Blind Test Screening and Determination of Benzodiazepine Using Strip Test and Tlc-Spectrophotodensitometry

Indonesian Journal of Legal and Forensic Sciences 2020; 10 (1) : 1 – 15 e-ISSN 2657-0815, p-ISSN 1979-1763
http://ojs.unud.ac.id/index.php/ijlfs Asosiasi Ilmu Forensik Indonesia
BLIND TEST SCREENING AND DETERMINATION OF

BENZODIAZEPINE USING STRIP TEST AND TLC-
SPECTROPHOTODENSITOMETRY
I Putu Purba Teguh Grantica1, Made Dewi Widyastuti1,

Anak Agung Gde Jaya Santika1, Ni Putu Ayu Kristiara Dewi1
1
Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Udayana
Email: purbateguh99@gmail.com
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pengembangan metode analisis dengan
mengkombinasikan teknik immunoassay (strip test) dengan KLT-Spektrofotodensitometri dalam
melakukan skrining, konfirmasi, dan uji determinasi senyawa golongan benzodiazepine dalam sampel
urin. Metode penelitian yang dilakukan secara eksperimental terhadap sampel urin yang belum
diketahui senyawa yang terdapat dalam sampel tersebut, kemudian teknik immunoassay (strip test)
digunakan sebagai uji pendahuluan untuk mengetahui golongan senyawa yang terdapat dalam sampel
tersebut, kemudian dilanjutkan dengan preparasi sampel dengan teknik LLE (liquid liquid extraction)
menggunakan pelarut organik etil asetat dan dapar fosfat pH 6. Kemudian dilakukan konfirmasi
menggunakan metode KLT-Spektrofotodensitometri dengan menerapkan dua sistem fase gerak yaitu
sistem TE (etil asetat: metanol: amonia (85: 10: 5 % v/v/v)) dan TA (Metanol : Amonia pekat (100 :
1,5 %v/v)). Dilanjutkan dengan melakukan determinasi menggunakan metode KLT-
Spektrofotodensitometri dengan fase diam plat KLT silica gel GF254 nm dan fase gerak sistem TE.
Berdasarkan hasil yang diperoleh yaitu dari uji skrining dengan teknik immunoassay, sampel urin
positif mengandung senyawa golongan benzodiazepine, kemudian hasil dipertegas dengan uji
konfirmasi, yang mana sampel urin memang benar positif mengandung senyawa golongan
benzodiazepine dan terkonfirmasi senyawa flurazepam terdapat pada sampel tersebut. Selanjutnya,
dilakukan uji determinasi untuk mengetahui secara spesifik kadar flurazepam yang terdapat dalam
sampel, yang mana kadar yang diperoleh yakni 297,5480 µg/mL dan nilai ini berada di atas dosis letal
karena di dalam sampel mengandung flurazepam dengan kadar ≥50-200 µg/mL.
Kata kunci: Benzodiazepine, Uji Skrining, Uji Konfirmasi, Uji Determinasi, Immunoassay, KLT-
Spektrofotodensitometri
ABSTRACT
The aims of this research is to develop an analytical method by combining the immunoassay
technique (strip test) with TLC-Spectrophotodensitometry in screening, confirmation, and
determination test of benzodiazepine compounds in urine samples. The research method was done with
experimentally on unknown urine samples of compounds contained in the sample, then the
immunoassay technique (strip test) was used as a preliminary test to determine the class of compounds
contained in the sample, then proceed with sample preparation with the LLE (liquid-liquid extraction)
using organic solvent ethyl acetate and phosphate buffer pH 6. Then the confirmation test is using the
TLC-Spectrophotodensitometry method by applying two mobile phase systems namely TE (ethyl
1
I Putu Purba Teguh Grantica, Made Dewi Widyastuti, Anak Agung Gde Jaya Santika,
Ni Putu Ayu Kristiara Dewi
Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Udayana
acetate: methanol: ammonia (85: 10: 5% v / v / v)) and TA (Methanol: concentrated ammonia (100:
1.5% v / v)). Followed by doing the determination test using the TLC-Spectrophotodensitometry
method with the stationary phase is TLC silica gel GF254 nm and TE system for the mobile phase.
Based on the results obtained from the screening test with immunoassay technique, urine samples
positive contain benzodiazepine compounds, then the results are confirmed by a confirmation test, in
which the urine sample is indeed positive containing benzodiazepine group compounds and confirmed
flurazepam compounds are present in the sample. Next, the determination test was carried out to
determine specifically flurazepam’s concentration contained in the sample, where the concentration
obtained was 297.5480 µg/mL and this value was above the lethal dose because in the sample
contained flurazepam with levels ≥50-200 µg/mL.
Keywords: Benzodiazepines, Screening Test, Confirmation Test, Determination Test, Immunoassay,
TLC-Spectrophotodensitometry
PENDAHULUAN
Benzodiazepine merupakan obat bekerja sebagai obat penenang sering
golongan psikotropika yang disalahgunakan, sehingga diperlukan
memberikan efek sedasi dan pada pengawasan yang ketat terkait
umumnya diresepkan sebagai obat penyalahgunaan obat-obatan
anti depresi, anestesi, dan golongan benzodiazepine tersebut.
antikonvulsan dengan mekanisme Identifikasi kasus-kasus forensik
yaitu meningkatkan kerja dari terkait penyalahgunaan obat ini,
neurotransmitter gamma memerlukan metode yang sensitif dan
aminobutyric acid (GABA-A) pada efektif untuk mendeteksi dan
reseptor GABA [1]. Menurut UU RI mengidentifikasi keberadaan senyawa
No. 5 Tahun 1997 tentang ini dalam matriks biologis.
Psikotropika, kelompok obat Matriks biologi yang umumnya
benzodiazepine termasuk ke dalam digunakan dalam pemeriksaan
psikotropika golongan IV. psikotropika yaitu urin. Urin
Benzodiazepine adalah kelompok merupakan salah satu spesimen
obat yang paling lazim untuk pilihan karena keberadaan obat dan
diresepkan dan sering ditemukan metabolitnya di urin relatif tinggi.
dalam kasus toksikologi, serta Selain itu, sampel urin merupakan
beberapa kasus penyalahgunaan. sampel yang paling mudah dan stabil
Diazepam (valium), bromazepam untuk pemeriksaan. Dalam
(lexotan), klordiazepoksid (librium), melakukan pemeriksaan
dan nitrazepam (mogadon) benzodiazepine pada kasus-kasus
merupakan jenis golongan forensik, terdapat beberapa tahapan
benzodiazepin yang paling banyak uji yang penting dilakukan untuk
disalahgunakan [2]. membuktikan apakah korban benar
Pada beberapa kasus forensik, telah melakukan penyalahgunaan,
obat golongan benzodiazepine yang diantaranya yaitu uji skrining, uji
2
konfirmasi, dan uji determinasi. murah. Salah satu metode yang dapat
Salah satu teknik immunoassay, diterapkan yaitu KLT-
yaitu strip test merupakan salah satu Spektrofotodensitometri.
metode untuk uji skrining yang telah KLT-Spektrofotodensitometri
digunakan secara umum dalam merupakan metode analisis yang
analisis suatu zat terlarang dalam didasarkan pada prinsip interaksi
sampel materi biologis. Teknik ini radiasi elektromagnetik (REM)
menggunakan antidrug - antibodi dengan analit yang berupa bercak atau
untuk mengidentifikasi obat dan noda pada plat [6]. Metode KLT-
metabolitnya yang terdapat di dalam Spektrofotodensitometri memiliki
sampel (materi biologis) [3]. Hasil uji kelebihan yaitu diantaranya
skrining dapat dijadikan sebagai pengerjaan relatif mudah dan cepat
petunjuk dan dasar dugaan, tetapi karena dapat digunakan untuk analisis
belum dapat dijadikan suatu barang beberapa senyawa dalam sekali
bukti yang kuat dalam pengadilan running (simultan), memiliki
bahwa seseorang telah mengonsumsi spesifisitas yang cukup tinggi, biaya
zat terlarang [2]. Hal ini dikarenakan pengoperasian relatif murah, dan
uji skrining belum mampu jumlah pelarut yang digunakan relatif
memberikan informasi mengenai jenis sedikit [7]. Oleh karena itu, tujuan
senyawa spesifik yang terkandung dari penelitian ini yaitu untuk
dalam sampel, sehingga perlu melakukan pengembangan metode
dilakukan uji konfirmasi untuk analisis dengan mengkombinasikan
mengetahui jenis senyawa spesifik teknik immunoassay (strip test)
yang dianalisis dan uji determinasi dengan KLT-Spektrofotodensitometri
untuk menentukan kadar dari dalam melakukan uji skrining, uji
senyawa yang terkonfirmasi tersebut. konfirmasi, dan uji determinasi
Berdasarkan penelitian senyawa golongan benzodiazepine
sebelumnya, sudah pernah dilakukan dalam sampel urin.
uji konfirmasi dan determinasi untuk
senyawa golongan benzodiazepine
METODE PENELITIAN
dengan menggunakan metode HPLC
DAD [4]. Metode HPLC ini memiliki Bahan dan Peralatan
kekurangan yaitu membutuhkan Alat-alat yang digunakan dalam
pelarut dengan grade HPLC yang penelitian ini yaitu satu set instrumen
banyak sehingga memerlukan biaya vortex, alat-alat gelas, Chamber,
yang mahal [5]. Oleh karena itu perlu CAMAG TLC-Visualizer, CAMAG
adanya pengembangan metode TLC-Scanner 4, neraca analitik, dan
dengan hasil yang baik dan pipet kapiler.
membutuhkan biaya yang lebih
3
Serta bahan yang digunakan Hasil positif ditunjukkan dengan

