REVIEW JURNAL REKAYASA GENETIKA

PROTOKOL UNIVERSAL SOUTHERN BLOT DENGAN PROBE DINGIN

ATAU RADIOAKTIF UNTUK VALIDASI ALEL YANG DIPEROLEH
DENGAN REKOMBINASI HOMOLOG

FEBRI DWI IRFANSYAH

081711433063

PROGRAM STUDI S-1 BIOLOGI

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
2020
1.1. Latar Belakang
Gen target dalam embrionik stem sel (ES) biasanya memerlukan seleksi antibiotik untuk
koloni yang resisten terhadap isolat, kemudian disaring dengan uji yang cepat dan murah,
seringkali dengan metode PCR untuk memastikan gen target telah disisipi. Kemudian, koloni
yang positif di modifikasi sesuai gen target agar mudah teridentifikasi dan harus
dikarakterisasi lebih lanjut untuk melengkapi validasi alel baru. Metode Southern-blot dapat
digunakan untuk menunjukkan struktur penargetan dan jumlah integrasi konstruksi
penargetan.
Genom kompleks dan genom lainnya merupakan alat terpenting untuk genetika fungsional.
Sebagai bagian dari International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC), penulis juga
terlibat untuk menghasilkan tikus mutan dari kloning embrionik stem cell yang mengandung
alel knockout-first. Untuk mentransfer sel ke tikus ES, penulis menggunakan probe Southern
blotting dan non-radioaktif untuk memastikan alel telah ada dalam sel ES dan masuk ke
dalam jaringan tubuh mencit.
Prinsip Southern blotting didasarkan pada kemampuan untuk memisahkan fragmen DNA
yang diperoleh dengan restriksi digestion menurut ukurannya dengan gel elektroforesis dan
dengan hibridisasi probe berlabel radioaktif menjadi asam nukleat yang terdenaturasi dan
diimobilisasi pada nilon atau nitroselulosa. Southern blotting digunakan untuk memantu
struktur mutasi dalam sel ES. Belakangan ini, penulis telah menggunakan probe digoxin dan
reaksi enzimatis sebagai pengganti radioaktif.
Digesti DNA genom oleh enzim restriksi, menghasilkan fragmen dengan ukuran tertentu
yang dipisahkan dengan gel elektroforesis. Fragmen DNA didenaturasi, ditransfer, dan
diimobilisasi ke nilon. Probe mendeteksi pita DNA yang berisi jutaan target. Jumlah dan
ukuran pita dapat diukur berdasarkan ukuran pita marker daan dibandingkan dengan nilai
yang diinginkan. Peneliti menggunakan probe internal untuk mendeteksi reporter lacZ atau
marker neo yang dipilih untuk semua alel target yang telah divalidasi sebagai bagian dari
transformasi gen ke mencit.
1.2. Rumusan Masalah
1. Bagaimana cara membuat probe agar tidak merubah urutan operator?
2. Bagaimana cara memastika kualitas pita mouse target yang baru dibuat?
2.3. Metode
1. Ekstraksi DNA genom
Bahan :
 1 M Tris Hcl pH 7,5
 0,5 M EDTA
 20% SDS
  5 M NaCl
 10 mg/ml Proteinase K
 Phenol, pH7.9
 Phase Lock Gel Tubes (Five Prime, 2302820)
 Isopropanol
 Ethanol murni
 Air MilliQ
Larutan stok untuk ekstraksi DNA genom

Menyiapkan stok lysis buffer dengan memasukkan air terlebih dahulu, kemudian ditambahkan

reagen (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 2% SDS, 200 mM NaCl). Aduk hingga rata dan

disimpan pada suhu ruang. Menyiapkan 10 mg/ml proteinase K dan aliquit disimpan pada suhu

-20°C.

