BAB 1

PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Begitu banyak mikroorganisme dalam hidup kita yang tanpa kita sadari selalu
ada di lingkungan kita. Salah satu mikroorganisme yang selalu ada disekitar kita
adalah bakteri. Bakteri memiliki bentuk dan jenis yang beragam, begitu pula
dengan habitat atau tempat hidupnya. Ada bakteri yang bisa hidup di air, tanah,
udara, dan ada pula yang hidup dalam makanan kita. Bakteri-bakteri tersebut bisa
saja menguntungkan, tapi banyak pula yang merugikan.(kuswiyanto,2014)
Teknik pewarnaan pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu
pengecatan sederhana, negatif, diferensial dan struktural. Pemberian warna pada
bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu
pewarna pada lapisan tipis atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan
pewarnaan sederhana prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara
sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel
sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan
ini adalah pengecatan endospora,flagella dan pengecatan kapsul(Berty.2015).
Sistem pencernaan adalah suatu sistem menerima makanan, mencernanya
untuk dijadikan energi dan nutrien. Secara umum, sistem pencernaan bisa
digambarkan sebagai struktur yang memanjang dan berkelok-kelok, dimana
makanan dimasukan melalui mulut serta mengeluarkan sisa zat yang tidak
diperlukan oleh tubuh melalui fases. Contoh bakteri yang terdapat pada feses
adalah bakteri aerob antara lain S. anhaemolyticus, S. epidermidis, S. aureus, E.
coli, Klebsiella sp, E. agglomerans. Bakteri anaerob antara lain C. difficile, B.
fragilis, Bifidobacterium, Lactobacillus sp.(Saefuddin, 2015)

