Singh dan D'Souza, 2007; Van Aken, 2009).

Produk baru dari tumbuhan

Tanaman pemerkosaan, Arabidopsis thalia telah menjadi pilihan populer untuk produksi spesies
rekombinan. Salah satu rekombinan tersebut adalah tanaman pemerkosaan, yang komposisi asam
lemak dalam bijinya telah dimodifikasi. Sekarang memproduksi triasilgliserol yang mengandung
peningkatan kadar asam trierusinat yang cocok untuk digunakan dalam industri polimer (Brough dkk., 1996)
dan, dalam proyek terpisah, polihidroksibutirat cocok untuk produksi plastik biodegradable (Hanley,
Slabas dan Elborough, 2000). Sintesis poli kopolimer (3-hidroksibutirat- bersama

3-hydroxyvalerate) oleh Arabidopsis, adalah contoh lain dari penerapan

Agrobacterium tumefaciens teknologi dan penggunaan promotor 35S dari Cauli fl ower Mosaic
Virus (Slater dkk., 1999). Kopolimer ini dapat diproduksi dengan fermentasi bakteri, tetapi karena
pertimbangan biaya, kopolimer ini biasanya disintesis secara kimiawi. Contoh ini dibahas lebih
lanjut dalam Bab 10 di bawah payung teknologi 'bersih'. Kemajuan dalam bidang ini telah ditinjau
(Snell and Peoples, 2002; Mooney, 2009).

Kata penutup

Sungguh ironi bahwa GE hampir identik dengan bioteknologi. Kemajuan dalam bidang ini sangat
besar dan, di banyak bidang, sangat penting, namun dampaknya tidak terlalu dramatis bila
mempertimbangkan aspek lingkungan semata. Banyak dari apa yang telah didiskusikan dalam bab
ini belum berhasil membuat transisi besar-besaran ke dalam aktivitas komersial arus utama dan
apakah hal itu masih akan tetap dilihat, meskipun peningkatan paten di lapangan menimbulkan
beberapa optimisme yang mungkin terjadi. Genomik, misalnya, mewakili satu set teknologi yang
berkembang pesat yang mungkin dianggap lebih penting di lapangan di masa mendatang. Ini adalah
semacam istilah selimut yang digunakan untuk menggambarkan bidang luas dari disiplin '-omik',
termasuk hal-hal seperti arsitektur dan pengurutan genom, metabolomik, proteomik dan
transkriptomik. Dari berbagai individu -omics yang berpotensi menguntungkan, mungkin
toksikogenomik - pemeriksaan perubahan ekspresi gen yang diinduksi toksin - dapat membuktikan
yang paling berguna untuk bioteknologi lingkungan. Jika pada akhirnya dapat dikembangkan untuk
menyediakan biomarker praktis yang efektif untuk membantu memantau risiko ekologi, ini dapat
membuka jalan bagi alat pengambilan keputusan utama dan memfasilitasi pilihan dan penerapan
perbaikan yang sesuai.
 Manipulasi Genetik 231

teknologi. Namun, tetap penting untuk diingat bahwa dalam aplikasi praktis apa pun semacam ini, transfer
teknologi ke dalam pengaturan situasi dunia nyata yang pada dasarnya tidak terkendali jarang dilakukan
secara langsung dan menyempurnakan teknik untuk penggunaan yang luas mungkin memerlukan sedikit
waktu untuk mencapainya. Meskipun demikian, GE tidak diragukan lagi akan terus memainkan peran definitif
dalam pengembangan ilmu biologi di masa depan, meskipun posisinya dalam hal bioteknologi lingkungan
praktis mungkin masih kurang jelas.

Referensi

Bajrovic, K., Erdag, B., Atalay, EO dan Cirakoclu, B. (2001) Resistensi penuh terhadap infeksi Virus
Mosaik Tembakau yang diberikan oleh ekspresi transgenik dari antibodi rekombinan dalam
tembakau. Peralatan Bioteknologi dan Bioteknologi, 15, 21–27.