1.1. Ekstraksi DNA genom dari kultur pelet sel ES

Sampel sel ES dikoleksi dari overconfluent berdiameter 9cm; tripsin sel ES dan
pelet ke dalam tabung eppendorf. Sebagai pengganti, DNA genom dapat langsung
diekstraksi dari sel plate.
Hari 1: Menyiapkan PK lisis dengan menambahkan 75 µl 10 mg/ml Protease K ke
dalam 750 µl buffer lisis, disesuaikan dengan jumlah sampel. Menambahkan
campuran PK lisis sebanyak 825µl ke dalam sumuran atau tabung yang berisi
sampel sel ES. Mencampurkan sel pellet dan buffer lisis dengan menggunakan
mikropipet. Jika ingin mengekstraksi langsung dari sel plate, basahi tisu dapu dan
diletakkan di dasar kotak plastik. Tutup sekeliling sel plate ES dengan menggunakan
parafilm untuk mencegah sampel kering, lalu masukkan sel plate ES ke dalam
kotak. Sampel diinkubasi dengan campuran PK lisis selama 24 jam pada suhu 25°C.
Hari ke 2: Jika diekstraksi langsung dari sel plate, gunakan mikropipet untuk
memindahkan sel plate ES ke dalam tabung Eppendorf. Sebelum ditambahkan
denol, larutan tersebut harus dihomogenkan dengan menggunakan mikropipet.
Dalam lemari asam, ditambahkan 600µl fenol:kloroform:IAA (hanya digunakan
bagian pelet) lalu dikocok dengan sekuat tenaga dan jangan menggunakan vortex.
Merekatkan tabung Eppendorf lalu dihomogenkan dengan diayunkan selama 15
 menit. Dalam lemari asam, pelet dipindahkan ke tabung lock gel dan dihomogenkan
dengan microcentrifuge dengan kecepatan penuh selama 5 menit. Tujuan dari
menghomogenkan adalah untuk memisahkan sampel menjadi supernatan dibagian
atas dan pelet dibagian bawah yang mengandung fenol, kloroform, dan IAA.
Menuang supernatan ke dalam tabung Eppendorf baru dan pelet tersebut dibuang.
Supernatan yang dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf ditambahkan 70µl
isopropanol lalu dihomogenkan, hal tersbut bertujuan untuk mengendapkan DNA.
Sampel disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan penuh untuk membuat pelet
DNA, lalu keluarkan supernatan dengan hati-hati. Pelet dicuci dengan
menambahkan 200µl etanol 70%. Dikocok selama 1 menit, lalu etanolnya dibuang.
Pelet diangin-anginkan selama 15-20 menit dengan membiarkan tabung terbuka.
Pelet ditambahkan dengan 400 air MilliQ, jumlah air harus sama dengan ukuran
diameter pellet kira-kira 100 µl per mm. Menggunakan mikropipet dengan lembut
untuk menghindari pemotongan atau kerusakan DNA, lalu simpan pada suhu 4°C
selama 24 jam atau selama beberapa hari. Sebelum dilakukan screening, harus
dihomogenkan untuk memastikan homogenitas larutan DNA dan menghindari
pembacaan spektrofotometer yang tidak akurat.

1.2. Ekstraksi DNA genom dari jaringan lunak

Hari 1 : Memotong limpa dengan menggunakan pisau bedah menjadi dua bagian
yang sama. Tempatkan salah satu limpa yang telah dipotong ke dalam tabung
Eppendorf dan dibekukan untuk digunakan kapanpun. Jaringan hepar yang satunya
ditaruh di MACS C-Tube ungu dan ditambahkan 1,5 ml PBS lalu dihomogenkan
dengan menggunakan program m-spleen-04.01. Lakukan homogenisasi dengan
menggunakan program yang sama untuk kedua kalinya, lalu sampel dipindahkan di
tabung Eppendorf dan dihomogenkan dengan menggunakan mikropipet, lalu di
sentrifuge dengan kecepatan penuh selama 5 menit untuk mendapatkan pellet.
Membuang HBS dan ditambahkan 750 µl buffer lisis, lalu menghomogenkan
dengan menggunakan mikropipet. Tambahkan 75 µl 10 mg/ml Proteinase K dengan
menggunakan mikropipet dan dihomogenkan. Sampel diinkubasi pada suhu 55°C
selama 3-4 jam, sebelum 4 jam ditambahkan 200 µl buffer lisis dan 40 µl 10 mg/ml
 Proteinase K ke dalam sampel, lalu dihomogenkan dengan menggunakan mikropipet
dan diinkubasi pada suhu 55°C selama 24 jam.

Hari 2 : Ditambahkan 200 µl buffer lisis dan 40 µl 10 mg/ml Proteinase K ke stiap

sampel, lalu dihomogenkan dengan menggunakan mikropipet lalu diinkubasi pada
suhu 55°C selama 3-4 jam. Setelah proses inkubasi, sampel dibagi menjadi dua
masing-masing sebanyak 600 µl ke dalam tabung Eppendorf. DI lemari asam,
ditambahkan 600 µl fenol:kloroform:IAA ke masing-masing sampel, lalu
dihomogenkan, kemudian di lemari asam, menuangkan seluruh volume setiap
tabung Eppendorf ke dalam tabung lock gel, lalu dihomogenkan dengan
menggunakan sentrifus dengan kecepatan penuh selama 5 menit, hal tersebut untuk
mendapatkan supernatan(bagian yang mengandung DNA) dan pellet.
Menggabungkan supernatant dari dua tabung lock gel ke dalam Eppendorf baru
sebanyak 400 µl sedangkan untuk pellet dapat dibuang.

Tambahkan 700 µl isopropanol hingga Eppendorf hampir penuh dan dihomogenkan

dengan sentrifus hingga didapatkan pellet DNA, lalu keluarkan supernatan dengan
hati-hati. Pelet ditambahkan 200µl etanol 70%. Dikocok selama 1 menit, lalu
etanolnya dibuang. Pelet diangin-anginkan selama 15-20 menit dengan membiarkan
tabung terbuka. Pelet ditambahkan air MilliQ, jumlah air harus sama dengan ukuran
diameter pellet kira-kira 100 µl per mm. Menggunakan mikropipet dengan lembut
karena DNA akan berserabut dan lengket, lalu simpan pada suhu 4°C.

1.3. Ekstraksi DNA genom dari jaringan ekor

Hari 1: Potong ekor menjadi potongan-potongan kecil dengan memisahkan

vertebrae. Menaruh 2-3 potongan vertebrae ke dalam Eppendorf dan simpan sisa
jaringan ekor di dalam freezer. Catatan: Tidak perlu dihomogenkan. Menambahkan
750 µl buffer lisis dan 75 µl 10 mg/ml Proteinase K ke sampel dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 55°C.