B. Tujuan Praktikum
Untuk mengetahui cara Isolasi dan mengidentifikasi bakteri infeksi pada
system saluran pencernaan (Tinja).
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri merupakan organisme uniseluler, prokariotik (nucleoid), tidak
berklorofil, saprofit atau parasite, peembelahan biner, termasuk Protista. Protista
dibagi 2 macam yaitu Prokaryot terdiri atas bakteri, alga biru hijau dan Eukaryot
yang terdiri atas jamur, ganggang, lumut dan Protozoa. Perbedaan mendasar dari
kedua sel tersebut antara lain organismenya termasuk bakteria dan Sianobakteria,
ukuran sel 1- 10 mikron, organelnya hanya ada beberapa bahkan hampir tidak ada,
DNA Prokaryot bersirkuler dalam sitoplasma, RNA dan proteinnya disintesis
dalam sitoplasma. Sedangkan pada Eukaryot organismenya termasuk fungi,
hewan dan manusia, ukuran sel 5- 100 mikron, organelnya terdapat inti,
mitokondria dan kloroplast, DNA terkemas dalam inti, RNA dalam inti dan
protein dalam sitoplasma (Hartati, 2012).
Bentuk sel bakteri ada 3 macam, yaitu bulat (kokus), batang (basil) dan
Spriral (lengkung atau koma). Bakteri dapat membentuk kumpulan sel atau
susunan sel yaitu pada bentuk kokus, dapat berupa diplokokus (dua- dua),
tetrokokus (empat- empat) sarkina (8 atau kubus), streptokokus (seperti rantai)
dan staphylokokus (bergerombol seperti buah anggur). Pada bentuk batang dapat
berupa streptobasil (berderet) dan diplobasil (dua- dua). Bakteri umumnya
monomorfik, namun karena faktor lingkungan maka dapat berbentuk pleomorfik
contohnya, Rhizobium dan Corynebacterium., Bakteri gram positif adalah bakteri
yang mempertahankan zat warna metil unggu sewaktu proses pewarnaan gram.
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan gram. (Harti, 2015)
Teknik pewarnaan pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam
yaitu pengecatan sederhana, negatif, diferensial dan struktural. Pemberian warna
pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal
suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan
pewarnaan sederhana prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan diantara
sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel
sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan
ini adalah pengecatan endospora,flagella dan pengecatan kapsul(Berty.2015).
Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri antara lain adalah pH,
temperatur dan kebutuhan akan oksigen. Dalam pertumbuhannya,
mikroorganisme memiliki pH optimum, yaitu pH dimana mereka tumbuh paling
baik. Berdasarkan pH optimum tersebut tersebut, terdapat mikroorganisme yang
dapat hidup pada pH rendah. Mikroorganisme ini dapat hidup pada PH yang
bahkan lebih rendah dari pH 2, yang disebut asidiphiles. Adapula mikroorganisme
yag dapat hidup pada pH yang sangat tinggi, bahkan diatas PH 10, dan
mikroorganisme ini disebut dengan alkaliphes (Irianto, 2013).
Sistem pencernaan adalah suatu sistem menerima makanan, mencernanya
untuk dijadikan energi dan nutrien. Secara umum, sistem pencernaan bisa
digambarkan sebagai struktur yang memanjang dan berkelok-kelok, dimana
makanan dimasukan melalui mulut serta mengeluarkan sisa zat yang tidak
diperlukan oleh tubuh melalui fases .(Saefuddin, 2015)
Gangguan pada sistem pencernaan dapat terjadi jika salah satu atau lebih
proses pencernaan tidak berjalan dengan baik. Sistem pencernaan pada anak
sangat berbeda dengan orang dewasa. Anak masih sangat rentan terhadap masalah
pencernaan. Sebenarnya sistem pencernaan pada anak dan orang dewasa adalah
sama. Namun demikian, anak-anak masih belum optimal dalam memaksimalkan
fungsi dari masing-masing organ pada sistem pencernaannya. Pengeraan tinja atau
feses dapat menyebabkan meningkatnya waktu dan menurunnya frekuensi buang
air besar antara pengeluarannya atau pembuangannya disebut dengan konstipasi
atau sembelit. Dan sebaliknya, bila pengerasan tinja atau feses terganggu,
menyebabkan menurunnya waktu dan meningkatnya frekuensi buang air besar
disebut dengan diare atau mencret (Saefuddin, 2015)
Contoh bakteri yang terdapat pada feses adalah bakteri aerob antara lain S.
anhaemolyticus, S. epidermidis, S. aureus, E. coli, Klebsiella sp, E. agglomerans.
Bakteri anaerob antara lain C. difficile, B. fragilis, Bifidobacterium, Lactobacillus
sp (Saefuddin, 2015
 BAB III
METODE PRAKTIKUM
A. Pelaksanaan Praktikum
Waktu : Senin, 24 September 2018 s/d Jumat, 29 September 2018
Tempat : Laboratorium Mikrobiologi DIV Analis Kesehatan STIKes Mega
Rezky Makassar
B. Alat dan Bahan
1. Alat
a. Mikroskop
b. Pipet Tetes
c. Beaker Gelas
d. Objek Gelas
e. Bunsen
f. Korek Api
g. Ose Bulat & Ose Lurus
h. Cawan Petri
i. Tabung Reaksi
j. Inkubator
k. Autoklaf
l. Rak Tabung
m. Neraca Ohaus
n. Kulkas
2. Bahan
a. Sampel tinja (cair)
b. NaCl 0,9%
c. Lugol
d. Gentian Violet
e. Alkohol 96%
f. Air Fuchsin
g. Oil Emercy
h. Tissue
 i. Media APW (Alkali Pepton Agar)
j. Media TCBSA (Tiosulfat Citrat Bilesalt Agar)
k. Media LB (Lactose Broth)
l. Media EC BROTH (Esherichia Coli Broth)
m. Media SSA (Salmonella Shigella Agar)
n. Media MCA (Mac Conkey Agar)
o. Media BAP (Blood Agar Plate)
p. Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
q. Media MIO (Motility Indol Ornitin)
r. Media MR- VP (Metyl Red - Vogesh Paskuer)
s. Media SCA (Simon Citrat Agar)
t. Media LIA (Lysin Iron Agar)
u. Media Urea
v. Media Endo Agar
w. Reagen MR
x. Larutan KOH 40%
y. Larutan α - naphtol 5% 0,6 ml
z. Reagen Kovash
C. Prinsip Kerja
1. Prinsip Isolasi Bakteri Dengan Tehnik Penggoresan
Metode gores menggunakan ose bulat dan menggoreskannya ke
permukaan medium dengan pola tertentu dengan harapan pada ujung goresan,
hanya sel- sel bakteri tunggal yang terlepas dari ose dan menempel ke
medium. Sel- sel bakteri tunggal ini akan membentuk koloni tunggal yang
kemudian dapat dipindahkan ke medium selanjutnya agar didapatkan biakan
murni.
2. Prinsip Inokulasi Bakteri
a. Inokulasi metode gores
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang
terpisah. Inokulasi digoreskan dipermukaan media agar nutrient (media
padat) dalam cawan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Diantara
 garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga
dapat tumbuh menjadi koloni
b. Inokulasi metode tusuk
Metode tusuk yaitu dengan cara menusukan ujung jarum ose yang
didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan kedalam media
3. Prinsip Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan diferensial (untuk membedakan)
bakteri- bakteri yang bersifat gram negatif atau gram positif dengan
menggunakan beberapa jenis larutan.
4. Prinsip Media MCA (Mac Conkey Agar)
Persenyawaan utama dalam media ini adalah laktosa, garam empedu, dan
merah netral sebagai indikator warna. Media ini akan menghambat
pertumbuhan bakteri gram positif dengan adanya garam empedu yang akan
membentuk Kristal violet. Bakteri gram negatif yang tumbuh dapat dibedakan
dalam kemapuannya memfermentasikan laktosa.
5. Prinsip Media BAP (Blood Agar Plate)
Merupakan media diferensial untuk megklasifikasikan suatu kelompok
bakteri hemolitik dan nonhemolitik yaitu berdasarkan kemampuan mereka
untuk melisiskan sel- sel darah merah.
6. Prinsip Media APW (Alkali Pepton Water)
Alkalin pepton water adalah media penyubur ini digunakan untuk
menumbuhkan bakteri Vibrio Sp, memiliki pH (8,5-9,5). Untuk mengetahui
daya hambat bakteri Vibrio Sp. MeDIA APW ditambah dengan tawas dengan
konsentrasinya 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 4%, 6%, 8%, dan 10. Alkaline pepton
water yang sudah ditanami bakteri Vibrio Sp, diinkubasi pada suhu 37 oC
selama 24 jam.
7. Prinsip Media LB (Lactosa Broth)
Lactosa broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran
koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-
enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi
laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan
 nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber
karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan
dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform. Lactose
broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5%
laktosa.
8. Prinsip Media ECB (Escherichia Coli Broth)
Escherichia Coli Broth adalah media selektif untuk diferensiasi faecal
coliform dan tes konfirmasi untuk Escherichia dari sampel makanan atau
lingkungan. Formulasi termasuk kaldu laktosa dan garam empedu buffer.
Kehadiran garam empedu menghambat pertumbuhan pembentuk spora dan
enterococci, tetapi memungkinkan pertumbuhan E.coli dan coliform.
9. Prinsip Media TCBSA (Tiosulfat Citrat Bile Salt Agar)
TCBSA (Tiosulfat Citrat Bile Salt Agar) adalah medium selektif yang
digunakan untuk isolasi spesies vibrio dari specimen berak ( stool) yang
mengaduk bakteri campuran. Agar TCBS juga membedakan produksi
karakteristik koloni dari spesies vibrio. Vibrio spp tumbuh kerdil pada media
yang dirancang untuk isolasi Salmonella dan Shigella dengan menghasilkan
koloni tak berwarna pada MCA. Agar TCBS mengandung Na. sitrat, Na.
tiosulfat, dan ox-gall ( 10% larutan yang bersama-sama menghambat
pertumbuhan beberapa bakteri gram-positif kokus dan gram – negative batang
yang normal ada dalam feses.
10. Prinsip Media Endo Agar
Media Endo Agar adalah media media selektif dan media diferensial yang
digunakan untuk mengisolasi bakteri gram negatif batang berdasarkan
kemampuan bakteri memfermentasi laktosa atau tidak. Media ini pada
awalnya dibuat untuk mengisolasi bakteri batang penyebab tifus (typhoid)
kemudian berkembang menjadi media diferensial terutama untuk konfirmasi
pemeriksaan bakteri coliform.
11. Prinsip Media SSA (Salmonella Sigella Agar)
SSA(Salmonella Sigella Agar) digunakan untuk menyeleksi salmonella
dan beberapa strains shigella dari specimen tinja (stool). SSA juga
 membedakan bakteri yang menghasilkan koloni yang karakteristik pada
medium. SSA mengandung garam empedu, Na-sitrat, dan brilliant green yang
menghambat pertumbuhan gram (+) dan beberapa gram (-) LF normal yang
ada di tinja. Laktosa merupakan sumber karbohidrat , sedangkan indicator
yang dipakai adalah neutral red. Jika bakteri tumbuh dan memefermentasi
laktosa maka akan menghasilkan asam dan mengubah indikator menjadi pink-
merah. Na-tiosulfit sebagai sumber sulfur untuk produk H2S. jika H2S
diproduksi maka akan bereaksi dengan FeCl3 yang terdapat dalam medium
12. Prisnip Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Media TSIA mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa, laktosa, dan
sukrosa, media ini digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme
dalam memfermentasikan gula. Media TSIA diinokulasikan dengan
menusukkan ose sedalam ¾ medium lalu menggoreskannya pada slunt media.
13. Prinsip Media MIO (Motility Indol Ornitin)
Merupakan media untuk mengidentifikasi pergerakan atau motility, indol
atau adanya cincin merah setelah penambahan reagen Kovash, serta Ornitin
untuk mengetahui perubahan warna.
14. Prinsip Media MR (Metil Red)
Menentukan adanya fermentasi asam campuran (Metilin Glikon). Hasil
negatif ditandai dengan tidak terjadinya perubahan warna media menjadi
merah setelah ditambah reagen MR , sedangkan hasil positif ditandai dengan
terjadinya warna merah setelah ditambah reagen MR.
15. Prinsip Media VP (Voges Proskauer)
Mengetahui pembentukan asetil metil karbonil (aseton) dari hasil
fermentasi glukosa. Hasil positif ditandai dengan terjadi perubahan warna
media menjadi merah setelah ditambahkan alpha naftol dan KOH 40% artinya
hasil akhir fermentasi bakteri adalah asetil metil karbonil (aseton).
16. Prinsip Media SCA (Simon’s Citrat Agar)
Apabila bakteri menggunakan sitrat sebagai sumber karbon maka media
akan berubah menjadi basa dan berubah warna menjadi biru.
17. Prinsip Media LIA (Lisin Iron Agar)
 Melihat kemampuan miroorganisme dalam mendekarboksilasi lisin
menjadi amain kadaverin yang bersifat basa.
18. Prinsip Media Urea
Mengetahui apakah bakteri mempunyai enzim urease yang dapat
menguraikan urea menjadi amoniak dan CO2. Urea berisi indikator phenol red,
bila urea dihidrolisiskan NH4+ terakumulasi pada media biakan dan
menyebabkan pH menjadi basa yang ditandai dengan perubahan warna.