Beggs JD (1981) di Kloning Gen dalam Rekayasa Genetik Ragi, vol. 2 (ed.
R. Williamson), Academic Press, London, New York, Toronto, Sydney, San Francisco, hlm.
175–203.
Bialy, H. (1997) Komentar - bioteknologi, bioremediasi, dan gen biru.
Bioteknologi Alam, 15, 110.
Anehnya, SP, Rugh, CL dan Meagher, RB (2000) Phytodetoxi fi kasi organomercurial
berbahaya oleh tanaman rekayasa genetika. Bioteknologi Alam, 18, 213–217.

BMB (1995) Bioteknologi Berarti Laporan Status Bisnis Industri Tekstil dan Pakaian, DTI,
London, hal. 17.
Brough, CL, Coventry, JM, Christie, WW dkk. ( 1996) Menuju rekayasa genetika triasilgliserol dari
komposisi asam lemak terdefinisi: Perubahan besar pada kandungan asam erurat pada posisi
sn-2 dipengaruhi oleh pengenalan asiltransferase 1-asil-sn-gliserol-3-fosfat dari Limnanthes
douglasii ke dalam biji minyak memperkosa. Pemuliaan Molekuler, 2, 133–142.

Cho, HS, Cao, J., Ren, JP dan Earle, ED (2001) Pengendalian hama serangga Lepidopteran pada kubis
transgenik Cina (Brassica rapa ssp pekinensis) yang ditransformasikan dengan bahan sintetis. Bacillus
thuringiensis gen cry1C. Laporan Sel Tanaman, 20,
1–7.
Cook, MA, Osborn, AM, Bettandorff, J. dan Sobecky, PA (2001) Isolasi endogen dari probe
replika untuk menilai ekologi plasmid komunitas mikroba sedimen laut. Mikrobiologi, 147, 2089–2101.

Daniell, H. dan Moar, W. (2007) Vektor transformasi kloroplas tembakau yang terdiri dari operon
multi-gen yang mengkode protein biofarmasi dan pendamping. Paten Amerika Serikat
7294506.
Deák, M., Horváth, GV, Davletova, S. dkk. ( 1999) Tanaman secara ektopik mengekspresikan
protein pengikat besi, feritin, toleran terhadap kerusakan oksidatif dan patogen. Bioteknologi
Alam, 17, 192–196. De Cosa, B., Moar, W., Lee, SB dkk. ( 2001) Overekspresi operon Bt
cry2Aa2 dalam kloroplas menyebabkan pembentukan kristal insektisida.

Bioteknologi Alam, 19, 71–74.

232 Bioteknologi Lingkungan

Eapen, S., Singh, S. dan D'Souza, S. (2007) Kemajuan dalam pengembangan tanaman transgenik
untuk remediasi polutan xenobiotik. Kemajuan Bioteknologi,
25 ( 5), 442–451.
Francova, K., Macek, T., Demnerova, K. dan Mackova, M. (2001) Tanaman transgenik - alat
potensial untuk dekontaminasi polutan lingkungan.
Chemicke Listy, 95, 630–637.
Fray, RG, Grup, JP, Daykin, M. dkk. ( 1999) Tanaman yang dimodifikasi secara genetik untuk menghasilkan
N-acylhomoserine lactones berkomunikasi dengan bakteri. Bioteknologi Alam, 17, 1017–1020.

Prancis, CE, Rosser, SJ, Davies, GJ dkk. ( 1999) Biodegradasi bahan peledak oleh tanaman transgenik
yang mengekspresikan reduktase pentaerythritol tetranitrate. Bioteknologi Alam, 17, 491–494.

Godwin, I., Fordlloyd, B. dan Newbury, H. (1992) In vitro pendekatan untuk memperluas kisaran
inang agrobacterium untuk transformasi tanaman. Jurnal Botani Australia, 40, 751–763.