adalah sampel urin (Blind spike munculnya strip pada zona C dan
sample), tissue, pelarut tidak munculnya strip pada zona T.
diklorometana, flurazepam, Hasil tidak valid apabila tidak
isopropanol, amonimum hidroksida, munculnya strip pada zona C.
aquadest, metanol, NaC2H2O3,
CH3COOH, KH2PO4, NaOH, HCl, Uji Ekstraksi Benzodiazepine
KH2PO4, NaOH, diazepam, Pembuatan Larutan Buffer Fosfat
nordiazepam, etil asetat, Plat KLT pH 6
Silika Gel GF254, amonia 25%, Pembuatan buffer fosfat
toluene, aseton, etanol. dilakukan dengan mengukur KH2PO4
sebanyak 0,05 mL dan memipet
larutan NaOH 2N sebanyak 0,0056
Metode mL. Kemudian kedua larutan tersebut
Uji Skrining Golongan Senyawa ditempatkan dalam labu ukur 5 mL.
Benzodiazepine dalam Sampel Urin Diad aquadest hingga tanda batas 5
Sampel spesimen urin yang mL.
digunakan yaitu urin yang diperoleh
dari RS Bali Jimbaran, yang mana Pembuatan Larutan Stok
sampel urin dikumpulkan pada wadah Konsentrasi 500 ppm
yang bersih dan kering, diperhatikan Ditimbang standar senyawa
adanya endapan. Urin yang golongan benzodiazepam, meliputi 7-
mengandung endapan disentrifugasi amino-flunitrazepam, diazepam, dan
dan disaring. Sampel urin yang telah nordiazepam. Ditimbang 5 mg
siap dimasukkan secukupnya kedalam masing-masing senyawa, dilarutkan
beaker glass. Disiapkan strip test dengan aquadest dalam beaker glass
untuk masing-masing senyawa. Strip hingga larut. Larutan di tempatkan
test dicelupkan ke dalam sampel urin, dalam labu ukur 10 mL, lalu
ditunggu hingga urin bermigrasi, ditambahkan dengan aquadest hingga
dijaga agar tidak melewati batas tanda batas 10 mL.
maksimum strip test. Diamkan strip
test beberapa saat pada tempat datar Pembuatan Larutan Baku 10 ppm
yang tidak menyerap air. Lakukan Dipipet 0,2 mL larutan stok
pembacaan pada strip test masing-masing senyawa, diantaranya
Hasil negatif ditunjukkan dengan adalah stok 7-amino flurazepam,
dua strip, yaitu satu strip pada zona C diazepam dan nordiazepam ke dalam
dan satu strip pada zona T. Hasil labu ukur 10 mL. Diad dengan
negatif diakibatkan konsentrasi aquadest hingga tanda batas.
senyawa berada dibawah nilai cut-off.
4
Dimasukkan kedalam vial dan diberi dengan masing-masing ukuran 10 x