C. Cara Kerja
1. pengolahan sampel
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dipindahkan sampel feses cair kedalam gelas kimia
2. Isolasi sampel ke media APW
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dipipet sampel sebnyak 2 ml
c. Dimasukkan sampel yang telah dipipet ke dalam media APW
d. Diinkubasi selama 1 X 24 jam dengan suhu 37ºC
3. Isolasi sampel ke media LB
a.Disiapkan alat dan bahan
b. Dipipet sampel sebnyak 2 ml
c.Dimasukkan sampel yang telah dipipet ke dalam media LB
d. Diinkubasi selama 1 X 24 jam dengan suhu 37ºC
4. Isolasi sampel ke media EC. Broth
a.Disiapkan alat dan bahan
b. Dipipet sampel sebnyak 2 ml
c.Dimasukkan sampel yang telah dipipet ke dalam media EC. Broth
d. Diinkubasi selama 1 X 24 jam dengan suhu 37ºC
e.Diamati pertumbuhan bakteri
5. Inokulasi sampel dari media APW ke Media TCBSA

a. Disiapkan alat dan bahan

b. Dikeluarkan media APW dari incubator, diamkan beberapa saat.
 c. Difiksasi ose bulat dan mulut cawan petri pada api bunsen sebelum
dan sesudah inkulasi
d. Diambil koloni bakteri yang tumbuh pada media APW dengan
menggunakan ose bulat, lalu inokulasi ke media TCBSA
e. Diinkubasi media TCBSA pada inkubator selama 1×24 jam dengan
suhu 37ºC
f. Diamati koloni bakteri yang terdapat pada media TCBSA
Interpretasi hasil : Terbentuk koloni berwarna kuning
6. Inokulasi sampel media LB ke media Endo Agar
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dikeluarkan media LB dari incubator, diamkan beberapa saat.
c. Difiksasi ose bulat dan mulut cawan petri pada api bunsen sebelum
dan sesudah inkulasi
d. Diambil koloni bakteri yang tumbuh pada media LB dengan
menggunakan ose bulat, lalu inokulasi ke media Endo Agar dengan
menggunakan teknik radian
e. Diinkubasi media MCA pada inkubator selama 1×24 jam dengan suhu
37ºC
f. Diamati koloni bakteri yang terdapat pada media Endo Agar
7. Inokulasi sampel media LB ke media MCA (Mac Concey Agar)
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dikeluarkan media LB dari incubator, diamkan beberapa saat.
c. Difiksasi ose bulat dan mulut cawan petri pada api bunsen sebelum
dan sesudah inkulasi
d. Diambil koloni bakteri yang tumbuh pada media LB dengan
menggunakan ose bulat, lalu inokulasi ke media MCA dengan
menggunakan teknik radian
e. Diinkubasi media MCA pada inkubator selama 1×24 jam dengan suhu
37ºC
f. Diamati koloni yang tumbuh pada media MCA
8. Inokulasi sampel media LB ke media SSA
 a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dikeluarkan media LB dari incubator, diamkan beberapa saat.
c. Difiksasi ose bulat dan mulut cawan petri pada api bunsen sebelum
dan sesudah inkulasi
d. Diambil koloni bakteri yang tumbuh pada media LB dengan
menggunakan ose bulat, lalu inokulasi ke media SSA dengan
menggunakan teknik radian
e. Diinkubasi media SSA pada inkubator selama 1×24 jam dengan suhu
37ºC
f. Diamati koloni yang tumbuh pada media SSA
9. Pewarnaan gram
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Dibersihkan objeck glass menggunakan kapas alkohol kemudian
difiksasi
c. Diambil biakan bakteri pada media SSA dan buat suspense I atas objek
glass
d. Diambil biakan bakteri pada media Endo Agar dan buat suspense di
atas objeck glass
e. Digenangi dengan gentian volet 1-2 tetes diamkan selama 3 menit
f. Dicuci dengan air mengalir
g. Digenangi dengan larutan lugol 1-2 tetes diamkan selama 1 menit
h. Dicuci dengan air mengalir
i. Dilunturkan menggunakan alcohol 96% sampai warna dasarnya luntur
j. Ditetesi dengan air mengalir
k. Digenangi dengan air fuchsin 1-2 tetes diamkan selama 1 menit
l. Dicuci dengan air mengalir
m. Dikeringkan dan diamati dibawah mikroskop
10. Inokulasi sampel media LB ke media TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Difiksasi ose lurus dan mulut tabung pada api bunsen sebelum dan
sesudah melakukan inokulasi dari media MCA
 c. Diambil satu mata ose koloni bakteri dari sampel sehat dari goresan
koloni media LB pada media MCA menggunakan ose lurus
d. Ditusuk lurus pada media TSIA kemudian buat goresan pada daerah