Grierson, D. dan Schuch, W. (1993) Pengendalian pematangan. Transaksi Filosofis dari Royal
Society of London, 342, 241–250.
Hanley, Z., Slabas, T. dan Elborough, KM (2000) Penggunaan bioteknologi tanaman untuk
produksi plastik biodegradable. Tren Ilmu Tanaman, 5,
45–46.
Dia, M., Yang, ZY, Nie, YF dkk. ( 2001) Jenis baru mutan sintase
5enolpyruvylshikimate-3-fosfat bakteri kelas 1 dengan peningkatan toleransi terhadap
glifosat. Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects, 1568, 1–6. Hehemann, JH.,
Correc, G., Barbeyron, T. dkk. ( 2010) Transfer enzim aktif karbohidrat dari bakteri laut ke
mikrobiota usus Jepang. Alam, 464,
908–912.
Hughes, MA (1996) Genetika Molekuler Tanaman, Longman, hlm. 77–105. Kasuga, M., Liu, Q., Miura,
S. dkk. ( 1999) Memperbaiki kekeringan tanaman, garam, dan toleransi pembekuan dengan transfer
gen dari faktor transkripsi tunggal yang dapat diinduksi stres. Bioteknologi Alam, 17, 287–291. Kota,
M., Daniell, H., Varma, S. dkk. ( 1999) Ekspresi berlebih dari Bacillus thuringiensis ( Bt) Protein
Cry2Aa2 dalam kloroplas memberikan ketahanan tanaman terhadap serangga yang rentan dan tahan
Bt. Prosiding National Academy of Sciences of the United States of America, 96, 1840–1845. Koziel,
MG, Beland, GL, Bowman, C. dkk. ( 1993) Penampilan lapangan tanaman jagung transgenik elit yang
mengekspresikan protein insektisida yang berasal

Bacillus thuringiensis. Bioteknologi, 11, 194–200.

Le, VQ, Belles-Isles, J., Dusabenyagasani, M. dan Tremblay, FM (2001) Prosedur yang diperbaiki
untuk produksi tanaman transgenik cemara putih (Picea glauca) menggunakan Agrobacterium
tumefaciens. Jurnal Botani Eksperimental, 52,
2089–2095.
Lindow, SE, Panopoulos, NJ dan McFarland, BL (1989) Rekayasa genetika bakteri dari habitat
yang dikelola dan alami. Ilmu, 244, 1300–7.
 Manipulasi Genetik 233

Magg, T., Melchinger, AE, Klein, D. dan Bohm, M. (2001) Perbandingan hibrida jagung Bt dengan rekan
non-transgenik dan varietas komersial untuk ketahanan terhadap penggerek jagung Eropa dan untuk
sifat agronomi. Pemuliaan Tanaman,
120, 397–403.
Mooney, BP (2009) Revolusi hijau kedua? Produksi plastik biodegradable nabati. Jurnal
Biokimia, 418 ( 2), 219–232. Pessi, G., Blumer, C. dan Haas, D. (2002) lac z fusi melaporkan
ekspresi gen, bukan? Mikrobiologi, 147, 1993–1995. Promega (1996) Protokol dan Panduan
Aplikasi, Edisi ke-3, Promega Corporation.

Reanney, D. (1976) Elemen ekstrachromosomal sebagai kemungkinan agen adaptasi dan

perkembangan. Ulasan Bakteriologis, 40, 552–90. Ruf, S., Hermann, M., Berger, IJ dkk. ( 2001)
Transformasi genetik yang stabil dari plastida tomat dan ekspresi protein asing dalam buah. Bioteknologi
Alam, 19, 870–875.

Rugh, CL, Senecoff, JF, Meagher, RB dan Merkle, SA (1998) Pengembangan poplar kuning
transgenik untuk fitoremediasi merkuri. Bioteknologi Alam, 16, 925–928.