label. 10 cm, sedangkan untuk sistem TE
yaitu dengan fase diam silika gel yang
Pembuatan Sampel Spike Placebo diimpregnasi dengan 0,1 M KOH
Dipipet 0,125 mL larutan baku dalam metanol dan dikeringkan.
10 ppm dari senyawa 7-amino-
flurazepam, diazepam, dan Pembuatan Larutan Stok Senyawa
nordiazepam. Dimasukkan ke dalam Standar
labu ukur 5 mL, diad dengan urin Masing-masing senyawa (Morfin,
hingga tanda batas. Digojog hingga Kafein, Papaverin HCl, Kodein,
homogen, dimasukkan kedalam botol Bromheksin, Teofilin,
vial dan diberikan label. Dekstrometorfan) ditimbang 10 mg
dan ditempatkan dalam labu ukur 10
Ekstraksi Sampel dengan Metode mL. Diad metanol secukupnya sampai
Liquid-liquid Extraction (LLE) larut lalu ditambahkan hingga tanda
Sampel urin spike placebo batas.
sebanyak 1 mL dimasukkan kedalam
labu vortex, ditambahkan dengan 100 Pembuatan Larutan Pengoreksi
µLbuffer fosfat pH 6. Kedalam hRf (100 ng/ µL)
sampel ditambahkan dengan 0,5 mL a) Larutan Pengoreksi hRf sistem
etil asetat. Larutan kemudian divortex TA:
selama 15 menit. Setelah kedua fase Dibuat larutan pengoreksi hRf
memisah, diambil fase etil asetat (fase sistem TA dengan memipet stok
etil asetat 1), ditampung dalam vial larutan standar MDMA, Nitrazepam,
dan diberikan label. Fase air yang Morfin HCl, Codein Fosfat,
diperoleh ditambahkan dengan 100 Trimetoprim, Flurazepam,
µL NaOH 1 M, kemudian Bromazepam, Teofilin, Papaverin
ditambahkan dengan etil asetat HCl, Clordiazepoxid, Diazepam,
sebanyak 0,5 mL. Dilakukan vortex Efedrin HCl, Bisacodyl sebanyak 0,5
kembali selama 15 menit. Fase mL dan diad dengan metanol pada
organik yang diperoleh kemudian labu ukur 5 mL.
dimasukkan kedalam botol vial dan b) Larutan Pengoreksi hRf sistem
diberi label (fase etil asetat 2). TE:
Dibuat larutan pengoreksi hRf
Uji Konfirmasi Benzodiazepine sistem TE dengan memipet stok
dalam Sampel Urin larutan standar MDMA, Nitrazepam,
Preparasi Fase Diam Morfin HCl, Codein Fosfat,
Disiapkan fase diam berupa plat Trimetoprim, Flurazepam,
silika gel GF254 untuk sistem TA Bromazepam, Teofilin, Papaverin
5
HCl, Clordiazepoxid, Diazepam, dielusi dalam chamber yang telah