yang miring
e. Diinkubasi media TSIA pada incubator selama 1×24 jam dengan suhu
37ºC
f. Diamati koloni bakteri yang terdapat pada media TSIA
Intepretasi Hasil :
1 Acid-acid : slunt (kuning) – butt (kuning)
2 Alkali-alkali : slunt (merah) – butt (merah)
3 Alkali-acid : slunt (merah) – butt (kuning)
4 Positif H2S : jika daerah tusukan berwarna hitam
5 Positif gas : jika media terangkat keatas
11. Inokulasi ke media MIO (Motility, Indol, Ornithin)
a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
b. Difiksasi ose lurus dan mulut tabung sebelum dan sesudah
melakukan inokulasi dari media TSIA
c. Diambil satu mata ose koloni bakteri pada media TSIA
menggunakan ose lurus
d. Dibuat goresan pada media MIO dengan cara menusuk biakan
kedalam media
e. Dinkubasi media MIO pada inkubator selama 1×24 jam dengan suhu
37ºC
f. Diamati koloni bakteri yang terbentuk pada media MIO
 Motility : perhatikan perubahan warna yang terjadi pada tempat
tusukan, jika keruh dan melebar, berarti motility positif (+)
 Indol : tambahkan reagen kovash 5-10 tetes dan lihat perubahan
yang terjadi, jika jika terbentuk cincin berwarna merah berarti indole
positif (+)
 Ornithine: perhatikan perubahan warna yang terjadi dari warna ungu
menjadi kuning berarti ornithine (+).
12. MR-VP (Metyl Red- Vogesh Paskuer)
a. Disiapkan alat dan bahan
b. Diambil biakan yang tumbuh dari media TSIA bakteri denga ose lurus
steril
c. Diinokulasi kedalam media MR-VP
d. Dihomogenkan
e. Diinkubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C
f. Diamati perubahan warna
g. Dilanjutkan dengan uji Biokimia
h. Pada media MR, ditambahkan reagen MR sebanyak 5-10 tetes lalu
dihomogenkan, kemudian diamati perubahan warna
i. Pada media VP, ditambahkan reagen α - naphtol 5% 0,6 ml 5 tetes lalu
ditambahkan lagi reagen KOH 40% 0,2 ml 5 tetes lalu dihomogenkan
j. Diamati perubahan warna
Intepretasi Hasil :
MR : Positif jika terjadi perubahan warna dari Kuning – Merah
VP : Positif jika terjadi perubahan warna dari Kuning – Merah
13. Inokulasi ke media SCA (Simmons Citrate Agar)
a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
b. Difiksasi ose lurus dan mulut tabung sebelum dan sesudah melakukan
inokulasi dari media TSIA
c. Diambil satu mata ose koloni bakteri pada media TSIA menggunakan
ose lurus
d. Dibuat goresan pada media SCA dengan cara menusuk biakan kedalam
media dan buat goresan pada lereng media
e. Dinkubasi media SCA pada incubator selama 1×24 jam dengan suhu
37ºC
f. Diamati perubahan yang terjadi,jika terjadi perubahan warna pada
media SCA menjadi biru menandakan hasil positif
14. Inokulasi ke media LIA (Lysin Iron Agar)
a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
 b. Difiksasi ose lurus dan mulut tabung sebelum dan sesudah melakukan
inokulasi dari media TSIA
c. Diambil satu mata ose koloni bakteri pada media TSIA menggunakan
ose lurus
d. Dibuat goresan pada media LIA dengan cara menusuk biakan kedalam
media dan buat goresan pada lereng media
e. Dinkubasi media LIA pada inkubator selama 1×24 jam dengan suhu
37ºC
f. Diamati perubahan yang terjadi,jika terjadi perubahan warna pada
media LIA menjadi ungu tua menandakan hasil positif
15. Inokulasi ke media Urea
a. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
b. Difiksasi ose lurus dan mulut tabung sebelum dan sesudah melakukan
inokulasi dari media TSIA
c. Diambil satu mata ose koloni bakteri pada media TSIA menggunakan
ose lurus
d. Dibuat goresan pada media Urea dengan cara menusuk biakan
kedalam media dan buat goresan pada lereng media
e. Dinkubasi media Urea pada incubator selama 1×24 jam dengan suhu
37ºC
f. Diamati perubahan yang terjadi, jika terjadi perubahan warna pada
media Urea dari warna jingga ke merah unggu menandakan hasil
positif.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
1. Tabel Pengamatan
a) Tabel 1. Hasil pengamatan pada media APW, EC BROTH dan LB
yang telah diinkubasi:
Media Warna Keterangan
Media APW Keruh Positif
Media EC Broth Keruh Positif