Hari 2: Tulang vertebrae dan rambut pada ekor tidak di digest, hal itu normal untuk
melihat sisa jaringan. Mensentrifus sampel ekor selama 2 menit dengan kecepatan
penuh untuk mengumpulkan sisa di bagian bawah tabung. Memindahkan sekitar 600
 µl fenol:kloroform:IAA sampel ekor ke dalam Eppendorf baru, lalu dihomogenkan
dengan kecepatan rendah selama 15 menit. Di lemari asam, pindahkan semua
sampel pada Eppendorf ke tabung lock gel, kemudian disentrifus dengan kecepatan
penuh selama 5 menit untuk mendapatkan supernatan (mengandung DNA) dan
pelet.

Membuang pelet dan memindahkan supernatant ke Eppendorf baru dengan ditambah

700 µl isopropanol sampai Eppendorf hampir penuh lalu dihomogenkan untuk
mendapatkan pelet DNA. Catatan: Pelet DNA mungkin tidak terlihat begitu jelas, jadi
harus membuang supernatan dengan hati-hati. Pelet ditambahkan 200µl etanol 70%.
Dikocok selama 1 menit, lalu etanolnya dibuang. Pelet diangin-anginkan selama 15-20
menit dengan membiarkan tabung terbuka. Pelet ditambahkan dengan 400 air MilliQ,
jumlah air harus sama dengan ukuran diameter pellet kira-kira 100 µl per mm.
Menggunakan mikropipet dengan lembut karena DNA akan berserabut dan lengket, lalu
simpan pada suhu 4°C selama 24 jam. Lalu sampel discreening dengan menggunakan
nanodrop atau metode berbasis spektrofotometri keesokan harinya. Catatan: jumlah
jaringan yang dibutuhkan untuk proses Southern blot lebih banyak daripada yang
diperoleh dari biopsi ekor hewan hidup. Namun, sampel ekor sering tersedia sebagai
bahan beku dan merupakan sumber jaringan yang berguna untuk persiapan DNA genom.

2. Desain Southern assay

Enzim restriksi diseleksi dan genom harus dipotong untuk memproduksi fragmen
yang mengandung urutan yang dikenali oleh probe. Digesti umumnya dilakukan oleh
satu enzim, tetapi kadang-kadang dilakukan oleh penggabungan dua enzim restriksi
untuk mendapatkan ukuran fragmen yang diinginkan. Enzim restriksi dipilih agar
menghasilkan fragmen dengan ukuran yang dapat diselesikan dengan migrasi dalam gel
agarose (pabila memungkinkan kurang dari 20 kb dengan elektroforesis normal). Dua
digesti berbeda digunakan untuk satu lengan homolog. Tergantung dari ukuran fragmen
yang dihasilkan, digesti dengan satu enzim dapat mencakup dua lengan homolog. Desian
Southern assay dapat dilihat pada gambar 1
 Gambar 1 Desain Southern Assay
3. Pembuatan probe berlabel digoxin
Bahan :
 Ambion
 dATP, dCTP, dGTP, dTTP (all 100 mM: Thermo Fisher Scientific) DIG-dUTP
(1 mM: Sigma)
 OneTaq® DNA polymerase (New England Biolabs) atau Taq polymerase lainnya
 LacZ primers 5′-3′: LacZF: TTGAAAATGGTCTGCTGCTG, LacZR:
CGGATAAACGGAACTGGAAA
 Neo primers 5′-3′: NeoF: GCTATTCGGCTATGACTGGG, NeoR: GAA
GGCGATAGAAGGCGATG
 Plasmid containing relevant cassettes (Sequences in Supplemental text 1)
 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)
PCR digunakan untuk memasukkan nukleotida dUTP belabel digoxin (DIG) ke
dalam produk PCR untuk digunakan sebagai probe dalam analisis cold Southern blot.
Setaip vector target dari koleksi EUCOMM atau KOMP dapat digunakan sebagai
template PCR. Sebagai alternatif, urutan probe ditentukan dalam Supplemental text 1 dan
dapat disintesis secara komersial untuk digunakan sebagai template di masa depan.
Menyiapkan campuran dNTP berlabel dengan ditambahkan bahan berikut : 0,9 µl
dari masing-masing dATP, dCTP, dan dGTP (semua pada 100 mM), 0,72 µl dTTP (pada
100 mM), 18 µl DIG-dUTP (pada 1 mM), dan 23,58 µl H2O, hingga volume menjadi 45
µl. Campuran yang setara dNTP tanpa label juga harus dipersiapkan untuk reaksi kontrol
sebagai berikut : 0,9 µl untuk dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP (semuanya pada 100 mM)
dan 41,40 µl H2O, hingga volume akhir 45 µl. Menyiapkan campuran delapan reaksi
utama untuk probe neo dan lacZ dengan dNTP berlabel dan alikuot 50 µl per sumur
sebagai berikut : 80 µl 5x Buffer, 0,8 µl primer forward (100 µM), 0,8 µl reverse primer
 (100 µM), 40 µl dNTPs (2 mM,berlabel), 264,8 µl H2O, 8 µl plasmid yang mengandung
relevant cassette (500 ng/ µl), 2 µl Taq polymerase. Untuk setiap probe perlu disiapkan
reaksi control dengan dNTP tanpa label sebagai berikut: (50 µl untuk setiap kali reaksi)
10 µl 5x Buffer, 0,2 µl forward primer (100 µM), 0,2 µl reverse primer (100 µM), 5 µl
dNTPs (2 mM, tanpa label), 33, 4 µl H 2O, 1 µl 500 ng/ µl plasmid yang mengandung
relevant cassette, 0,25 µl Taq polymerase. Catatan: Jangan menggunakan DNA genom
hewan transgenic sebagai template PCR.
Running PCR dalam kondisi berikut : pada suhu 94°C selama 5 menit, siklus 42 pada
suhu 94°C selama 30 detik, 58°C selama 30 detik, 72°C selama 1 menit, kemudian 72°C
selama 10 menit, kemudian dipertahankan pada suhu 4°C. Hal tersebut untuk memastikan
apakah template telah kuat selama proses PCR dan apakah telah disisipkan ke DIG-label-
dUTP, dilakukan running 5 µl reaksi pelabelan setelah PCR tanpa label pada gel agarose
2% pada 10V selama 24 jam untuk melihat perbedaan yang jelas antar pita satu dengan
yang lainnya dapat dilihat pada gambar 2. Pada gel elektroforesis dibawah sinar UV,
produk berlabel (baris 1 dan baris 3 pada gambar 2) akan tampak lebih tebal daripada
produk tanpa label (baris 2 dan 4 pada gambar 2) sebagai hasil dari berat jenis yang diberi
label dengan digoxin. Purifikasi produk berlabel menggunakan gel Qiagen purification
kit, menggunakan 8 kolom untuk 8 reaksi PCR. Mencuci setiap kolom dengan 30 µl
buffer elution untuk probe neo. Running alikuot untuk memurnikan produk pada gel
agarose 2%. Probe dimurnikan menggunakan nanodrop atau metode spektrofotometri
lainnya dan disimpan pada suhu -20°C.