Barbital, Phenobarbital, Allobarbital dijenuhkan dengan masing-masing
sebanyak 0,5 mL dan diad dengan fase gerak. Setelah dilakukan elusi
metanol pada labu ukur 5 mL. hingga batas atas, plat KLT diangin-
anginkan hingga kering. Dideteksi
Pembuatan Fase Gerak dengan TLC-Visualizer pada sinar UV
a) Prosedur Fase Gerak Sistem TA: 254 nm, sinar putih, dan sinar UV
Dipipet 9,85 mL Metanol dan 366 nm. Dilakukan pencocokan
0,15 mL Amonia pekat, kemudian spektrum sampel pada library pada
ditempatkan dalam labu ukur 10 mL. aplikasi WinCats. Kemudian dihitung
Digojog hingga homogen. harga hRf dan hRfc dari masing-
b) Prosedur Fase Gerak Sistem TE: masing senyawa.
Dipipet 4,36 mL Etil asetat, 5,39
mL Metanol, dan 0,26 mL Amonia Uji Determinasi Benzodiazepine
25% kemudian ditempatkan dalam dari Sampel Urin
labu ukur 10 mL. Preparasi Fase Diam
Disiapkan fase diam berupa plat
Pembuatan KOH 0,1 M silika gel GF254 dengan ukuran 20 x
Ditimbang KOH sebanyak 0,28 10 cm.
gram. Kemudian dimasukkan ke
dalam beaker glass. Lalu dilarutkan Penyiapan Fase Gerak Sistem TE
dengan aquadest secukupnya. Diaduk Dipipet 21,25 mL Etil asetat, 2,5
hingga KOH larut semua. mL Metanol, dan 1,25 mL Amonia
Ditempatkan larutan tersebut ke 25% kemudian ditempatkan dalam
dalam labu ukur volume 50 mL, Diad labu ukur 25 mL. Digojog hingga
aquadest sampai tanda batas. Digojog homogen.
hingga homogen.
Pembuatan Larutan Standar
Analisis dengan Metode KLT- Flurazepam 5 mg/mL
Spektrofotodensitometri Ditimbang sebanyak 50 mg
Proses pemisahan dilakukan standar Flurazepam, ditempatkan ke
dalam 2 chamber untuk 2 sistem fase dalam beaker glass. Serbuk dilarutkan
gerak. Chamber 1 dijenuhkan dengan dengan metanol, dimasukkan ke
fase gerak sistem TA dan chamber 2 dalam labu ukur 10 mL, diad dengan
dijenuhkan dengan fase gerak sistem metanol hingga tanda batas 10 mL.
TE. Sampel hasil ekstraksi cair-cair
dan senyawa standar ditotolkan pada Pembuatan larutan Seri
kedua plat KLT sebanyak 10 µL. Flurazepam Konsentrasi 200
Kemudian masing-masing plat KLT µg/µL; 500 µg/µL; 1000 µg/µL;
6
1500 µg/µL; 2000 µg/µL; 2500 psikotropika di masyarakat. Pada

µg/µL. analisis toksikologi forensik, pada
Pembuatan Larutan Seri umumnya target analisis (racun) tidak
Flurazepam dilakukan dengan diketahui dengan pasti sebelum
melakukan pemipetan larutan stok dilakukan analisis. Oleh karena itu,
Flurazepam 5000 μg/mL masing- dilakukan uji skrining atau uji
masing 0,2 mL; 0,5 mL; 1 mL; 1,5 penapisan untuk mengetahui
mL; 2 mL, dan 2,5 mL. Masing- golongan senyawa yang terkandung
masing dimasukkan ke dalam labu dalam sampel yang dianalisis.
ukur 5 mL. Ditambahkan metanol Uji skrining terhadap sampel
hingga tanda batas. Digojog hingga biologis berupa urin yang diduga
homogen dan dipindahkan ke dalam mengandung senyawa narkotika dan
botol vial. psikotropika yang mana uji skrining
dilakukan untuk mengetahui golongan
Analisis dengan Metode KLT- senyawa yang terdapat pada sampel
Spektrofotodensitometri urin. Hasil uji skrining dapat
Ditotolkan masing – masing dijadikan sebagai petunjuk dan dasar
larutan seri dan sampel sebanyak 10 dugaan, tetapi belum dapat dijadikan
µL pada plat KLT sehingga diperoleh suatu barang bukti yang kuat dalam
konsentrasi larutan seri dalam totolan pengadilan bahwa seseorang telah
yakni 1000-10.000 ng/spot. Setelah mengonsumsi zat terlarang. Hal ini
semua seri dan sampel ditotolkan dan dikarenakan uji skrining belum
dielusi, dideteksi pada TLC- mampu mendeteksi atau
Visualizer pada sinar UV 254 nm, menunjukkan jenis senyawa spesifik
sinar putih, dan sinar UV 366 nm, yang terkandung dalam sampel [3].
kemudian dideteksi kembali pada Sebelum melakukan uji skrining,
panjang gelombang maksimum terlebih dahulu dilakukan tahap
flurazepam yang diperoleh. persiapan sampel yang meliputi
pemerikaan organoleptis pada sampel
HASIL DAN PEMBAHASAN urine yang mana dari volume total
Dewasa ini penyalahgunaan obat- urin diambil 5 mL urine untuk
obatan narkotika dan psikotropika diamati. Secara organoleptis sampel
marak terjadi di masyarakat urin yang dianalisis berwarna kuning
Indonesia. Hal ini tidak saja menjadi agak keruh dan berbau normal tidak
masalah hukum namun akan menjadi tercium bau obat-obatan. pH sampel
masalah pada bidang kesehatan. Oleh diukur menggunakan indikator pH
karena itu, diperlukan keterlibatan universal dan diperoleh pH urine
ahli forensik dalam menanggulangi sebesar 6. Hal ini menunjukkan
peredaran senyawa narkotik dan bahwa pH urine yang dianalisis
7
termasuk pH urine normal sehingga enzim enzim dalam alat uji skrining
uji skrining dapat dilanjutkan. Nilai terkadang membentuk ikatan tidak
pH urine normal adalah 4,4-8,0 [8]. spesifik dengan suatu zat/obat akibat
Uji skrining pada kesempatan ini adanya kemiripan struktur zat/obat
dilakukan dengan metode tersebut dengan golongan narkotika
immunoassay menggunakan strip test dan psikotropika yang akan diuji.
yang spesifik dengan senyawa Dimana reaksi silang yang mungkin
golongan amfetamin, benzodiazepine, terjadi dengan golongan
barbiturate, dan opiat. Mekanisme benzodiazepine adalah oxaprozin dan
kerja dari strip test adalah bedasarkan setraline (zoloft) [2]. Sedangkan, hasil
ikatan antigen antibodi. Prinsip dari negatif palsu dapat disebabkan karena
strip test yaitu apabila IgG anti- kadar senyawa narkoba pada urine
narkoba-substrat telah jenuh oleh lebih rendah dari nilai cut off dari
narkoba sampel, maka IgG anti- strip test yang digunakan [10].
narkoba-substrat tidak akan berikatan
dengan narkoba-enzimnya, sehingga
tidak terjadi reaksi enzim-substrat
yang menghasilkan warna (sampel
positif narkoba), dan begitu pula
sebaiknya, jika IgG anti-narkoba-
substrat berikatan dengan narkoba-
enzimnya secara menyeluruh atau
sebagian, maka akan terjadi reaksi
enzim-substrat yang berwarna penuh
(gelap) atau lamat-lamat (ragu-ragu). Gambar 1. Hasil Pengamatan
[9]. Sampel Menggunakan Strip Test
Hasil uji skrining yang dilakukan Positif Benzodiazepine dan Strip Test
pada penelitian ini menunjukkan hasil Negatif Barbiturat
bahwa strip test untuk golongan
benzodiazepine menunjukkan hasil Tahap analisis selanjutnya adalah
positif yaitu terdapat hanya terdapat 1 tahap ekstraksi sampel dengan
strip berwarna merah pada zona C menggunakan metode LLE. Ekstraksi
pada strip test. Namun, hasil dari cair-cair (LLE) merupakan suatu cara
pemeriksaan strip test ini masih ekstraksi yang bertujuan untuk
mungkin merupakan hasil positif preparasi sampel untuk memisahkan
ataupun negatif palsu. Hasil positif analit dari komponen-komponen
palsu dapat disebabkan oleh adanya pengotor yang mungkin mengganggu
reaksi silang (cross reaction) [3]. saat dilakukan deteksi maupun
Reaksi silang dapat timbul karena kuantifikasi analit. LLE dapat
8
dikatakan pula dengan proses flurazepam dan bromazepam,