Media LB Keruh Positif

b) Tabel 2. Hasil pengamatan pada media TCBSA, MCA, Endo Agar,

dan SSA

Ciri pertumbuhan
bakteri
Media Pewarnaan gram

Media - -
TCBSA

Media - -
MCA

Media Koloni bakteri (-) Basil nonfermenter

Endo Agar merah metalik

Media SSA Koloni bakteri (-) Basil fermenter

merah

c) Tabel 4. Hasil pengamatan pada media TSIA

 Ciri- ciri pertumbuhan pada media TSIA
No Media
Slunt Butt Gas H2S

1 Media Endo agar Acid Acid (+) (-)

2 SSA Acid Acid (-) (-)

d) Tabel 5. Hasil pengamatan Media MIO, MR-VP, SCA, LIA ,UREA

Sampel MIO MR VP SCA LIA UREA Keterangan

M I O

Endo agar + + - + - - + - Escherichia

coli

SSA + + - + - - + - Salmonella
sp

B. Pembahasan
 Pada praktikum isolasi dan identifikasi bakteri pada feses kali ini, sampel yang
digunakan yaitu feses cair yang diambil dari anak- anak yang lagi menderita diare.
Hal yang paling pertama dilakukan pada identifikasi adalah isolasi sampel ke
media APW (Alkali Pepton Water), LB (Lactose Broth) dan ECB (Escherichia
Coli Broth). Sampel feses cair dipipet sebanyak 2 ml lalu dimasukkan ke masing-
masing media (APW, LB dan ECB).
Media APW (Alkali Pepton Water) adalah media yang berfungsi sebagai
sumber nutrisi yang diperlukan bakteri NaCO3 bersifat basa yang mengatur pH
media 8,5-9,5, dan berperan dalam menjaga tekanan osmotic media,
kandungannya adalah : pepton, NaCl, dan aquadest.
Media LB (Lactosa Broth) Lactose Broth digunakan sebagai media untuk
mendeteksi kehadiran koliform dalam air, dan produk susu, sebagai kaldu 1
memperkaya (Pre-enrichemnt broth) untuk salmonellae dan dalam mempelajari
fermentasi laktosa oleh bakeri pada umumnya. Pepton dan ekstra beef
menyediakan nutrient esensial unuk metabolisme bakteri. Laktosa menyediakan
sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform.
Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform.
Lactose Broth dibuat dengan komposisi 0,3%. Ekstrak beef, 0,5% pepton, dan 0,5
laktosa.
Media Ec Broth adalah media yang berfungsi untuk diferensiasi fekal
kliform dan uji konfirmasi untuk E. coli dari sampel makanan dan sampel
lingkungan. Bila media berubah dari warna kuning jernih menjadi kuning keruh
dan terdapat gas di dalam tabung durham menunjukan hasil positif terhadap
bakteri terutama E. coli. Kandungan dari media ini adalah : trypton 20,0g/l,
lactose 5,0g/l, bile salts 31,5g/l, di-potassium phosphate1,5/gl, sodium chloride
5,0g/l dan aquadest.
Pada hari kedua dilakukan proses pengamatan pada media APW, LB, dan
Ec Broth yang telah diinkubasi dan hasil dari media APW adalah positif berwarna
keruh yang artinya bakteri tumbuh pada media ini, hasil dari media LB adalah
positif berwarna keruh yang artinya bakteri tumbuh pada media ini, dan hasil dari
media Ec Broth adalah positif berwarna keruh yang artinya bakteri juga tumbuh
pada media ini. Setelah melakukan pengamatan dilakukan inokulasi ke media
TCBSA dari media APW menggunakan ose bulat. TCBSA adalah medium
selektif yang digunakan untuk isolasi spesies Vibrio dari specimen feses (stoll)
yang mengandung bakteri campuran. TCBSA juga membedakan produksi
karakteristik koloni dari spesies vibrio. TCBSA mengandung NA, Sitrat,
Tiosulfat, dan ox-gall (10% larutan) yang sama- sama menghambat pertumbuhan
bebrapa bakteri gram positif coccus dan gram negative yang normal. Dan
dilakukan inokulasi dari media LB ke media MCA, Endo Agar, dan SSA
menggunakan ose bulat, setelah itu diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37ºC.
dan pada media EC. Broth tidak diinokulasi kemedia baru karena bakteri E. Coli
merupakan flora normal sehingga positif ditemukan E.Coli difeses. Media EC.
Broth hanya untuk melihat positif atau negatifnya pertumbuhan bakteri E. Coli
pada media. Inokulasi merupakan proses pemindahan bakteri pada media lama
kemudian dipindahkan kemedia yang baru.
Pada hari ke tiga dilakukan proses pengamatan pada media TCBSA, MCA,
Endo Agar, dan SSA. Hasil dari media TCBSA adalah negatif yang artinya feses
tidak mengandung bakteri Vibrio, hasil dari media MCA adalah bentuk bakteri
bulat menonjol, berwarna pink, dan koloni menyebar, hasil dari media Endo Agar
adalah bentuk bakteri bulat, menonjol berwarna merah metalic, koloni tunggal dan
hasil dari media SSA adalah positif. Media MCA (Mac Conkey Agar) adalah
medium padat selektif untuk isolasi, identifikasi, dan kultur enterobacter dari urin,
air limbah, air minum, kotoran, dan makanan. Tujuan media MCA untuk melihat
bakteri gram negatif. Kandungannya adalah : pepton 20,0 gr, lactose 20,0gr, bile
salt 5,0gr, sodium chloride 5,0gr dan neutral red 0,075 gr dan agar 12,0 gr. Media
Endo Agar adalah media selektif dan media diferensial yang digunakan untuk
mengisolasi bakteri batang gram negatif berdasarkan kemampuan bakteri
memfermentasi laktosa atau tidak. Kandungannya adalah : pepton 10 gr, lactose
10 gr, Di-potassium phosphate 3,5 gr, sodium sulphite 2,5 gr, agar 10 gr dan
distilled water 1 liter. Media SSA adalah media yang digunakan untuk menyeleksi
salmonella dan beberapa strains shigella dari specimen tinja (stoll). SSA juga