4. Digesti DNA genom

Bahan :

 Endonuklease restriksi dan Buffer yang sesuai (Enzim FastDigest dari Thermo
Fisher Scientific atau endonuclease restriksi standar dari New England Biolab)

 1,0 M spermidine (Menghilangkan enzim FastDigest)

 100x BSA (Biolabs New England)

 Untuk setiap reaksi, digest 20-25 µg DNA dalam volume akhir 85 µl

 Reaksi set up seperti berikut : 8,5 µl 10x Buffer, 1 µl 0,1 spermidin, 1 µl 100x
BSA jika ada dan 5 µl enzim restriksi, diinkubasi selama 5 jam sesuai prosedur
 pabrik. Untuk enzim restriksi standar, spike digest dan 1,5 µl enzim restriksi
diencerkan dalam Buffer 1x 13,5 µl di pagi hari dan didigest minimal 3 hingga 4
jam. Membekukan digest hingga siap untuk dilakukan Southern blotting.

5. Elektroforesis DNA digest

Bahan :

 6x loading dye: 10mM Tris HCl (pH 7,6) 0,03% bromofenol blue, 0,03 % xylen
cyanol FF, 60% gliserol, 60% EDTA.

 10x TAE: 400mM Tris, 200mM asam asetat, 10mM EDTA

 1% etidium bromida

 GenRuler DNA Ladder dikenal dengan ladder kecil, stok disesuaikan dengan 15
ng/ µl. GenRuler High Range DNA Ladder dikenal dengan ladder besar, stok
disesuaikan dengan 15 ng/ µl

 Seakem® LE agarose

Hari 1: menyiapkan sampel ladder sesuai dengan probe yang digunakan. Cukup
menyiapkan 3 sumuran ladder kecil (0,1-24 kb) dan 1 sumuran ladder besar (10-48 kb)
dan disimpan pada suhu 4°C sampai siap untuk diload:

Untuk gel lacZ: ladder kecil (20 µl stok ladder kecil, 57 µl 6x loading dye, 263 µl
H2O, ladder besar (1,5 µl stok ladder kecil, 28 µl 6x loadin dye, 135 µl H2O).

Untuk gel neo : ladder kecil (72 µl stok ladder kecil, 57 µl 6x loading dye, 211 µl
H2O), ladder besar (30 µl stok ladder kecil, 28 µl 6x loading dye, 111 µl H2O).

Volume ladder kecil dan besar dapat disesuaikan tergantung pada kekuatan ladder
pita setelah Southern dikembangkan. Sebagai contoh, jika ladder terlalu lemah,
pertambahan jumlah ladder untuk Southern berikutnya. Jika ladder terlalu kuat, misalnya
probe lacZ memiliki afinitas yang sangat kuat untuk ladder besar, menggunkan material
sedikit.
 Untuk gel elektroforesis 20 cm x 22,5 cm , menyiapkan 1 L dari 0,45% Seakem®
agarose dalam 1x TAE mendidih kemudian larutan didinginkan. Menambahkan larutan
40 µl etidium bromide saat larutan masih hangat dan biarkan gel mengering.