ekstraksi yang memanfaatkan penentuan juga dilakukan terhadap
perbedaan kelarutan zat yang akan metabolit aktif dari diazepam dalam
dipisahkan diantara dua atau lebih urin, yaitu dismetildiazepam,
pelarut yang memiliki polaritas yang oxazepam dan tenazepam.[1]
berbeda. Prinsip dari LLE yaitu Benzodiazepine merupakan senyawa
melarutkan secara sempurna target yang memiliki pKa dengan rentang
analit dan hanya sedikit melarutkan dari asam hingga basa (3,5 – 11,6).
atau bahkan memisahkan senyawa Berdasarkan penentuan ini, digunakan
lain (pengotor) yang akan kondisi ekstraksi dengan pH 6 untuk
mengganggu analisis lebih lanjut [5]. menjamin senyawa benzodiazepine
Di samping itu, ekstraksi pelarut juga dalam sampel dapat terekstraksi
berfungsi untuk memekatkan analit seluruhnya. pH tersebut dapat
yang ada dalam sampel dengan menjamin bahwa senyawa golongan
jumlah kecil sehingga mempermudah benzodiazepine yang terdapat dalam
dalam deteksi atau kuantifikasi analit sampel tetap berada pada bentuk tak
[11]. Pertimbangan pemilihan pelarut terionnya, sehingga memiliki
pengekstraksi adalah sifat fisiko kelarutan cenderung ke pelarut
kimia terutama kelarutan dari organik. Buffer fosfat pH 6 digunakan
senyawa-senyawa yang diduga untuk menjamin kondisi pelarut yang
terdapat dalam sampel. Kelarutan digunakan untuk ekstraksi tetap
senyawa derivat benzodiazepine memiliki pH ± 6. Pelarut organik
seperti diazepam yaitu sedikit larut yang digunakan untuk ekstraksi
dalam air, larut dalam 25 bagian adalah etil asetat. Tujuan dibawanya
etanol, dalam 2 bagian kloroform dan analit kedalam pelarut organik adalah
39 bagian eter. Memiliki pKa 3,5; 3,3 untuk mempermudah proses preparasi
[12]. sampel setelah ekstraksi, yaitu pada
Fraksi yang diambil dari proses proses penguapan. Etil asetat
ekstraksi cair-cair terhadap sampel memiliki titik didih 77,1oC,
adalah fraksi organik. Hal ini sedangkan aquadest sebagai fase air
didasarkan oleh perhitungan jumlah memiliki titik didih 100oC [13]. Hal
senyawa yang terion dan takterion tersebut mengakibatkan lebih
yang diperoleh dari perhitungan mudahnya fase organik menguap
menggunakan persamaan dari Hukum dibandingkan dengan fase air dan
Handelson-Hasselbach. Perhitungan mengakibatkan waktu serta suhu
dilakukan terhadap senyawa yang pemanasan yang digunakan lebih
paling banyak penggunaannya di rendah, sehingga mampu
Indonesia diantaranya yaitu diazepam memperkecil peluang kehilangan
(valium), nitrazepam (mogadon), analit yang diakibatkan oleh
9
pemanasan berlebih. Hasil yang meminimalisir kesalahan hasil