membedakan bakteri yang menghasilkan koloni yang karakteristik pada medium.
SSA mengandung garam empedu, Na- sitrat, dan brilliant green yang
menghambat pertumbuhan gram (+) da beberapa gram (-) LF normal yang ada
dalam tinja.
Setelah dilakukan pengamatan, selanjutnya dilakukan pewarnaan gram
dari media LB dan media Endo Agar yang bertujuan untuk melihat kelompok
jenis bakteri gram positif dan negatif. namun sebelum melakukan pewarnaan,
objek gelas terlebih dahulu harus dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70%.
Alkohol 70% mengandung mengandung 70% etil alkohol (CH- 3CH2OH) dan
30% air. Etil alkohol membunuh bakteri melalui 2 cara, yakni denaturasi protein
dan pelarutan membran lemak. Setelah itu diambil biakan bakteri pada cawan
petri lalu dibuat suspensi pada objek gelas kemudian difiksasi diatas nyala api
supaya bakteri lebih menempel pada objek gelas.Tapi sebelum itu, pijarkan kawat
ose bulat streil diatas api menyala dari ujung kawat ose sampai ke pangkalnya,
dan setelah dioleskan diobjek gelas kembali lakukan pemijaran dengan cara dari
pangkal kawat ose ke ujungnya. Setelah itu diteteskan larutan Gentian Violet
diatas suspensi bakteri tersebut lalu didiamkan selama 2 sampai 3 menit
kemudian bilas dengan air mengalir. Gentian Violet berfungsi sebagai zat warna
utama yang akan memberikan warna pada bakteri gram positif Setelah itu
diteteskan dengan lugol lalu didiamkan selama 1 menit kemudian bilas dengan air
mengalir. Setelah itu dilunturkan dengan alkohol 96% lalu didiamkan selama 30
detik sampai 1 menit. Alkohol 96 % berfungsi untuk meluntukan zat warna utama
yaitu Gentian Violet. Setelah itu teteskan dengan Air Fuchsin lalu didiamkan
selama 1 menit kemudian bilas dengan air mengalir. Air Fuchsin berfungsi
sebagai zat warna lawan dari zat warna utama yang akan memberikan warna pada
bakteri gram negatif. Diamati dibawah mikroskop pada perbesaran 100X dengan
tambahan 1 tetes oil emercy. Hasil pengamatan dibawah mikroskop untuk bakteri
yang berasal dari media SSA adalah bakteri gram negatif basil fermenter ditandai
dengan bakteri menyatu antara bakteri satu dengan bakteri yang lain. bakteri yang
berpisah antara satu dengan yang lain, sedangkan hasil pengamatan dibawah
mikroskop untuk bakteri yang berasal dari Endo Agar adalah bakteri gram negatif
basil non fermenter ditandai dengan bakteri yang berpisah antara satu dengan
yang lain. Hasil pengamatan dibawah mikroskop menunjukkan bakteri gram
negatif karena bakteri flora normal yang berada pada saluran pencernaan
kebanyakan berasal dari bakteri gram negatif. Setelah dilakukan pewarnaan gram,
bakteri yang terdapat pada media SSA dan Endo Agar tadi diinokulasikan ke
media TSIA(Triple Sugar Iron Agar). Media TSIA diinokulasikan dengan
menusukkan ose sedalam ¾ medium lalu menggoreskannya pada slunt media.
Lalu diikubasi selama 1X24 jam pada suhu 370C.
Pada hari keempat, dilakukan pengamatan pada media TSIA(Triple Sugar
Iron Agar) yang telah diinkubasi dengan melihat daerah slunt dan butt nya. Hasil
yang didapatkan pada media SSA adalah tusukan pada slunt berwarna
kuning(acid) dan tusukan pada butt berwarna kuning (acid) yang berarti hanya
dapat memfermentasikan ketiga jenis gula yang ada pada media TSIA yaitu
glukosa, laktosa dan sukrosa. Sedangkan pada media Endo Agar adalah tusukan
pada slunt berwarna kuning (acid) dan tusukan pada butt juga berwarna kuning
(acid) yang berarti bakteri dapat memfermentasikan ketiga jenis gula yang ada
pada media TSIA yaitu glukosa, laktosa, sukrosa. Hal tersebut ditandai dengan
terjadinya fermentasi perubahan warna pada media yang berwarna kuning. Pada
pengamatan TSIA juga didapatkan hasil positif gas ditandai dengan media yang
terangkat keatas yang berarti bakteri bisa memproduksi gas. Untuk pengamatan
H2S didapatkan hasil negatif ditandai dengan bekas tusukan pada media tidak
berubah warna menjadi hitam, yang berarti bakteri tidak dapat memfermentasikan
asam amino yang memiliki sulfur.
Setelah melakukan pengamatan dilakukan inokulasi dari media TSIA
kemedia Uji Biokimia (MIO,MR,VP, dan SCA,LIA, UREA). Untuk inokulasi
pada media MIO dilakukan dengan teknik penggoresan, media MR dan media
VP dilakukan menggunakan teknik tusuk dan homogenkan dan untuk media SCA
dilakukan teknik tusukan dan goresan pada lereng,kemudian disimpan diinkubator
selama 1×24 jam dengan suhu 37ºC.
Pada hari kelima, dilakukan pengamatan pada media MIO (Motility Indole
Ornitin), MR (Metil Red), VP (Vogesh Paskuer), SCA (Simon Citrat Agar), LIA
(Lysin Iron Agar) dan Urea yang berasal dari media MCA selanjutnya akan
dilakukan uji Biokimia. Yang pertama adalah dilakukan uji MIO (Motility Indol
Ornitin) dengan diamati Motility atau pergerakan bakteri dengan melihat
kekeruhan yang terjadi pada media, hasil yang didapatkan yaitu positif ditandai
dengan terjadi pergerakan bakteri dengan adanya kekeruhan yang terjadi pada
permukaan media dan dinding tabung. Selanjutnya adalah Indol atau terbentuknya