Shah, DM, Horsch, RB, Klee, HJ dkk. ( 1986) Rekayasa toleransi herbisida pada tanaman
transgenik. Ilmu, 233, 478–481. Slater, S., Mitsky, TA, Houmiel, KL dkk. ( 1999) Rekayasa
metabolik
Arabidopsis dan Brassica untuk poli (3-hidroksibutirat- bersama Produksi kopolimer
3-hidroksivalerat). Bioteknologi Alam, 17, 1011–1016.
Snell, KD dan Peoples, OP (2002) Polimer polihidroksialkanoat dan produksinya di tanaman
transgenik. Rekayasa Metabolik, 4, 29–40. Stewart, LMD, Hirst, M., Ferber, ML dkk. ( 1991)
Pembuatan insektisida baculovirus yang ditingkatkan yang mengandung gen toksin khusus
serangga.
Alam, 352, 85–88.
Van Aken, B. (2009) Tanaman transgenik untuk meningkatkan fitoremediasi bahan peledak beracun. Opini
Terkini di Bioteknologi, 20 ( 2), 231–236.
Yordanova, E., Gorinova, N. dan Atanassov, A. (2001) Penggunaan gen monooxygenase sitokrom P450
untuk memperkenalkan toleransi herbisida dalam tembakau.
Peralatan Bioteknologi dan Bioteknologi, 15, 49–55.
Zhang, H.-X. dan Blumwald, E. (2001) Tanaman tomat transgenik toleran garam mengakumulasi garam
di dedaunan tetapi tidak di buah. Bioteknologi Alam, 19,
765–768.
Zhang, L., Dong, Y., Xu, J. dan Zhang, X. (2007) Pengendalian infeksi bakteri dengan quenching
quorum-sensing dari bakteri patogen tanaman. Paten Amerika Serikat
7205452.
Zhang, L., Xu, J. dan Birch, R. (1999) Detoksifikasi yang direkayasa memberikan resistensi
terhadap bakteri patogen. Bioteknologi Alam, 17,
1021–1024.
234 Bioteknologi Lingkungan

Studi Kasus 9.1 Deteksi Bahan Peledak Bakteri yang Direkayasa (Skotlandia)

Menurut lembaga amal Handicap International, antara 15.000 dan 20.000 orang terbunuh atau terluka setiap tahun
oleh ranjau darat dan persenjataan yang tidak meledak, dan mayoritas adalah warga sipil, yang sering mencoba
membangun kembali kehidupan mereka setelah konflik regional. Hampir 90 negara di seluruh dunia penuh dengan
ladang ranjau dan bahan peledak yang tersisa dari perang saat ini, baru-baru ini atau yang terlupakan, dan dalam
banyak kasus, catatan penempatan buruk jika ada. Selain kematian langsung dan cedera akibat ranjau darat,
ancaman mereka yang selalu ada terhadap kehidupan dan anggota tubuh membawa kerusakan psikologis, sosial dan
ekonomi yang tak terhitung setelah mereka. Tak pelak, dengan perkiraan 110 juta ranjau darat yang tersebar di
seluruh zona konflik dunia, deteksi yang akurat dan efektif dari bahan peledak tersembunyi tersebut merupakan
elemen penting dalam setiap upaya rekonstruksi jangka panjang.

Sebuah tim di Universitas Edinburgh telah membahas perlunya deteksi ranjau yang aman dan berbiaya
rendah dengan mengembangkan bakteri yang bercahaya di hadapan bahan peledak. Mampu disemprotkan
sebagai larutan dari udara, setelah berada di tanah, mikroba berkembang biak, memancarkan warna hijau yang
khas saat bersentuhan dengan ranjau darat, peluru artileri, dan sejenisnya. Hanya dalam waktu 2 jam setelah
tanah dirawat, bakteri tersebut mengungkapkan keberadaan alat peledak yang terkubur, yang dapat dihindari
oleh penduduk setempat sampai dapat dengan aman dipindahkan dan dimusnahkan.

Bakteri diciptakan oleh biobricking proses, teknik yang semakin banyak digunakan oleh ahli biologi sintetik untuk
menemukan varietas organisme baru yang secara tegas dirancang untuk memenuhi tujuan tertentu, dengan
memanipulasi paket DNA. Meskipun penggunaan plasmid yang mendasari untuk mentransfer materi genetik ke
dalam organisme target adalah bagian dari GE tradisional yang sudah lama mapan, biobricking memperluas
penerapannya untuk memungkinkan fungsi yang lebih maju dapat dicapai - pengkodean untuk luminesensi dengan
adanya bahan peledak dan bahan kimia yang berasal dari bahan peledak dianggap sebagai 'perangkat' dalam
bahasa teknologi biobrick.

Sementara para peneliti Edinburgh tidak memiliki rencana segera untuk membuat ini tersedia secara komersial, tidak
diragukan lagi hal ini memberikan eksposisi pertama yang menarik dari potensi mikro-organisme hasil rekayasa dalam peran
tersebut.