diperoleh berupa fase air untuk ketiga konfirmasi yang mungkin terjadi.
replikasi diperoleh sebanyak 2 mL Nilai yang digunakan untuk
dan fase organik untuk ketiga konfirmasi senyawa uji adalah
replikasi diperoleh sebanyak 1 mL. perbandingan antara nilai hRfc
Uji konfirmasi dilakukan dengan standar dan hRf analit. Faktor-faktor
menggunakan metode KLT- yang dapat mempengaruhi harga hRf
Spektrofotodensitometri. Penggunaan adalah struktur kimia senyawa yang
KLT-Spektrofotodensitometri dapat dipisahkan (pengaruh pH atau tidak),
menganalisis kualitatif dengan sifat penyerapan, ketebalan dan
membandingkan parameter nilai Rf. kerapatan lapisan penyerap
Dua senyawa dapat dikatakan identik (adsorben), teknik pemisahan, pelarut
apabila memiliki nilai Rf yang sama (fase gerak), derajat kejenuhan, suhu
bila diukur pada kondisi analisis yang dan jumlah cuplikan [14]. Oleh
sama. Selain itu, analisis kualitatif karena itu, keterampilan seorang
dengan metode ini juga dapat analis dan kondisi lingkungan sangat
memanfaatan spektrum pada Library berpengaruh terhadap hasil yang
Street Drugs dari Camag sebagai uji diperoleh.
konfirmasi yaitu dengan Tabel 1. Hasil Uji Konfirmasi dengan
membandingkan spektrum analit Sistem TE
sampel dengan spektrum pustaka. Track hRf hRfc
Adanya perubahan terhadap nilai Rf Teofilin 16 11
yang dapat disebabkan oleh faktor Morfin 24 20
lingkungan ataupun fase diam yang Kodein 36 35
digunakan, maka analisis kualitatif Trimetrofin 43 45
dilakukan dengan memanfaatkan nilai Papaverin 68 69
hRf terkoreksi (hRfc). Keuntungan HCl
hRfc dibandingkan dengan harga hRf Sampel LLE 65 55,12 –
adalah nilai hRfc lebih konsisten 77,12
dengan variasi faktor-faktor
lingkungannya, sehingga dapat Hasil konfirmasi terhadap
digunakan sebagai data yang lebih senyawa yang terdapat dalam sampel
akurat dari senyawa yang dianalisis. pada sistem TE meliputi flurazepam
Analisis dilakukan dengan (hRfc = 71), nitrazepam (hRfc = 64),
menggunakan 2 fase gerak, bromazepam (hRfc = 63) dan
diantaranya adalah sistem TE dan diazepam (hRfc = 76) dikarenakan
sistem TA. Konfirmasi senyawa keseluruhan nilai hRfc dari senyawa
dilakukan dengan menggunakan dua tersebut memasuki rentang hRfc
sistem, hal ini dilakukan untuk
10
senyawa dengan error window sistem Hasil yang diperoleh dari

TE yaitu 11 sehingga diperoleh hasil penentuan dengan sistem TA dengan
seperti pada Tabel 1. Hasil error window 9 adalah rentang hRfc
dikonfirmasi dengan membandingkan analit seperti yang terdapat pada
spektrum yang diperoleh dari sampel Tabel 2. Nilai hRfc dari senyawa
dengan spektrum standar dari masing- yang masuk kedalam rentang ini
masing senyawa yang digunakan adalah flurazepam (hRfc = 62),
dalam sistem TE. Hasil overlapping clordiazepoxide (hRfc = 62), dan
spektrum ini menunjukkan bahwa bromazepam (hRfc= 61). Penentuan
spektrum yang paling mendekati dilakukan dengan melaukan
spektrum analit dalam sampel ada overlaping spektrum antara senyawa
flurazepam dengan nilai korelasi yang standar dengan analit pada sistem TA.
diperoleh lebih besar dari 0,9 Hasil yang diperoleh menunjukkan
(Gambar 2). analit merupakan flurazepam dengan
nilai korelasi spektrum diatas 0,9.
Gambar 2. Spektrum Flurazepam Gambar 3. Spektrum Flurazepam

(ungu) dengan Sampel (hijau) pada (ungu) dengan Sampel (merah) pada
Sistem TE sistem TA
Berdasarkan hasil uji konfirmasi
Tabel 2. Hasil Uji Konfirmasi dengan dengan penentuan nilai hRfc pada 2
Sistem TA, Error Window = 9 sistem fase gerak dan overlapping
Track hRf hRfc spektrum diketahui bahwa senyawa
Efedrin 37 30 yang terdapat pada sampel adalah
Codein fostat 42 33 senyawa flurazepam. Hasil ini
Morfin 42 37 kemudian dijadikan acuan sebagai
Trimetoprim 66 55 analisis untuk uji konfirmasi, sebagai
Bisacodyl 76 74 penentuan kadar analit yang terdapat
Sampel LLE 67 47,9 – dalam sampel.
65,9 Metode uji determinasi yang
digunakan adalah metode KLT-
Spektrofotodensitometri dengan
menggunakan sistem TE. Sistem TE
11
dipilih karena menghasilkan 400 ng - 5000 ng. Pemilihan

pemisahan yang baik dan peak yang konsentrasi larutan seri didasarkan
dihasilkan paling baik dibandingkan atas perbandingan AUC dari standar
sistem TA. Sehingga pada uji sampel LLE yang ditotolkan pada uji
determinasi ini digunakan sistem TE konfirmasi yang dapat dilihat pada
yang diharapkan mampu menetapkan Tabel 3.
kadar flurazepam dengan akurat.
Pada tahap determinasi,
digunakan larutan seri dengan rentang
Tabel 3. Hasil AUC Determinasi Flurazepam