Setelah gel ditempatkan di tangki dan ditutup dengan 1x TAE, letakkan tanki gel di
atas magnetic stirrer dan magnetic flea dalam tangki (jangan hidupkan terlebih dahulu).
Lepaskan sisir dan masukkan sampel, menisi sumuran kosong dengan 1x loading dye.
Melakukan running semalaman pada 75 V (4°C) atau 40V (suhu kamar). Lalu nyalakan
spinner sekitar 4 jam setelah gel dimasukkan yang bertujuan untuk mengedarkan TAE
buffer semalaman.

6. Transfer DNA menuju membran dan immobilisasi

Bahan:

 Air MilliQ

 Larutan HCl hidrolisis (2 L per gel): 1978 ml H2O, 22 ml HCl fuming

 Pelet NaOH yang diencerkan di larutan 0,4 M H2O (2 L per gel)

 Kertas kromatografi Whatman 3 mm (persediaan lab scientific)

 GE healthcare Amersham Hybond N + membrane

Hari 2: Menyiapkan bahan untuk transfer semi kering : memotong Hybond N +

membrane seukuran gel, memotong selaput pada bagian pojok kiri atas, lalu memotong
3 lembar kertas saring Whatman dengan Panjang 1-2 cm lebih besar dari keduanya.
Catatan: lebih baik menyiapkan larutan terlebih dahulu sebelum gel divisualisasikan,
karena melarutkan pelletNaOH dapat memakan waktu. Jika bagian depan dye telah
mengalami running sebanyak ¾ dari panjang, kemudian gel dikeluarkan dan
divisualisasikan dengan uv illuminator.

Menempatkan gel di rocker tray bersih dan dicuci di atas rocker selama 10 menit
dengan 2 L larutan hidrolisis HCl. Memindahkan gel ke rocker tray yang bersih dan
cuci di atas rocker selama 20 menit dengan 2 L 0,4 M NaOH. Memindahkan gel ke tray
bersih dan mengulangi pencucian kedua selama 20 menit dengan 2 L 0,4 M NaOH,
 kemudian gel dikeluarkan dari tray yang bersih. Basahi membran Hybond N ke dalam
air MilliQ kemudian dilarutkan ke 0,4 M NaOH yang telah digunakan untuk mencuci.
Kemudian dilakukan proses transfer dengan menempatkan gel tray yang bersih diatas
membran, proses transfer berlangsung selama 4 jam. Mencuci tabung hibridisasi dalam
air MilliQ dan dibiarkan mengering selama 24 jam.

7. Hibridisasi dan Pencucian

Bahan:

 Buffer Digoxin Easy Hyb (Roche)

 20x Saline Sodium Sitrat (SSC): 3,0 M NaCl , 0,3 M sodim sitrat, pH 7

 Probe berlabel Digoxin(DIG) yang disimpan dalam suhu -20°C

 20% Sodium Dodesil Sulfat(SDS)

Hari 3 : Memastikan waterbath dan dua oven hibridisasi berada pada suhu yang
seusai (42°C untuk waterbath; 42°C untuk oven probe neo dan 40°C untuk oven probe
lacZ). Pendistribusian ke tabung Falcon 3x 25 ml Roche untuk setiap gel (dua pencucian
pre hibridisasi dan satu pencucian hibridisasi), dan letakkan tabung ke waterbath untuk
dipanaskan terlebih dahulu selama 20 menit sebelum memulai tahap selanjutnya.

Mengangkat pemberat, kain, dan kertas saring dari gel lalu buang. Gel dan selaput
dibalik kemudian diberi label posisi sumur gel pada membran menggunakan pencil.
Setelah sumuran telah ditandai pada membran, gel dapat dibuang. Ikatan silang DNA ke
membran dengan terpaparnya keuda sisi membran ke sinar UV 1200µJ menggunakan
Stratalinker. Menaruh membran ke tray bersih yang berisi 2 L 2x SSC dan cuci di atas
rocker selama 5 menit.

Mengisi tabung hibridisasi dengan 2x SSC dan pertahankan posisi tabung tegak agar
gelembung udara antara membrane dengan bagian dalam tabung hibridisasi berpindah ke
atas dan keluar dari larutan. Menuang 25 ml Roche yang sudah dipanaskan ke dalam
tabung, kemudian tabung ditaruh dalam oven hibridisasi dengan suhu 42°C (untuk probe
neo) atau oven yang sudah diatur pada suhu 40°C (untuk probe lacZ). Kemudian
dilakukan pra-hibridisasi selamakurang lebih 1 jam, mengulangi pra hibridisasi dengan
Roche yang telah dipanaskan selama 2 jam untuk memastikan bahwa semua SSC yang
tersisa hilang.