cincin merah setelah ditambahkan reagen Kovash sebanyak 5 tetes, hasil yang
didapatkan adalah positif dengan terbentuknya cincin merah pada media yang
menyatakan bahwa bakteri dapat menggunakan indol dari triptopan sebagai
sumber energi. Selanjutnya adalah Orntitin dengan melihat perubahan warna yang
terjadi, dan hasil yang didapatkan adalah negatif dengan tidak terjadi perubahan
warna dari warna ungu ke kuning yang berarti tidak terjadi dekarboksilasi ornitin
oleh bakteri yang melepaskan CO2 yang menyebabkan kenaikan pH pada media
menjadi asam. Yang kedua adalah uji MR (Metyl Red) setelah diinkubasi
didapatkan hasil yang positif berwarna merah. Lalu ditambahkan dengan pereaksi
MR (Metyl Red) sebanyak 5-10 tetes kemudian dihomogenkan dan memberikan
hasil yang positif ditandai dengan terjadinya perubahan warna pada media yaitu
berwarna merah yang berarti bakteri dapat memfermentasikan asam campuran
yang ada dalam media MR. Yang ketiga adalah uji VP (Vogesh Paskuer) setelah
diinkubasi didapatkan hasil yang negatif ditandai dengan tidak terjadi perubahan
warna menjadi merah. Lalu ditambahkan dengan pereaksi α- Naftol 5% 0,6 ml
dan KOH 40% 0,2 ml dan memberikan hasil yang negatif ditandai dengan
perubahan media dari yang awalnya berwarna kuning menjadi keruh. Penambahan
KOH 40% akan menimbulkan aseton yang menyebabkan perubahan warna
menjadi merah muda, dan penambahan α- Naftol 5% jika berubah menjadi merah
menandakan bahwa terjadi penumpukan 2,3 butanadiol yang merupakan turunan
karbohidrat. Yang keempat adalah SCA (Simon Sitrat Agar) dengan cara
membuat goresan pada daerah slunt dengan biakan bakteri dan menunjukkan hasil
yang didapatkan negatif karena terjadi perubahan warna dari hijau menjadi warna
biru yang berarti bakteri tidak dapat menggunakan sitrat sebagai sumber energy.
Yang kelima adalah LIA (Lysin Iron Agar) setelah diinkubasi didapatkan hasil
positif ditandai dengan terjadinya perubahan warna yang berarti bakteri mampu
mendekarboksilasi lisin menjadi amain kadaverin yang bersifat basa. Yang
keenam adalah Urea setelah diinkubasi didapatkan hasil negatif ditandai dengan
tidak terjadinya perubahan warna yang berarti bakteri tidak mempunyai enzim
urease yang dapat menguraikan urea menjadi amoniak dan CO 2. Urea berisi
indikator phenol red, bila urea dihidrolisiskan NH4+ terakumulasi pada media
biakan dan menyebabkan pH menjadi basa yang ditandai dengan perubahan
warna. Setelah dilakukan uji biokimia didapatkan bakteri Escherichia coli dan
Salmonella pada sampel feses cair (diare pada anak).
Escherichia coli adalah bakteri berbentuk batang, anaerob fakultatif dapat
melakukan fermentasi ketika tidak ada oksigen, dan bias melakukan respirasi
seluler secara aerob bila ada oksigen . Bakteri ini memfermentasikan laktosa.
Bakteri ini juga katalase positif, oksidase- negative, dan indol positif. Mereka bisa
tumbuh pada kisaran suhu 7-46ºC dan dapat tumbuh pada aktivitas air minimum
0,95. Escherichia coli dapat masuk ke dalam tubuh manusia terutama melalui
konsumen pangan yang tercemar, misalnya daging mentah, daging yang di masak
setengah matang, dan cemaran fekal pada air dan pangan. Ditemukan bakteri ini
pada sampel feses karena bakteri ini hidup dalam usus besar manusia
Salmonella adalah suatu genus bakteri enterobakteria gram-negatif
berbentuk tongkat yang menyebabkan tifoid, paratifod, dan penyakit foodborne.
Spesies-spesies Salmonella dapat bergerak bebas dan menghasilkan hidrogen
sulfida. Salmonella dinamai dari Daniel Edward Salmon, ahli patologi Amerika,
walaupun sebenarnya, rekannya Theobald Smith (yang terkenal akan hasilnya
pada anafilaksis) yang pertama kali menemukan bakterium tahun 1885 pada tubuh
babi. Habitat Inang bagi Salmonella adalah usus halus manusia dan hewan.
Makanan dan minuman terkontaminasi merupakan mekanisme transmisi kuman
Salmonella dan carrier adalah sumber infeksi. Salmonella Thipy bisa berada
dalam air, es, debu, sampah kering yang bila organisme ini masuk ke dalam
vehicle yang cocok (daging, kerang dan sebagainya) akan berkembang biak
mencapai dosis infektif. Ditemukan bakteri ini pada sampel feses karena bakteri
ini merupakan agen dari penyakit salurann pencernaan
BAB V
 KESIMPULAN

Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilaksanakan dapat disimpulkan

bahwa bakteri bakteri yang didapatkan adalah bakteri Escherichia coli dan
Salmonella sp pada sampel feses cair (diare pada anak).
 DAFTAR PUSTAKA

Kuswiyanto. 2014. Bakteriologi 1. Yogyakarta: Buku kedokteran

Berty,dkk. 2015. Pewarnaan sederhana dan cara-cara pewarnaan. Samarinda:

fakultas matematika dan ilmu pengetahuan alam.

Hartati Sri Agnes.Dra. 2012. Dasar- Dasar Mikrobiologi Kesehatan. Yogyakarta: Nuha
Medika
Harti Sri Agnes.Dra. 2015. Mikrobiologi Kesehatan. Yogyakarta : Andi Offset
CV

Irianto Koes. 2013. Mikrobiologi Medis (Medical Microbiology). Bandung :

Alfabeta CV

Saefuddin dan Rianti, 2015. Sistem Pakar Untuk Mendiagnosa Gangguan

Pencernaan Pada Anak Dengan Metode Forward Chaining.
Banten : Universitas Serang Raya