Kons. larutan Kons.
Senyawa Totolan AUC
(ng/µL) totolan (ng)
Seri 1 200 2 µL 400 3877,5
Seri 2 500 2 µL 1000 8115,2
Seri 3 1000 2 µL 2000 12869,9
Seri 4 1500 2 µL 3000 16593,2
Seri 5 2000 2 µL 4000 18766,9
Seri 6 2500 2 µL 5000 23696,6
Sampel I - 3 µL - 7102,1
Sampel II - 3 µL - 6957,3
Sampel III - 3 µL - 6808,7
Berdasarkan dari kurva kalibrasi

Kurva Kalibrasi pada Gambar 5, dapat ditentukan
nilai LOD dan LOQ (batas deteksi
20000
dan batas kuantifikasi) dari
AUC
10000
determinasi flurazepam. Hasil yang
0 diperoleh LOD sebesar 379,395 ng
0 1000 2000 3000 dan LOQ sebesar 1264,642 ng.
y = 5.5319x + 2018Konsentrasi (ng) Setelah itu, dilakukan penetapan
R² = 0.9879
kadar flurazepam dalam sampel LLE.
Gambar 4. Kurva Kalibrasi Regresi Kurva kalibarasi (Gambar 5) yang
Linier Flurazepam diperoleh juga digunakan untuk
12
menentukan kadar analit yang dalam sampel urin manusia yang telah
terdapat dalam sampel LLE urin. diberikan flurazepam (Dalmane®)
Hasil penetapan kadar dapat dilihat sebelumnya yaitu sebesar 29,7
pada Tabel 4. µg/mL, yang mana masih berada di
bawah dosis letal dari flurazepam
Tabel 4. Hasil Penetapan Kadar yaitu sebesar 50-200 µg/mL [16].
Flurazepam Sedangkan hasil penelitian ini
Sampel Kadar Konsentrasi menunjukkan bahwa kadar
dalam Analit flurazepam yang diperoleh yaitu
Totolan dalam sebesar 297,548 µg/mL yang mana
(ng) Sampel berada jauh di atas dosis letal dari
(µg/mL) flurazepam sehingga diduga sampel
I 919,0487 306,3495 urin yang digunakan yaitu urin dari
II 892,873 297,6243 pasien overdosis flurazepam yang
III 866,011 288,6703 penggunaannya dapat diketahui
Konsentrasi rata-rata 297,5480 sebagai penyalahgunaan flurazepam
Flurazepam sebagai obat oral yang bahkan dapat menimbulkan
untuk penatalaksanaan insomnia kematian karena kadar flurazepam
jangka pendek memiliki dosis lazim yang ditemukan dalam sampel urin
dewasa yaitu 15-30 mg di malam hari jauh di atas dosis letal flurazepam.
dan untuk anak-anak usia lebih dari Penyalahgunaan dengan cara
15 tahun yaitu 15 mg di malam hari. mengonsumsi golongan
Lebih dari 50% dari total dosis benzodiazepin seperti flurazepam
flurazepam diekskresikan melalui urin telah diatur dalam UU RI No. 5
dalam 24 jam. Metabolit utama urin Tahun 1997 tentang Psikotropika.
adalah hidroksietil flurazepam Sesuai dengan perubahan Permenkes
terkonjugasi [15]. RI No. 3 Tahun 2017 tentang
Hasil yang diperoleh dari Perubahan Penggolongan
kuantifikasi kadar flurazepam dalam Psikotropika, Flurazepam
sampel urin yaitu sebesar 297,548 digolongkan ke dalam Psikotropika
µg/mL berdasarkan konsentrasi rata- Golongan IV, yang mana psikotropika
rata sampel pada Tabel 4. Apabila Golongan IV yaitu golongan
dibandingkan dengan penelitian yang psikotropika yang lazim digunakan
dilakukan oleh De Silva et al. ( 1974) dalam terapi yang memiliki potensi
diperoleh bahwa kadar flurazepam ringan mengakibatkan
dalam bentuk metabolitnya sebagai ketergantungan. Flurazepam dalam
N-1-hydroxyethyl-flurazepam dalam pengobatan harus diperoleh dari resep
bentuk bebas (tidak terkonjugasi) dokter dan penggunaannya harus
selalu dibawah pengawasan tenaga
13
kesehatan. Penyalahgunaan obat flurazepam dengan kadar 297,5480