Sementara itu, panaskan 25 ml Roche dalam tabung falvcon pada suhu 42°C untuk
menghitung berpa banyak probe berlabel DIG yang dibutuhkan untuk 55 ng/ml lacZ dan
40 ng/ml untuk neo, dalam 25 ml Roche DIG. Mendenaturasi probe dengan
menempatkannya dalam tabung yang tertutup rapat dalam air mendidih selama 5 menit,
kemudian tabung langsung diletakkan di atas es selama 3 menit. Menambahkan probe
yang sudah didenaturasi ke Roche yang sudah dipanaskan sebelumnya. Mengganti
larutan pra hibridisasi dalam tabung hibridisasi dengan 25 ml larutan probe hibridisasi.
Hibridisasi pada 42°C (untuk probe neo) dan 40°C (untuk probe lacZ) selama 14 jam.

Menyiapkan larutan pencuci untuk keesokan harinya yang sesuai dengan probe yang
digunakan, harus berhati-hati untuk menghindari pengendapan bahan kimia dalam
larutan.

Untuk neo probe:

 2x 2L 2x SSC, 0,1%: SSC dibiarkan semalaman dalam suhu ruang dan

ditambahkan 10 ml SDS

 2x 2L 0,2x SSC, 0,1% SDS: diinkubasi selama semalam pada suhu 65°C

Untuk probe lacZ:

 2x 2L 2x SSC, 0,1% SDS: diinkubasi setiap komponen secara terpisah pada

suhu 37°C selama 24 jam lalu dicampurkan keesokan harinya.

 2x 2L 0,1x SSC, 0,1 SDS: diinkubasi pada suhu 65°C selama 24 jam.

Hari 4:

Bahan:

 5x asam maleat: melarutkan bubuk dalam air hangat, menyesuaikan pH

menjadfi 7,5 dengan 5M NaOH, ubah volume menjadi 2L dan saring apabila
perlu.
  1L 5M NaCl 10x

 BBR Block-1g BBR Reagent blocking (Sigma-Aldrich) dan 10ml 1x asam

maleat (pengenceran 1:5 dengan H2O). Jika membuat alikuot, tambahkan 25g
BBR ke 50ml asam maleat dan 200ml H2O. Membuat 10ml alikuot dan
disimpan di freezer. Alikuot dapat ditempatkan dalam waterbath pada suhu
42°C untuk mempercepat pencairan

 Buffer I (4x 2L) 1800 ml H2O, 200 ml 10x TBS, 6ml Tween 50/50

 Buffer III (2L) 1860ml H2O, 100ml Tris HCl pH 9,5, 40ml 5M NaCl

 Block (20ml per membrane) – 18ml Buffer I, 2ml 10x BBR

 Antibody (20ml per membrane) 18ml buffer I, 2ml 10x BBR, 2µl Anti-
Digoxigenin-AP Fab Fragmen

 CDP-Star (15ml per membrane) 15ml buffer III, 50µl CDP-Star

Meletakkan larutan cuci untuk probe yang sesuai di tray yang bersih, kemudian
mengambil tabung hibridisasi dari oven, dan mengeluarkan membrane ke dalam
waterbath sesuai dengan probe yang digunakan. Membran yang dianalisis dengan probe
yang sama dapat dicuci bersama, mencuci membrane selama 10 menit pada suhu kamar
dalam 2L 2X SSC, 0,1% SDS, disimpan pada suhu kamar (untuk neo) atau disimpan pada
suhu 37°C (untuk lacZ)., ulangi langkah tersebut di tray yang bersih.

Sementara itu, membuat 8L buffer I untuk satu hingga empat membrane dan
dibiarkan tertutup, dari titik tersebut membrane dapat dicuci bersama di tray setelah lepas
dari probe yang digunakan. Menambahkan 2L buffer I ke tray yang bersih, rendam,dan
cuci di atas rocker selama 5 menit agar seimbang. Menggulung membrane ke atas dan
ditempatkan satu per sat uke dalam tabung hibridisasi bersih. Tambahkan 20 ml blok ke
dalam tabung dan diinkubasi dalam oven hibridisasi pada suhu kamar (minimal 20 ° C)
selama 30 menit. Setelah pemblokiran, keluarkan tabung hibridisasi dari oven, tuangkan
balok dan tambahkan 20 ml larutan antibodi ke tabung. Inkubasi dalam oven hibridisasi
pada suhu kamar (minimal 20 ° C) selama 30 menit. Setelah inkubasi antibodi, keluarkan
membran dan tempatkan di tray bersih. Cuci di atas rocker selama 10 menit dalam 2L
 Buffer I. Pindahkan membran ke tray bersih dan cuci di atas rocker selama 20 menit
dalam 2L Buffer I. Siapkan larutan buffer III saat langkah inkubasi 1,5 jam berakhir, lalu
pindahkan membran ke tray bersih dan cuci di atas rocker di buffer III selama 5 menit
untuk menyeimbangkan.

8. Staining antibody dan mendeteksi sinyal

Potong selembar film plastik dengan ukuran lebih besar dari membran. Buka
lembaran plastik, tempatkan membran ke dalam lipatan dan lipat kembali plastik, lalu
mendorong keluar gelembung udara dengan tisu karena terlalu banyak tekanan dapat
merusak membran. Dengan hati-hati pastikan gelembung udara didorong keluar sebelum
menyegel kembali plastik dan menempatkannya di atas rocker selama 5 menit setelah
diinkubasi, potong sudut lain dari kantong plastik dan buang sebagian besar CDP-Star
dari kantong. Kemudian, keluarkan larutan CDP-Star sebanyak mungkin menggunakan
roller atau tisu dan segel kembali kantong dengan hati-hati di sekitar membran. Untuk
deteksi chemiluminescent dari sinyal, gunakan BioRad ChemiDoc ™ Touch Imaging
System, sesuai dengan petunjuk produsen atau autoradiografi.