golongan psikotropika dapat µg/mL berada jauh di atas dosis letal
mengakibatkan ketergantungan flurazepam yaitu 50-200 µg/mL,
apabila dalam penggunaannya tidak sehingga penggunaannya dapat
berada dalam pengawasan tenaga diketahui sebagai penyalahgunaan
kesehatan yang mempunyai keahlian. flurazepam yang bahkan dapat
Pada pasal 62 UU RI No. 5 Tahun menimbulkan kematian karena kadar
1997 disebutkan bahwa seseorang flurazepam yang ditemukan dalam
yang memiliki atau membawa sampel urin jauh di atas dosis letal
psikotropika secara ilegal dapat flurazepam.
dipidana penjara paling lama lima
tahun dan pidana denda paling banyak DAFTAR PUSTAKA
seratus juta rupiah. Selain itu, pada [1] Katzung BG. Basic & clinical
pasal 37 disebutkan bahwa bagi pharmacology. 10th ed. New
penyalah guna psikotropika tersebut York: McGraw-Hill Companies;
wajib menjalani rehabilitasi medis 2006.
dan rehabilitasi sosial [17]. [2] Badan Narkotika Nasional.
Pedoman pemeriksaan
laboratorium narkotika,
KESIMPULAN psikotropika dan obat berbahaya.
Uji skrining yang dilakukan Jakarta: Badan Narkotika
adalah menggunakan strip test. Nasional; 2008.
Dimana hasil positif yang diperoleh [3] Wirasuta, IMAG. Analisis
adalah pada sampel urin positif toksikologi forensik dan
mengandung senyawa golongan interpretasi temuan analisis.
Benzodiazepin. Berdasarkan Indonesian Journal of Legal and
perhitungan hRfc standar yang Forensic Sciences. 2008; 1 (1):
digunakan untuk masing-masing 47–55.
sistem fase gerak diperoleh bahwa uji [4] Ali KT, Susanti NMP, Wirasuta
konfirmasi dengan nilai hRfc pada IMAG. Validasi metode uji
dua sistem fase gerak yakni TE dan konfirmasi senyawa golongan
TA terkonfirmasi senyawa golongan benzodiazepin dengan HPLC-
Benzodiazepine yakni Flurazepam DAD. Jurnal Farmasi Udayana.
pada kedua sistem tersebut, yang 2013; 2 (1): 1-16.
mana tingkat korelasi (kemiripan) [5] Gandjar IG dan Rohman A.
dari spektrum sampel dan standar Kimia farmasi analisis.
Flurazepam yang paling tinggi Yogyakarta: Pustaka Pelajar;
dengan nilai lebih besar dari 0,9. 2016.
Analit yang diperoleh adalah
14
[6] Rohman A. Kromatografi untuk London: Pharmaceutical Press;

analisis obat. Yogyakarta: Graha 2011.
Ilmu; 2009. [13] Depkes RI. Farmakope
th
[7] Wulandari L., Retnaningtyas Y., Indonesia. 5 ed. Jakarta:
dan Mustafidah D. Departemen Kesehatan Republik
Pengembangan dan validasi Indonesia; 2014.
metode kromatografi lapis tipis [14] Sastrohamidjojo H.
densitometri untuk penetapan Kromatografi. 2nd Ed.
kadar teofilin dan efedrin Yogyakarta: Liberty; 1991.
hidroklorida secara simultan pada [15] Aderjan R. and Mattern R. Eine
sediaan tablet. JKTI. 2013; 15 todlich verlaufene
(1): 15-21. monointoxikation mit flurazepam
[8] Shaafie IA, Sreedharan J, (dalmadorm). probleme bei der
Muttappalymyalil J, Freeg toxicologischen beurteilung.
MAHA and Mathew E. Effect of Arch. Toxicol. 1979; 43: 69-75.
urinary pH and specific gravity in [16] De Silva JAF, Puglisi CV,
urothialisis. Journal of Gulf Brooks MA, and Hackman MR.
Medical. 2012; 1:26-31. Determination of Flurazepam
[9] Suwarso. Manajemen laboratoris (Dalmane®) and Its Major
penyalahgunaan obat dan Metabolites in Blood by
komplikasinya. Yogyakarta: Electron-Capture Gas-Liquid
Bagian Patologi Klinik Fakultas Chromatography and In Urine by
Kedokteran Universitas Gajah Differential Pulse Polarography.
Mada; 2002. Journal of Chromatography.
[10] SAMHSA. Tobacco use 1974; 99: 461-483.
cessation during substance abuse [17] Presiden RI. Undang-Undang
treatment counseling. 2004; 10 Republik Indonesia Nomor 5
(2). [Dikutip 2019 September Tahun 1997 tentang Psikotropika.
15]. Tersedia pada: Jakarta: Presiden Republik
www.samhsa.gov Indonesia; 1997.
[11] Basset J. Buku ajar Vogel kimia
analisis kuantitatif anorganik.
Jakarta: Penerbit Buku
Kedokteran EGC; 1994.
[12] Moffat AC, Osselton MD, and
Widdop B. Clarke’s analysis of
drugs and poisons in
pharmaceuticals, body fluids, and
postmortem material. 4th ed.
15

Blind Test Screening and Determination of Benzodiazepine Using Strip Test and Tlc-Spectrophotodensitometry

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Blind Test Screening and Determination of Benzodiazepine Using Strip Test and Tlc-Spectrophotodensitometry

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Indonesian Journal of Legal and Forensic Sciences 2020; 10 (1) : 1 – 15 e-ISSN 2657-0815, p-ISSN 1979-1763

http://ojs.unud.ac.id/index.php/ijlfs Asosiasi Ilmu Forensik Indonesia

BLIND TEST SCREENING AND DETERMINATION OF

I Putu Purba Teguh Grantica1, Made Dewi Widyastuti1,

Serta bahan yang digunakan Hasil positif ditunjukkan dengan

Dimasukkan kedalam vial dan diberi dengan masing-masing ukuran 10 x

HCl, Clordiazepoxid, Diazepam, dielusi dalam chamber yang telah

1500 µg/µL; 2000 µg/µL; 2500 psikotropika di masyarakat. Pada

dikatakan pula dengan proses flurazepam dan bromazepam,

pemanasan berlebih. Hasil yang meminimalisir kesalahan hasil

senyawa dengan error window sistem Hasil yang diperoleh dari

Gambar 2. Spektrum Flurazepam Gambar 3. Spektrum Flurazepam

dipilih karena menghasilkan 400 ng - 5000 ng. Pemilihan

Tabel 3. Hasil AUC Determinasi Flurazepam

Berdasarkan dari kurva kalibrasi

kesehatan. Penyalahgunaan obat flurazepam dengan kadar 297,5480

[6] Rohman A. Kromatografi untuk London: Pharmaceutical Press;

Anda mungkin juga menyukai