Saat menggunakan sistem ChemiDoc ™ untuk visualisasi, letakkan membran dengan

DNA menghadap ke atas pada tary. Sesuaikan posisi membran untuk memastikan
pemaparan penuh. Membran dapat diamankan dengan selotip. Pilih 'Live View' dan
sesuaikan ukuran gambar menjadi besar. Di bawah 'Application' pilih 'Blots' dan
'Chemiluminescence'. Di bawah 'Exposure' pilih 'Manual' dan 'Configure Signal
Accumulation Mode'. Atur gambar pertama menjadi 600, gambar terakhir menjadi 3600
dan jumlah gambar menjadi 6. Ini akan mengambil satu gambar setiap 10 menit selama 1
jam. Tekan link eksposur. Setelah gambar diambil, mereka akan muncul di galeri dan
kemudian harus disimpan. Pilih gambar (biasanya eksposur 30 menit) dan sesuaikan
kecerahan / kontras. Ekspor gambar sebagai file .jpg. Gambar kemudian dapat dicetak
untuk mengukur ukuran pita.

9. Perbedaan protocol klasik menggunakan probe radioaktif

Probe berlabel radioaktif digunakan sebelum probe non-radioaktif dikembangkan,

dengan perbedaan pada keseluruhan protokol yang disajikan dalam tahapan berikut:
persiapan probe, pilihan standar berat molekul DNA, hibridisasi dan pencucian, dan
deteksi sinyal. Penggunaan yang tepat dari peralatan pelindung diri, pelindung dan
manajemen pembuangan bahan kimia harus diterapkan saat menggunakan bahan kimia
radioaktif.

9.1. Pembuatan Probe Radioaktif dan pemurnian

Bahan:

 Megaprime DNA labelling System, dCTP (Amersham)

 α-32P dCTP (37 MBq (ImCi; PerkinElmer).

 Nick-columns 50ST (GE Healthcare)

 TE: Tris-HCl 10 mM (pH7.5–8.0), disodium EDTA 1 mM

 Monocut lambda DNA molecular weight 0.5 μg/μl (New England Biolabs)

Fragmen DNA yang diberi label diperoleh dari PCR dengan primer standar. Produk

PCR dimurnikan dan diukur menggunakan Nanodrop atau metode berbasis

spektrofotometri lainnya. Panaskan waterbath pada suhu 100 ° C, kemudian siapkan

Eppendorf berikut: untuk setiap probe, sertakan 5 μl primer acak, 27 μl H2O, dan 1 μl

probe pada 25 ng / μl. Letakkan reaksi pada 100 ° C selama 5 menit, kemudian letakkan

di atas es selama 5 menit, sentrifus dengan cepat, kemudian simpan di atas es. Di atas es,

campur 10 μl labeling buffer dan 2 μl Klenow per reaksi dan menambahkan 12 μl

campuran ke setiap reaksi. Di daerah radioaktif, tambahkan 5 μl α- 32P dCTP (volume

total: 50 μl) dan inkubasi selama 30-45 menit pada 37 ° C. Probe dapat segera dimurnikan

atau disimpan pada suhu -20 ° C sampai murni.

Untuk pemurnian probe, setarakan kolom Nick dengan 3 ml TE. Tempatkan kolom

pada Eppendorf Safe-Lock 2 ml, dan 50 μl probe berlabel. Tambahkan 400 μl TE dan
biarkan mengalir. Tempatkan kolom pada tabung Safe-Lock 2 ml baru dan tambahkan

400 μl TE. Kumpulkan probe yang dimurnikan (periksa pelabelan dengan penghitung

atau hitung 1 μl). Periksa penggabungan nukleotida radioaktif dengan melambaikan

tabung di sebelah penghitung Geiger. Probe dapat disimpan pada suhu −20 ° C atau 4 ° C

jika akan digunakan pada hari yang sama.

9.2. Pemilihan berat molekul DNA standar

Ketika menggunakan probe radioaktif, untuk gel neo mengandung 3 sumuran

mengandung 3 μl GeneRuller DNA ladder, 1 μl monocut lamda 0,5 μg/μl (NEB) dan 26

blue 1x dan satu sumur dengan 10 μl GeneRuler High Range DNA dan 20 μl 1x loading

dye.

9.3. Pre hibridisasi, hibridisasi, dan pencucian

Bahan:

Rapid Hyb Buffer (GE Healthcare)

Membran dapat dikeringkan dan disimpan di antara kertas saring pada suhu 4°C

selama beberapa hari sebelum proses hibridisasi. Panaskan lebih dulu hingga 65°C Rapid

Hyb Buffer (10ml per probe). Siapkan membran setelah pemindahan: beri label pada pita

ladder dan sumur dengan pensil; potong dengan pisau bedah dan rendam dalam air suling.

Pindahkan membran ke roller yang berisi buffer hibridisasi yang dipanaskan sebelumnya

hingga 65 ° C. Inkubasi selama 20 menit hingga 1 jam pada suhu 65 ° C dalam oven

hibridisasi. Cairkan probe radioaktif jika sebelumnya dibekukan, untuk mengubah sifat

probe selama 5 menit pada suhu 95 ° C dalam blok pemanas dan pindahkan probe yang

telah didenaturasi dalam tabung hibridisasi, berhati-hatilah agar tidak menyentuh

membran. Hibridisasi selama 3 jam atau lebih (atau semalaman jika lebih nyaman) dalam

oven hibridisasi.
 Pencucian berikut dilakukan dengan 50 ml setiap larutan dalam tabung hibridisasi

pada suhu 65°C: 2× SSC; 0,1% SDS, masing-masing selama 15 menit; 0,1× SSC,

masing-masing 0,1% SDS selama 15 menit. Dua pencucian terakhir dapat dilakukan

dalam tray dengan agitasi. Pindai membran dengan penghitung radioaktif (tipe Canberra

MC21); sinyalnya harus sedikit terdengar. Jika sinyalnya terlalu kuat, lakukan pencucian

tambahan.

1.4. Hasil dan Pembahasan

Gambar 2. Analisis probe DIG dengan elektroforesis agarose

 Gambar 3. Contoh hasil Southern blot yang mengandung probe DIG

Gambar 4. Contoh 3 proyek hasil analisis Southern blot menggunakan probe radioaktif
Umumnya, dua atau tiga enzim restriksi (gambar 1), masing-masing didesain untuk
menghasilkan fragmen DNA yang mencakup segmen probe dan seluruh lengan homolog, dipilih
untuk setiap sisi pentargetan. Gambar 3 menunjukkan contoh hasil Southern blot yang diperoleh
dengan probe berlabel DIG dan DNA genom diekstraksi dari klon EUCOMM / KOMP yang
membawa alel tm1a. Menurut enzim yang diterapkan, setiap set enzim restriksi memiliki pola
yang diharapkan yang spesifik untuk lokus yang ditargetkan. Ukuran pita standar 17 kb, 10 kb
dan 8 kb dikenali oleh probe. Perbandingan pola migrasi berat molekul ladder memungkinkan
perkiraan ukuran setiap pita.
Ukuran pita yang diperoleh dengan enzim restriksi berbeda dibandingkan dengan pola
yang diharapkan ("Ukuran yang diharapkan" ditunjukkan di atas gambar membran pada Gbr. 3).
Ukuran sebenarnya dari setiap pita positif dibandingkan dengan nilai yang diharapkan.
Lingkaran hijau menandai baris dengan pita dengan ukuran yang diharapkan pada Gbr. 3 dan
sesuai dengan titik data "Lulus". Segitiga merah menunjuk ke bawah atau menunjuk ke atas
menandai pita positif masing-masing lebih kecil atau lebih besar dari ukuran yang diharapkan,
dan sesuai dengan titik data "Gagal". Sebuah klon divalidasi jika setidaknya dua digest yang
menghasilkan pita yang mencakup setiap lengan homologi acara penargetan menunjukkan pola
yang benar ("Lulus"); yaitu, dua titik data per lengan homologi, berjumlah empat. Jika dua
digesti restriksi yang terpisah menghasilkan pola yang tidak dapat diprediksi, klon tersebut tidak
diajukan untuk pembentukan chimera. Beberapa pita menunjukkan bahwa konstruksi penargetan
telah disisipkan beberapa kali ke dalam genom. Namun, mereka mungkin juga disebabkan oleh
digest DNA genom parsial. Oleh karena itu, beberapa insersi dipastikan secara meyakinkan jika
ditunjukkan oleh lebih dari satu kombinasi enzim. Pita dengan ukuran yang sangat besar (> 20
kb; misalnya, pada jalur yang ditandai dengan kotak kuning pada membran kiri pada Gambar 3)
mungkin turun ke destruksi parsial atau peristiwa rekombinasi yang menyimpang. Tidak adanya
pita (misalnya, pada jalur yang ditandai dengan kotak kuning pada membran sebelah kanan pada
Gambar 3) dapat disebabkan oleh DNA genom yang tidak cukup dimuat dalam sumur,
pengaturan ulang alel yang parah atau kegagalan untuk mencerna. Pita yang sangat besar dan
tidak adanya pita oleh karena itu merupakan titik data yang tidak meyakinkan. Klon yang
menampilkan tiga titik data "Lulus" dan satu "Gagal" diuji dengan enzim restriksi tambahan, jika
tidak ada klon lain dengan pola yang sepenuhnya benar yang sesuai dengan proyek yang sama
tersedia. Perhatian khusus diberikan pada kemungkinan penghambatan digest oleh metilasi DNA
genom ketika profil yang gagal sebagian ditafsirkan.
1.5. Kesimpulan
Penulis membuat protokol Southern blot yang mengandalkan probe universal untuk
menghindari persyaratan probe khusus dan menggunakan pelabelan non-radioaktif untuk
meningkatkan keselamatan operator. Validasi struktur keseluruhan rekombinasi homolog
sangat penting untuk memastikan kualitas pita mouse target yang baru dibuat